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观察长穗偃麦草(Thinopyron elongatum)体细胞染色体制片的好方法



全 文 :基金项目:本研究由黑龙江省自然科学基金(C200602)和国家自然科学基金(39870417)资助。
分子植物育种,2007,第 5卷,第 3期,第 448-450页
Molecular Plant Breeding, 2007, Vol.5, No.3, 448-450
新思路、新技术、新方法
Novel Thinking & Technology
观察长穗偃麦草(Thinopyron elongatum)体细胞染色体制片的好方法
曲敏1,2 张延明1* 李集临1 徐香玲1
1 哈尔滨师范大学生命与环境科学院生物系, 哈尔滨, 150080; 2 哈尔滨商业大学食品工程学院生物系, 哈尔滨, 150076
* 通讯作者, blueright@163.com
摘 要 观察二倍体长穗偃麦草的染色体一直是个难题,以二倍体长穗偃麦草种子 (Thinopyron elongatum
= E.elongata, 2n=14 EE)为实验材料,对实验方法进行了改进,发芽前浸种处理 24 h,将发芽时间和促芽
生长时间分别延长至 90~96 h,并对第一轮未萌发的种子进行二次萌发,使种子萌发率达到 97%以上。取
上述萌发处理后的种子进行根尖染色体制片,结果表明染色体中期分裂相多,染色体分散良好,形态特征
清晰,显然,这是一种开展长穗偃麦草细胞学研究的有效方法。
关键词 二倍体长穗偃麦, 种子萌发, 染色体制片
A Modified Method for Observing Chromosomes in the Root-tip Cell of
Thinopyron elongatum
Qu Min1,2 Zhang Yanming1* Li Jilin1 Xu Xiangling1
1 Life and Environment Science Institute, Harbin Normal University, Harbin, 150080; 2 Biology Department of Food Engineering College, Harbin University of
Commerce, Harbin, 150076
* Corresponding author, blueright@163.com
Abstract So far, there is a diffi cult problem for observing the chromosomes of diploid Thinopyron elongatum
(2n=14 EE). We developed a chromosomal preparation method of root-tip cell by improving a seed germinating
procedures, which was proved to be the easy processes in diploid Thinopyron elongatum. At first, seeds were
soaked in water at room temperature for 24 h, and then the germination time and gemma growth time extend to
90 to 96 h respectively, which would be easy to get germinating seeds up to 97% by re-treated the non-germinated
seeds. We did the experimemnts of chromosomal specimens by using the root-tip cell of germinating seeds treated
with above procedures. The primary results showed that the modifi ed process could easily get more metaphase
cells, well decentraztions and clear morphological characters of chromosome. It is obvious that the modified
menthod would be alternative approach for cytological studies in Thinopyron elongatum.
Keywords Diploid Thinopyron elongatum, Seed germination, Chromosomal preparation
长穗偃麦属偃麦草属 (Agropyron),禾本科,是
与小麦亲缘关系较近的一个近缘种属,为多年生草
本植物。由于偃麦草根系发达,抗寒、抗旱能力
强,抗多种病害能力强,具有多花大穗等优良性
状,在小麦育种和品种改良上偃麦草一直备受重
视,属于小麦的三级基因资源 (董玉琛, 2000)。通过
小麦与偃麦草的杂交,可将偃麦草的优良野生有用
基因导入小麦中,选育小麦的新类型和新品种 (韩
方普和李集临, 1995),在拓宽小麦的资源和提高小
麦的育种水平上及品质改良上有巨大的潜力 (邓志
勇和张相歧, 2004)。偃麦草的研究及小麦与偃麦草
的杂交始于 20世纪 30年代,相继育成了大量的小
麦优良品种,如八倍体小偃麦、六倍体小偃麦 (邓
志勇和张相歧, 2004)。其中偃麦草属中的长穗偃麦
草 (Thinopyron elongatum = Elytrigia elongata)在小麦
遗传改良中应用广泛,目前已经育成了一套完整的
小麦—长穗偃麦草二体附加系和代换系 (Dvořák and
Chen, 1984)应用于生产。为了更有效的全面利用偃
麦草的野生基因库,应对其遗传结构、野生种和进
化种及野生种与栽培种之间遗传和进化的关系进行
449
研究,并找到合适的细胞遗传学方法 (韩方普和李
集临, 1995)。长穗偃麦草的染色体组为 EE,研究
得较深入的有 3 个种:Th. elongatum、Th. ponticum
和 Th. intermedium。在我国原称为二倍体长穗偃麦
草 (Agropron elongatum=Elytrigia elongate, 2n=14)、
十倍体长穗偃麦草 (Elytrigia elongate, 2n=70)、中间
冰草或天蓝偃麦草 (Agropyron intermedium, Elytrigia
glacea, 2n=42) (朴真三, 1982)。二倍体长穗偃麦草
在小麦组中很特别 (Endo and Gill, 1984),由于物种
特异性,其种子萌发困难,且染色体小,染色体制
片有难度,分带效果不理想。至今关于长穗偃麦草
的染色体 C- 分带的报道甚少。本文以二倍体长穗
偃麦草 (E. elongata 2n=14 EE) 为材料,对二倍体长
偃麦草种子萌发过程进行改进,通过根尖染色体的
制片得到理想的染色体图形。
1 材料与方法
1.1 材料
二倍体长穗偃麦草种子 (Thinopyron elongatum=
E. elongata, 2n=14, EE) 由哈尔滨师范大学生命与环
境科学院生物系细胞遗传学研究室提供。
1.2 材料准备
根据小麦种子萌发条件,采用改良的种子萌发
方法,萌发过程如下:(1) 浸种:选取籽粒饱满的二
倍体长穗偃麦草种子在室温下进行浸种处理24 h。(2)
发芽:将浸种后的种子置于垫有两层滤纸的培养皿
内,整齐摆好,加水量比普通小麦种子发芽用水略
多,使两层滤纸上稍有些水,置于 23.5℃温箱中发芽,
待种子露白。(3) 低温处理:将部分露白的种子转
入 8℃条件下处理 48 h,此时种芽略有增长,胚根
开始长出。(4) 促芽生长:迅速转入 23.5℃温箱中进
行促芽生长,使种芽迅速生长。(5) 种子再发芽:将
部分未露白的种子再置于 23.5℃温箱中,促使种子
露白。(6) 低温处理与再促芽生长:依照上述步骤转
入 8℃低温处理,促芽生长,至此种子全部萌发为
止。(7) 根尖预处理:将经过上述过程的种子,剪下
0.5~1 cm 长的根尖,立即放入有冰水混合物的指管
中,将装有根尖的指管放入温度 0~1℃冰水中,冷
处理 24~27 h。(8) 固定:取出冰水处理的根尖,用
滤纸吸干水。在卡诺固定液 (乙醇 : 冰醋酸 =3:1) 中
固定,固定的材料于 8℃低温条件下固定 2~4 d。(9)
保存:固定后的根尖取出,用滤纸吸干,转入装有
醋酸洋红的指形管中染色,于 8℃冰箱中保存备用。
固定材料保存半年以上,染色体的制片效果更佳。
1.3 根尖染色体的制备
按常规压片法。取染色后的根尖置载玻片上,
切去根冠后切取一薄片分生组织,在 45% 醋酸下制
片:竹针轻敲、烤片、压片、镜检。选出分裂相多、
分散性良好的片子在液氮中冰冻 10~25 min 后迅速
揭去盖片,气干,可保存于 -20℃冰箱中备用。
2 结果与讨论
2.1 改良的种子萌发方法对发芽率的影响
由于物种特异性,二倍体长穗偃麦草种子发芽
困难,以往的相关研究都是利用从土中挖取供试长
穗偃麦的根部,剪下根尖 (林小虎等, 2005),进行
染色体制片,制片效果不好,染色体分裂相少、染
色体形态特征不清晰。本研究采用改良的方法,参
照小麦种子的萌发条件,在发芽前对二倍体长穗偃
麦草种子进行 24 h 的浸种处理,以利于提高发芽率。
同时延长种子处理和促芽生长时间,并对第一轮未
萌发的种子进行二次萌发处理,从而提高实验材料
的有效使用率 (表 1、表 2)。
从表 1 和表 2 可以看出,将温箱中的种子发芽
时间延长至 90~96 h,约 45%~49% 种子露白,将
时间(h)
Time
一次发芽时间(h)
The first germination
time
二次发芽时间(h)
The second germina-
tion time
24~36 48~60 90~96 24~36 48~60 90~96
发芽率(%)
Germination rate
13~15 25~30 45~49 18~21 32~37 48~49
表 1 二倍体长穗偃麦草种子发芽时间与发芽率统计
Table 1 Statistics results of germination time and germination
rate of diploid Thinopyron elongatum seed
促芽生长时间(h)
Gemma growth
time
第一初生根长度(cm)
Length of the first
primary root
第二、三初生根长度(cm)
Length of the second
and the third primary
root
27.5
48~60
90~96
0.4~0.5
0.7~1.0
1.2~2.0
0.2~0.3
0.4~0.6
0.8~1.1
表 2 二倍体长穗偃麦草种子促芽生长时间与生根统计
Table 2 Statistics results of gemma growth time and rooted length
of diploid Thinopyron elongatum seed
观察长穗偃麦草(Thinopyron elongatum)体细胞染色体制片的好方法
A Modified Method for Observing Chromosomes in the Root-tip Cell of Thinopyron elongatum
450 分子植物育种
Molecular Plant Breeding
促芽生长时间同样延长至 90~96 h,种芽迅速生长,
第一初生根长至 1.2~2.0 cm,第二、三初生根长至
0.8~1.1 cm。将萌发慢的种子重新开始进行发芽再
处理和再促芽生长,第二轮处理后全部种子的萌发
率达到 97%以上,萌发效果良好,解决了二倍体长
穗偃麦草种子萌发困难的问题。在萌发过程中如发
现培养皿中水分不足,随时加水,切记保持培养皿
中湿润,水分又不太多,防止种子萌发时间过长而
使根粘连在滤纸上,影响剪取根尖。
2.2 染色体制片与中期分裂相的观察
材料经过前处理、促芽生长、冰处理、固定及
染色后,二倍体长穗偃麦草的根尖较脆,在制片时,
用竹针敲击时用力要小,要均匀,使细胞分散开即
可,火烤后迅速压片,可提高染色体的分散能力,
使用此方法获得的染色体形态清晰,分裂相好,并
显示一对染色体带随体 (图 1)。同二倍体长穗偃麦
草种子的常规发芽相比,经过改进后的种子萌发方
法所得到发芽率有显著提高,这为后期染色体制片
提供了先决条件。显微镜观察发现,染色体分裂指
数很高,在同一张制片上观察到大量具有中期分裂
相的细胞,并且染色体收缩良好,形态特征清晰。
制片经冷冻保存后,可应用于二倍体长穗偃麦草的
染色体核型分析、分带、荧光原位杂交,以及显微
切割等实验。
参考文献
Deng Z.Y., and Zhang X.Q., 2004, Evolution of partial promoter
region of HMW glutenin genes from E and E1 genome of
Agropyron elongatum, Yichuan (Hereditas (Beijing)), 26(3):
325-329 (邓志勇, 张相歧, 2004, 长穗偃麦草中 E和 E1基
因组高分子量麦谷蛋白的基因启动子部分序列的进化分
析, 遗传, 26(3): 325-329)
Dong Y.C., 2000, Genepools of common wheat, Mailei Zuowu
Xuebao (Journal of Triticeae Crops), 20(3): 78-81 (董玉琛 ,
2000, 小麦的基因源, 麦类作物学报, 20(3): 78-81)
Dvořák J., and Chen K.C., 1984, Phylogenetic relationships be-
tween chromosomes of wheat and chromosome 2E of Ely-
trigia elongate, Can. J. Genet. Cytol., 26(2): 128-132
Endo T.R., and Gill B.S., 1984, The heterochromatin distribution
and genome evolution in diploid species of Elymus and Ag-
ropyron, Can. J. Genet. Cytol., 26(3): 669-678
Han F.P., and Li J.L., 1995, Cytogenetics of trititrigia, China Ag-
ricultural Science Technology Press, Beijing, China, pp.1-28
(韩方普, 李集临, 1995, 小偃麦细胞遗传学, 中国农业科技
出版社, 中国, 北京, pp.1-28)
Lin X.H., Li X.F., Wang L.M., Zhao F.T., and Wang H.G., 2005,
Karyotype of three species in Triticeae of Gramineae and
their evolutional relationship, Zhongguo Caodi (Grassland
of China), 27(2): 22-26 (林小虎, 李兴锋, 王黎明, 赵逢涛,
王洪刚, 2005, 禾本科小麦族三个物种的核型及进化关系
分析, 中国草地, 27(2): 22-26)
Piao Z.S., 1982, The studies on the chromosomal morphology
and banding pattern in Agropyron intermedium, Yichuan
Xuebao (Acta Genetica Sinica), 9(5): 350-356 (朴真三,
1982, 天兰冰草染色体形态和带型的研究, 遗传学报,
9(5): 350-356)
图 1 醋酸洋红染色二倍体长穗偃麦草根尖染色体T. elonga-
tum (2n=14)
Figure 1 The staining of root tip chromosomes with acetocarmine
in diploid T. elongatum (2n=14)