全 文 ：文章编号:1001 － 4829(2015)05 － 2228 － 04 DOI:10． 16213 / j． cnki． scjas． 2015． 05． 072
收稿日期:2014 － 01 － 16
基金项目:云南省应用基础研究面上项目(2010CD099)
作者简介:董志渊(1979 －) ，男，云南石林人，博士，副研究员，
主要从事药用植物种质创新与利用研究，E-mail:yndongzhiyuan
@ 126． com，* 为通讯作者，E-mail:kmlshp@ 126． com。
Oryzalin诱导短葶飞蓬染色体加倍与三倍体创制研究
董志渊，杨丽英，王 馨，李林玉，杨 斌，马维思，严世武，李绍平*
(云南省农业科学院药用植物研究所，云南 昆明 650200)
摘 要:以短葶飞蓬种子为实验材料，采用 60 和 90 μM 的 oryzalin水溶液分别浸泡处理种子 24、48、72 h，诱导染色体加倍，并用染
色体加倍的四倍体变异植株与二倍体植株杂交，获得三倍体。结果表明，依据气孔大小，采用 60 和 90 μM 的 oryzalin 水溶液分别
浸泡处理种子 24、48、72 h，可使不同程度诱导染色体加倍，变异率为 12． 81 % ～24． 62 %，其中 90 μM 的 oryzalin 水溶液浸泡处理
种子 72 h诱变率最高;采用四倍体变异植株与二倍体杂交，结实率显著下降，千粒重增加;通过染色体计数和流式细胞分析，在杂
交后代植株中发现 0． 00 % ～100． 00 %不同比例的三倍体(2n = 3x = 27)。
关键词:短葶飞蓬;Oryzalin;染色体加倍;三倍体
中图分类号:S567． 239 文献标识码:A
Induction of Chromosome Doubling with Oryzalin and
Creation of Triploid in Erigeron breviscapus
DONG Zhi-yuan，YANG Li-yin，WANG Xing，LI Lin-yu，YANG Bin，MA Wei-si，YAN Shi-wu，LI Shao-ping*
(Institute of Medical Plant，Yunnan Academy of Agricultural Sciences，Yunnan Kunming 650200，China)
Abstract:Seeds of Erigeron breviscapus were soaked for 24，48 or 72 h with 60 or 90 μM oryzalin aqueous solutions to induce chromosome
doubling． Variants of chromosome doubling were pollinated with diploid to produce triploid． The ratio of chromosome doubling was from 12．
81 % to 24． 62 % using measurement of guard cells to identify chromosome doubling of plantlets． The highest induction frequency (24． 62
%)was achieved when seeds were soaked with 90 μM oryzalin for 72 h． The seed rate of the variants decreased significantly and grain
weight of those plantlets increased after pollinated with pollens of diploid． Triploids (2n = 3x = 27)were identified in hybrids between the
variants and normal diploid by chromosome counts and flow cytometry analysis．
Key words:Erigeron breviscapus;Oryzalin;Chromosome doubling;Triploid
短葶飞蓬［Erigeron breviscapus (vant．)Hand． -
Mazz．］又名灯盏花，为菊科飞蓬属多年生草本植
物，以全草入药，是云南重要的药用植物和道地药
材，现已被云南省列为重点发展的五大系列药品之
一［1］。短葶飞蓬主要有效成分总黄酮及其灯盏乙
素，具有扩张脑血管，增加脑血流量，改善微循环作
用，用于治疗缺血性脑血管疾病［2］。
短葶飞蓬植株主要为二倍体(2n = 2x = 18)，
但在野生群体中也发现了三倍体自然变异植株(2n
= 3x = 27)。表型特征研究发现，短葶飞蓬三倍体
植株生长势强，植株高大粗壮，叶片数明显多于二倍
体植株，叶形较大，结实率极低，植株抗性强，可作为
育种的优良种质［3］。但由于短葶飞蓬三倍体自然
发生频率较低，无法满足育种利用需要，因此有必要
建立一套人工创制短葶飞蓬三倍体的技术方法，为
三倍体新品种选育培育提供丰富的、不同遗传背景
的三倍体新种质。
本研究以短葶飞蓬种子为材料，采用新型染色
体加倍剂 Oryzalin 诱导染色体加倍，通过四倍体变
异植株与二倍体植株杂交，获得三倍体。
1 材料与方法
1． 1 材料
当年采收的短葶飞蓬［Erigeron breviscapus
(vant．)Hand． -Mazz．］饱满种子。
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西 南 农 业 学 报
Southwest China Journal of Agricultural Sciences
2015 年 28 卷 5 期
Vol. 28 No. 5
1． 2 方法
1． 2． 1 Oryzalin 浸泡处理种子 采用 60 和 90 μM
的 Oryzalin水溶液分别浸泡种子 24、48、72 h，处理
结束后，自来水冲洗种子 3 次，播种育苗。以 1 %
DMSO蒸馏水浸泡 24、48、72 h 为对照处理。每一
处理组合约 1000 粒种子，3 次重复。
1． 2． 2 气孔鉴定 植株生长出 4 ～ 6 片真叶时，撕
取第 4 片真叶下表皮，进行气孔鉴定。具体方法如
下:显微镜下，测定气孔的长和宽，采用椭圆周长公
式:L = 2πb + 4 (a － b )，计算气孔周长，以气孔
周长代表气孔大小。每一植株测量 30 个气孔。采
用 T检验方法，统计分析处理后植株与对照植株气
孔大小差异，其中以气孔周长极显著大于对照的植
株作为初选四倍体变异植株。
进入现蕾期，取花序基部叶片进行气孔鉴定，方
法同上。以气孔周长极显著大于对照的植株作为四
倍体变异植株。
1． 2． 3 染色体鉴定 取四倍体变异植株根尖，进行
染色体计数。具体方法:晴天上午 10:00 时，取植株
生长旺盛的根尖，放入 0． 002 M 的 8-羟基喹啉溶液
中预处理 6 h，转入卡诺氏固定液Ⅰ(无水酒精 ∶ 冰
醋酸 = 3∶ 1)固定 16 h，1N HCl 60 ℃水解 7 min，卡
宝品红染液染色 2 min，压片，显微镜下进行染色体
计数。
1． 2． 4 倍性分析 以二倍体为对照，进行四倍体变
异植株核 DNA 含量流式细胞光度分析。取植株幼
嫩叶片放入培养皿里，加入 WPS 提取缓冲液;用刀
片切碎叶片，30 μm微孔滤膜过滤，加入 PI染色液，
染色 1 min，PAＲTEC 倍性分析仪上样检测。
1． 2． 5 总黄酮含量测定 参照苏文华等［4］的方
法，进行总黄酮的提取与测定。精密称取过 60 目筛
的样品粉末 0． 3 g，放入 25 mL 的锥形瓶，准确加入
25 mL 60 %乙醇，振荡 5 min 后，超声波处理器 30
min，取出后过滤，待测。
以无水芦丁为对照标准品配制标准溶液，可见
分光光度计 510 nm处测定吸光度，得标准曲线的回
归方程为:A = 0． 0879c + 0． 0007，r = 0． 9995。精
密取待测液 1 mL，置于 25 mL容量瓶中，用 60 %乙
醇定容，测定 510 nm 处的吸光度，通过回归方程推
算样品的总黄酮含量。
30.00
25.00
20.00
15.00
10.00
5.00
0
变
异
率
（ %
）
Ab
er
ra
tio
n
ra
te
60 μM 24 h 60 μM 48 h 60 μM 72 h 90 μM 24 h 90 μM 48 h 90 μM 72 h
处理
Treatments
1． 二倍体植株气孔;2． 四倍体变异植株气孔;3． 不同 Oryzalin浓度和处理时间条件下，短葶飞蓬种子发生染色体加倍的变异率． Bar =
20μm
1． Guard cells of diploid;2． Guard cells of variants of chromosome doubling;3． Ｒatio of chromosome doubling after seeds of Erigeron breviscapus trea-
ted with different concentration oryzalin solution for different duration． Bar = 20μm
图 1 不同 Oryzalin浓度和处理时间对短葶飞蓬染色体加倍的影响
Fig． 1 Effect of oryzalin concentration and duration treatments on chromosome doubling in Erigeron breviscapus
92225 期 董志渊等:Oryzalin诱导短葶飞蓬染色体加倍与三倍体创制研究
1． 2． 6 不同倍性植株间杂交 进入开花期，以 3 个
四倍体变异植株为母本进行套袋，取二倍体对照植
株花粉进行授粉，形成 3 个不同倍性间杂交组合。
1． 2． 7 三倍体获得 按照杂交组合，分别收获成熟
种子，播种育苗，植株生长出 4 ～ 6 片真叶时，取根尖
进行染色体鉴定;染色体鉴定为三倍体的植株进行
核 DNA含量流式细胞光度分析。具体方法同 1． 2．
3 和 1． 2． 4。
2 结果与分析
2． 1 Oryzalin浸泡处理种子诱变染色体加倍
幼苗期，二倍体对照植株第 4 叶片气孔周长平
均值为 182． 06 μm。Oryzalin浸泡处理种子，部分植
株气孔周长极显著大于对照，植株发生染色体加倍。
统计分析表明，采用 60 和 90 μM 的 Oryzalin水溶液
分别浸泡处理种子 24、48、72 h，可不同程度诱导染
色体加倍，变异率为 12． 81 % ～ 24． 62 %;90 μM
Oryzalin浸泡处理不同时间产生的变异率均高于 60
μM各处理，其中 90 μM Oryzalin 浸泡处理 72 h 的
变异率最高，达到 24． 62 %(图 1)。
2． 2 四倍体变异植株主要特征
四倍体变异植株的染色体鉴定和倍性分析结果
均表明，变异植株的细胞发生了染色体加倍。与二
倍体植株比较，四倍体变异植株外部形态也发生明
显变化。四倍体变异植株形态特征主要表现为叶片
颜色深绿色，表面粗糙;叶缘着毛变稀疏，其长度明
显增长;叶片数目减少，生长发育较迟缓;现蕾期推
迟 30 ～ 90 d，花序数目明显减少，仅 1 ～ 3 个。四倍
体变异植株叶片总黄酮含量显著增加，达到 11． 07
% ～14． 95 %(二倍体对照为 7． 96 % ～ 9． 24 %，图
2)。
2． 3 不同倍性植株间杂交与三倍体获得
采用四倍体变异植株与二倍体杂交，结实率仅
为 19． 51 %(二倍体与二倍体杂交，结实率为 42． 77
%);杂交后代种子千粒重增加，达到 0． 38 g (二倍
体与二倍体杂交后代种子千粒重 0． 20 g)。通过染
1． 二倍体植株;2． 二倍体染色体数目(2n = 2x = 18) ;3． 二倍体 DNA流式细胞分析;4． 四倍体植株;5． 四倍体染色体数目(2n = 4x
= 36) ;6． 四倍体 DNA流式细胞分析;7． 三倍体植株;8． 三倍体染色体数目(2n = 3x = 27) ;9． 三倍体 DNA流式细胞分析
1． Plantlet of diploid;2． Chromosome number of diploid (2n = 2x = 18) ;3． Flowcytometry of nuclear DNA content of diploid;4． Plantlet of tet-
raiploid;5． Chromosome number of tetraploid(2n = 4x = 36) ;6． Flowcytometry of nuclear DNA content of tetraploid;7． Plantlet of triploid;8．
Chromosome number of triploid(2n = 3x = 27) ;9． Flowcytometry of nuclear DNA content of triploid
图 2 不同倍性短葶飞蓬植株及其倍性鉴定
Fig． 2 Plantlets of different ploid and ploid identification
0322 西 南 农 业 学 报 28 卷
色体鉴定和倍性分析，在杂交后代中发现倍性纯合
的三倍体植株(2n = 3x = 27)，但不同组合杂交后
代三倍体发生比例差异较大，3个组合的三倍体发生比
例依次为 0． 00 %、11． 54 %和 100． 00 %(图 2)。
3 讨 论
三倍体具备细胞体积增大引发的巨大性和减数
分裂异常造成的不育性，已广泛用于培育高产、质优
和无籽的植物新品种［5 ～ 6］。
三倍体一般可通过自然变异和人工创制 2 种途
径获得。一些物种的三倍体自然变异植株可直接用
于植物育种［7 ～ 9］;而其它不存在三倍体自然变异或
三倍体发生比例极低的植物，四倍体与二倍体杂交
是获得三倍体的主要方法［10 ～ 13］。采用该方法创制
三倍体，人工诱导获得四倍体亲本是关键。
秋水仙素、Oryzalin等染色体加倍药剂处理不定
芽、试管苗、鳞片等材料，可诱导生长点分生组织细
胞染色体加倍［14 ～ 20］。由于细胞有丝分裂的不同步
性，分生组织所有细胞一般不能全部发生染色体加
倍，造成染色体倍性嵌合现象(即植物植株包含两
种或两种以上染色体倍性)。池坚等［21］研究发现，
秋水仙素处理后的百合试管苗普遍存在染色体嵌合
现象，其中秋水仙素培养基诱导的表型变异植株中
100 %为嵌合体，秋水仙素溶液处理获得的表型变
异植株中 90 %为嵌合体。本研究采用 Oryzalin 的
水溶液处理短葶飞蓬种子，诱导胚芽生长点分生组
织细胞染色体加倍，依据气孔大小，判别染色体加倍
情况。研究中除发现叶片气孔普遍增大的变异植株
外，还发现气孔大小差异明显或叶片一侧气孔显著
增大，另一侧气孔未发生增大的变异植株，表明
Oryzalin的水溶液处理短葶飞蓬种子也存在染色体
倍性嵌合的现象。
在嵌合体植株生长过程中，四倍体细胞往往处
于生长劣势而被逐渐淘汰，最终导致四倍体创制的
失败。因此，必须进行四倍体变异植株的染色体倍
性纯化，获得倍性纯合的四倍体植株。目前，一般采
用离体扩繁四倍体变异植株的方法，通过愈伤组织
或不定芽诱导途径，分离获得四倍体后代植株。该
方法周期长、操作繁琐、技术难度大。
通过有性生殖途径(四倍体变异植株与二倍体
植株杂交)进行倍性纯化，利用植物有性生殖过程
中单细胞(卵细胞)与单细胞(精细胞)的受精融合，
可产生三倍体合子细胞，并进一步发育形成倍性纯
合的三倍体植株，同步实现倍性纯化和三倍体创制，
免除了离体扩繁纯化四倍体变异植株倍性的大量烦
琐工作。本研究的染色体计数和 DNA含量流式细
胞分析结果表明，短葶飞蓬四倍体变异植株与二倍
体杂交后代中，存在倍性纯合的三倍体植株，证明了
该方法是可行的，可应用到短葶飞蓬三倍体快速创
制中，为育种提供丰富的三倍体新种质。
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(责任编辑 王家银)
13225 期 董志渊等:Oryzalin诱导短葶飞蓬染色体加倍与三倍体创制研究