全 文 ：马蓝 Strobilanthes cusia（Nees）O. Ktze别名青黛、
靛蓝、南板蓝根，叶经加工成干叶入药称为大青叶，茎、
叶加工成一种深蓝色的粉末入药称为青黛，是爵床科
马蓝属的一种草本植物，主要分布于中国华南和西南
地区，是常用中药[1]。适应性极广，喜温暖潮湿、阳光
充足的气候环境，适宜在水资源丰富、土壤深厚、土质
肥沃的地方生长。一般海拔 400~600 m、水资源清澈
无污染的山区或坝区，尤其适合马蓝的种植与靛蓝的
生产。近年研究开发为重要的抗癌药物。自 1995年
版起，《中国药典》将其作为新增中药品种收载。马蓝
基金项目：福建省重大科技专项“福建省中药材GAP关键技术研究”(2004YZ02)。
第一作者简介：黄以钟，男，1965年出生，副主任技师，研究方向：药用植物栽培与生物技术。通信地址：350002福建福州市，福建农林大学作物科学学院。
通讯作者：周以飞，女，1948年出生，教授，研究方向：药用植物生物技术。通信地址：350002 福建福州市，福建农林大学作物科学学院，
Tel：0591-83778961，E-mail：fjyifei@163.com，fjyifei@yahoo.com.cn。
收稿日期：2009-02-26，修回日期：2009-03-09。
马蓝基因组DNA提取及RAPD反应体系的优化
黄以钟 1,2，潘大仁 1,2，王占成 2，陈 隽 1，周以飞 1,2
（1福建农林大学作物学院，福建省植物分子与细胞生物学重点实验室，福州 350002）
（2福建农林大学作物学院，教育部作物遗传育种与综合利用重点实验室，福州 350002）
摘 要：以马蓝为研究材料，对马蓝基因组DNA的提取以及RAPD-PCR反应体系进行了优化。结果表
明，在提取液中加入PVP和β-巯基乙醇去除酚类物质，采用高盐沉淀DNA和多次洗涤去除糖类，可以得
到高质量的马蓝基因组DNA。电泳检测结果表明，所获得的DNA完整，无降解，完全可以满足RAPD
等分子标记分析的需要。同时对马蓝RAPD-PCR反应体系中各个影响因素进行了优化，建立了适合马
蓝 RAPD分子标记的最佳反应体系，即 20 μl反应体系中含有 1.25 U TaqDNA聚合酶，0.25 mmol/L
dNTP，2.5 mmol/L Mg2+，50 ng模板DNA，1.0 μmol/L引物；反应程序中最佳退火温度为38℃。
关键词：马蓝；RAPD；DNA；反应体系
中图分类号：S567.23 文献标识码：A
Extraction of Genomic DNA and Optimization of RAPD Reaction of
Baphicacanthus cusia (Nees) Bremek
Huang Yizhong1,2, Pan Daren1,2, Wang Zhancheng2, Chen Juan1, Zhou Yifei1,2
(1Key Laboratory of Fujian Province for Plant Molecule and Cell Biology,
Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002;
2Key Laboratory of Ministry of Education for Genetics, Breeding and Multiple Utilization of Crops,
Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002)
Abstract: The method for extraction genomic DNA from Baphicacanthus cusia (Nees) Bremek and some
essential factors affecting the result of RAPD-PCR were investigated in the paper. PVP and
β-mercaptoethanol were added to lyses buffer in order to inhibit oxidation of polyphenol, high concentration of
salt solution and elution for many times were used to remove polysaccharide, using above methods ,high
quality DNA of Baphicacanthus cusia (Nees) Bremek could be obtained. Based on the high quality genomic
DNA, some reaction conditions of PCR for RAPD was optimized. The results showed that the RAPD-PCR
system with Taq DNA polymerase 1.25 U, dNTP 0.25 mmol/L, Mg2 + 2.5 mmol/L, genomic DNA 50 ng and
random primer 1.0 μmol/L in 20 μl solution was suitable for Baphicacanthus amplification reaction.
Key words: Baphicacanthus cusia (Nees) Bremek, RAPD, DNA, reaction system
中国农学通报 2009,25(08):53-57
Chinese Agricultural Science Bulletin
中国农学通报 http://www.casb.org.cn
性寒、味苦、归心经、归胃经、具有清热解毒的功效，用
于温病发斑、丹毒、流感、流脑等。药理试验表明，马蓝
根对金色葡萄球菌和肺炎杆菌有良好的抑制作用，马
蓝叶中含有抗癌有效成分靛玉红[2-3]。中医药典上作为
重要的抗病毒和清热解毒的良药。
目前关于马蓝的研究主要集中在植物学栽培、加
工技术、入药考证、有效成分及药理作用等方面，而在
分子水平上对其进行遗传多样性研究还少有报道。
DNA分子标记技术是从基因水平鉴别品种的一种手
段，可以不受时间和环境的影响，又能从基因水平直接
反映品种间差异，为品种鉴定提供了快速可行、高效准
确的方法。在分子标记技术诞生的20多年里，以其独
特的优势迅速发展，已经广泛应用于基因作图[4]、基因
定位[5]、生物遗传育种[6-7]、基因克隆等方面。随机扩增
多态性 DNA（Random Amplified Polymorphic DNA，
RAPD）技术是由美国的Williams等[8]和加利福尼亚生
物研究所Welsh等[9]建立在PCR技术基础上的一种快
速、简便、多态性检出率高、可自动分析的一项DNA分
子标记技术。但是RAPD标记对试验程序和条件变化
较敏感，使得不同物种的RAPD最优体系所需条件不
同。为此，笔者以马蓝基因组DNA为试材，对加入反
应体系的Taq DNA聚合酶、dNTP浓度、Mg2+浓度、模
板DNA浓度、引物浓度及不同退火温度进行优化，旨
在为今后进行马蓝的遗传多样性分析与明确马蓝分类
地位奠定理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料
供试材料为产自闽侯善恩园和仙游榜头的马蓝；
Taq DNA聚合酶、dNTP（2.5 mmol/L each）、10×PCR
buffer等PCR试剂均购自TaKaRa公司（大连），RAPD
随机引物购自上海生工生物工程有限公司，其他试剂
均为国产分析纯生化试剂。
1.2 方法
1.2.1 DNA提取 采用单丽丽等[10]的高盐沉淀法改良
传统的CTAB法提取DNA，紫外分光光度计检测其浓
度和质量，进行稀释定量，放入-20℃冰箱备用。
1.2.2 RAPD反应体系与扩增条件 预扩增试验所用
的 RAPD反应体系是：Taq DNA聚合酶 2.0 U，dNTP
0.25 mmol/L，Mg2+ 2.5 mmol/L，模板DNA 50 ng，引物
浓度 1.0 μmol/L，总反应体积 20 μ l。扩增条件为：
94 ℃预变性 5 min，94 ℃变性 45 s，38 ℃退火 45 s，
72℃延伸1.5 min，38个循环，72℃延伸5 min。扩增产物
在1%的琼脂糖凝胶中电泳，并于成像系统下观察并照相。
1.2.3 单因素设计方案 在上述反应体系及扩增条件的
基础上设置单因素优化试验，筛选出最佳反应条件。
具体设计见表1。
表1 各因素的试验水平设计
注：1~7表示各因素浓度序号。
优化因素
dNTP浓度/(mmol/L)
Taq DNA聚合酶浓度/U
引物浓度/(µmol/L)
Mg2+浓度/(mmol/L)
DNA模板浓度/（ng/µl)
1
0.05
0.50
0.10
0.5
5
2
0.15
0.75
0.25
1.0
10
3
0.25
1.00
0.50
1.5
30
4
0.35
1.25
1.00
2.0
50
5
0.45
1.50
1.50
2.5
70
6
3.0
100
7
150
对上述因素进行优化时，退火温度先设 37℃，待
扩增反应组成成分确定后再筛选退火温度。退火温度
设为 30.6 ℃、31.5 ℃、32.6 ℃、33.9 ℃、35.3 ℃、
36.6℃、37.9℃、39.9℃、40.4℃。每次仅改变 1个因
素，其他因素均保持不变，每个因素水平3次重复。
1.2.4 PCR产物检测 PCR结束后，在PCR管中加入4 μl
6×溴酚蓝上样缓冲液，混匀，取10 μl混合液上样于1%
琼脂糖凝胶，电泳后于紫外凝胶成像系统上拍照。优
化结果以背景低，谱带清晰，数目适中，稳定可重复的
组合为最佳反应条件。
2 结果与分析
2.1马蓝基因组DNA提取方法的改良
采用单丽丽等 [10]的高盐沉淀法改良了传统的
CTAB法，方法如下：称取5 g鲜叶组织，加少量吡咯烷
酮和石英砂，用液氮磨成粉末状，迅速装入50 ml离心
管，加入15 ml预热（65℃）1.5×CTAB buffer，600 ml巯
基乙醇，65℃温浴 1 h；待离心管冷却后，用氯仿和异
戊醇抽提 2次，每次加入 15 ml氯仿:异戊醇（24:1）混
匀，10000 r/min，4℃离心10 min，取上清至新试管，加
入 0.5倍体积的 NaCl和 3倍体积的无水乙醇，沉淀
DNA，-20℃放置30 min，取出10000 r/min离心10 min，
去上清；加入0.5 ml 75%乙醇冲洗2次，置于工作台晾
干；加入0.5 ml无菌水溶解DNA。
纯化：加 1/2 体积饱和苯酚和 1/2 体积氯仿
12000 r/min离心 10 min，重复 2次；取上清至新管中，
加 2 体积无水乙醇和 1/20 体积 5 mol/L NaCl，然
·· 54
图1 马蓝基因组DNA电泳检测图
a为传统的CTAB法得到的DNA电泳图，b,c为改良后得到的DNA电泳图
a b c
后-20 ℃放置 30 min；取出 10 000 r/min离心 10 min，
去上清；加入70%乙醇1 ml，弹起沉淀，12 000 r/min离
心5 min，重复2次；干燥后用无菌水溶解。
通过改良后的方法，重复提取马蓝DNA两次，均
得到了高质量的基因组DNA。经1%琼脂糖凝胶电泳
后，DNA完整，无降解，可满足RAPD等分子标记的需
要。（图 1-a和图 1-b、1-c分别为改良前后的DNA检测
图）。
2.2 RAPD反应体系的优化
2.2.1 Taq DNA聚合酶浓度对RAPD扩增的影响 Taq
DNA聚合酶是PCR反应中最重要的因素之一。浓度
过大，不仅造成浪费，且容易产生非特异带；浓度过小，
则得不到扩增产物。
由图2可见，当Taq酶用量为0.5 U的时候，看不到
扩增的条带。用量在 0.75~1.5 U时，均可以得到扩增
条带。但是浓度低时，分子量少的条带不能有效扩增；
当浓度过高（达 1.5 U/20 μ1）时非特异产物增加，分子
量较大的主条带模糊难以分辨。因此，选用Taq DNA
聚合酶的浓度为1.25 U/20 μ1。
2.2.2 dNTP浓度对 RAPD扩增的影响 dNTP是 PCR
的原料，浓度过高或过低均影响扩增条带效果。从扩
增的结果（图3）可以看出dNTP浓度过低条带减少，浓度
过高条带弥撒有部分拖带现象。因此，确定0.25 mmol/L
为最佳浓度。
图2 不同TaqDNA聚合酶浓度的扩增结果
1~5分别为0.5，0.75，1.0，1.25，1.50 U

M 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 M M 1 2 3 4 5

M 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 M1 2 3 4 5 M
图3 不同dNTP浓度的扩增结果
1~5分别为0.05，0.15，0.25，0.35，0.45 mmol/L
2.2.3 引物浓度对 RAPD扩增的影响 引物浓度对
RAPD影响较大。当引物浓度增大时，引物与模板的
结合机会增多，扩增产物也随之增多；但若引物浓度过
大，容易形成二聚体，并且有非特异性条带产生。由图
4可见，当引物浓度过低，引物和模板结合几率降低，
扩增反应过早终止；浓度过高则条带弥撒严重。试验
选用引物浓度为1.0 μmol/L。
2.2.4 Mg2+浓度对RAPD扩增的影响 由图5可以看出
Mg2+在0.5，1.0，1.5 mmol/L时条带扩增明显减少，主条
带模糊不清，浓度在 2.0 mmol/L和 2.5 mmol/L时条带
清晰多态性强，浓度过高条带数没有大的改变但模糊
不清，试验确定2.5 mmol/L为最佳浓度。
2.2.5 模板DNA浓度对RAPD扩增的影响 模板DNA
浓度是制约RAPD扩增产量和特异性的主要因素。相
关文献[11-12]表明，RAPD反应对模板DNA用量的适宜
范围较大。
由图 6中可以看出：模板浓度在 5~30 ng/μl之间
内，条带偏弱，浓度在 30~150 ng/μl间扩增结果良好，
这说明模板DNA的量在一定范围内对RAPD扩增结
果无明显影响，试验确定50 ng/μl为最佳浓度。
黄以钟等：马蓝基因组DNA提取及RAPD反应体系的优化 ·· 55
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2.2.6 退火温度对RAPD扩增的影响 扩增结果由图 7
可见，温度由低到高，清晰度逐渐增强，在退火温度为
39.9℃和 37.9℃时效果较为理想。试验选择 38℃作
为实验最佳退火温度。
2.3 马蓝RAPD-PCR扩增图谱
按照优化好的RAPD程序，用随机引物对马蓝进
行扩增，扩增产物电泳后得到了马蓝基因组DNA的扩
增图谱（图8）。
图4 不同浓度引物的扩增结果
1~5分别为0.1，0.25，0.5，1.0，1.5 µmol/L
图5 不同Mg2+浓度的扩增结果
1~6分别为3.0，2.5，2.0，1.5，1.0，0.5 mmol/L

M 1 2 3 4 5 M 1 2 3 4 5 6

M 1 2 3 4 5 M 5 6 M 1 2 3 4 5 M 1 2 3 4 5 6
1 2 3 4 5 6 7 M M 1 2 3 4 5 6 7 8 9
图6 不同模板DNA水平的扩增结果
1~7分别为5，10，30，50，70，100，150 ng
图7 不同退火温度的扩增结果
1~9分别为40.4，39.9，37.9，36.6，35.3，33.9，32.6，31.5，30.6℃

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
2000 bp
1000 bp 500 bp 100 bp
图8 随机引物对马蓝的扩增结果
2000 bp
1000
500 bp
100 bp
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
3 讨论
基因组DNA的质量对RAPD反应有着重要的影
响。提取得到高质量的马蓝基因组DNA，才能进行马
蓝RAPD反应体系的研究。不同产地或同一产地的不
同组织因其细胞结构及所含的成分不同，基因组DNA
的分离方法也有差异[13]。马蓝叶片组织中的酚类等次
生代谢是比较难以消除的物质，也是影响DNA质量的
关键因素。传统的 CTAB法制备马蓝DNA，得到的
DNA中常常引物酚类物质的残留使DNA沉淀带有颜
色，难以扩增。因此采用改良后的方法提取DNA，电
泳检测后，完整无降解，可完全满足RAPD等分子标记
的需要。
笔者在以往研究结果的基础上对影响扩增的主要
因素（Taq DNA聚合酶、dNTP浓度、Mg2+浓度、引物浓
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度、模板DNA浓度以及退火温度）进行了分析[14-15]。经
过各因素条件的筛选，得出马蓝RAPD扩增反应的最
佳反应体系为 2.0 μl 10×buffer，1.25 U Taq DNA聚合
酶，0.25 mmol/L dNTP，2.5 mmol/L Mg2 +，50 ng模板
DNA，1.0 μmol/L引物。反应程序为：94℃预变性5 min，
94 ℃变性 45 s，38 ℃退火 45 s，72 ℃延伸 1.5 min，38
个循环，72℃延伸5 min。在该优化体系的基础上，用
随机引物对马蓝进行RAPD指纹图谱扩增，得到了比
较清晰的指纹图谱。该研究为进一步进行马蓝RAPD
分析及其亲缘关系、遗传多样性研究提供可靠的试验
依据。
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