全 文 ：对小鼠的降压作用 ,初步探讨了 CS的降血压作用 ,
总的来说 , CCCS比 BCCS降压效果显著 。下一步将
针对具体来源的 CS降血压的作用进行深入研究。
参 考 文 献
[ 1] 林洪 ,姬胜利 .硫酸软骨素的药理作用及应用研究进
展 [ J] .食品与药品 , 2006, 8(12):4-7.
[ 2] 王世中 ,荣国煌 , 吴宁华 , 等.硫酸软骨素 A及 C的分
离与提纯 [ J] .药学学报 , 1980, 15(3):164-169.
[ 3] 陈敏 , 李慧 ,张世湘 .硫酸软骨素间苯三酚光度分析法
的改进研究 [ J] .食品研究与开发 , 2006, 27(7):163-
166.
[ 4] LowryOH.Proteinmeasurementwithfolinphenolreagent
[ J] .JBiolChem, 1951, 193:265-269.
[ 5] 张惟杰 .糖复合生化技术 [ M] .杭州:浙江大学出版
社 , 1999:73.
[ 6] 张峥 , 耿芳宋 ,高华 .猪软骨中硫酸软骨素的分离纯化
[ J] .中国生化药物杂志 , 2004, 25(3):144-146.
收稿日期:2009-06-09基金项目:福建省科技创新平台(2008Y2003);福建省重大科技专项(2004YZ02-1)作者简介:黄玉吉(1981-),女,研究实习员 ,硕士 ,研究方向:植物生物技术。＊通讯作者:陈菁瑛 , E-mail:cjy6601@ 163.com。
·资源 ·
马蓝种质资源的 RAPD分析
黄玉吉 ,陈菁瑛＊
(福建省农业科学院农业生物资源研究所 /药用植物研究中心 ,福建 福州 350003)
　　摘要　目的:探讨马蓝种质资源在分子水平上的遗传多样性。方法:利用随机扩增多态性 DNA技术(RAPD)
对收集到的不同居群马蓝资源进行分析。结果:从 104条 10个碱基的随机引物筛选出有差异的有效引物 , 筛选出
的 12条有效引物 ,扩增共获得 422条 DNA带 , 多态性程度为 55.69%。聚类分析表明 , 马蓝种质资源的遗传差异
与地理位置无密切联系 ,而与形态特征有一定联系 , 但并不十分紧密。结论:不同自然居群的马蓝资源在分子水平
上存在着较明显的遗传差异。
　　关键词　马蓝;遗传多样性;RAPD分析
　　中图分类号:R284.1　　文献标识码:A　　文章编号:1001-4454(2010)02-0183-04
RAPDAnalysisontheGermplasmResourcesofBaphicacanthuscusia
HUANGYu-ji, CHENJing-ying
(InstituteofAgrobiologicalresources, FujianAcademyofAgriculturalSciences/MedicinalPlantResearchCenter, Fuzhou350003,
China)
Abstract　Objective:ToexplorethegeneticdiversityofgermplasmresourcesofBaphicacanthuscusiaonmolecularleve.Meth-
ods:Themolecularbiologicaltechnique-randomamplifiedpolymorphicDNA(RAPD)wereused.Results:104randomdecamerprim-
erswerescreenedforRAPDfragmentsofBaphicacanthuscusia.422DNAbandswereamplifiedby12 primers, 55.69% productswere
foundtobepolymorphic.BaseonUPGMAclusteranalysis, aDNAmoleculardendrogramwasestablishedtodiscussthegeneticdiversity
ofthegermplasmresourcesofBaphicacanthuscusia.Thegeneticdiferencesarerelatedtomorphologicaldifferencesonacertainex-
tant, butnottogeographicregions.Conclusion:Thereactuallyexistedmuchgeneticdiversityonmolecularlevelamongdiferentnatural
populationsofBaphicacanthuscusia.
Keywords　Baphicacanthuscusia(Nees)Bremek;Geneticdiversity;RAPDanlysis
　　马蓝 Baphicacanthuscusia(Nees)Bremek为爵床
科植物 ,从马蓝茎叶中加工提取的蓝色泥浆状半成
品为蓝靛 ,再经精制干燥后的蓝色粉末或团块 ,即为
青黛 ,具有清热解毒 、凉血定惊之功效 〔1〕。经过长
期临床实践和民间验证 ,马蓝确系一味尚属少有的
抗病毒良药和清热解毒珍品〔2〕。
　　RAPD是 90年代发展起来的分子标记技术 ,它
通过分析遗传物质 DNA经 PCR扩增后的多态性来
诊断生物内基因排布与外在形状表现规律 ,具有灵
敏性高 、不受环境 、发育数量 、形状遗传等影响的优
点 ,能客观地揭示供试材料间 DNA差异 ,且技术操
作简便 、快速 、省时 、省力 〔 3, 4〕。目前已广泛应用于
·183·JournalofChineseMedicinalMaterials　　第 33卷第 2期 2010年 2月
DOI :10.13863/j.issn1001-4454.2010.02.013
人参〔5〕、西洋参 〔6〕 、当归 〔7〕 、银杏 〔8〕、甘草〔9〕等药用
植物的 DNA指纹图谱构建 、真伪鉴定 、亲缘关系 、遗
传多样性及药材道地性研究。本研究利用 RAPD技
术对收集的马蓝资源进行遗传多样性分析 ,旨在探
讨不同材料之间的遗传关系 ,为马蓝资源的合理开
发和保护以及新品种选育提供理论依据 ,也为马蓝
DNA指纹图谱的构建奠定基础 。
1 　材料
　　研究包括福建莆田 、永泰以及四川绵阳 、贵州贵
阳等 7个居群的马蓝(表 1)的幼嫩叶片 。样品均经
福建省莆田市德龙药业有限公司陈俊平副主任药师
鉴定为爵床科植物马蓝 Baphicacanthuscusia(Nees)
Bremek。
　表 1　 　　马蓝样品来源
编号 来源
1 福建莆田大洋栽培
2 福建莆田仙游野生
3 福建福州永泰野生
4 四川绵阳栽培
5 贵州贵阳栽培
6 福建莆田瑞云山野生
7 福建莆田大洋野生
2 　方法
2.1 　马蓝基因组 DNA提取 　于 1.5 mL离心管
中 ,将 0.1 g马蓝叶片用液氮磨成细粉末 ,加入 600
μL预热的 CTAB提取缓冲液 (50 mMTris-HCl, pH
8.0;20mMEDTA;2%CTAB;1.4mMNaCl, 临用前
加入 2% β-巯基乙醇),混匀后置于 65 ℃水浴中温
育 45min,期间混匀数次;4℃下 12 000rpm离心 20
min,将上清液转移到新的 1.5mL离心管;上清液加
入等体积预冷的氯仿∶异戊醇(24∶1),将离心管缓
慢颠倒几分种使管内充分混匀;4 ℃下 12 000 rpm
离心 10min,将上清液小心转移到新的 1.5 mL离心
管中;加 2 /3体积预冷的异丙醇 , 缓慢混匀 , 置于
-20 ℃下静置 30 min;4 ℃下 13 000 rpm离心 10
min,弃上清液 ,用 lmL预冷的 70%乙醇洗涤 DNA
沉淀两次;加 100μL灭菌过的 ddH2O,溶解即得。
2.2　马蓝基因组 RAPD-PCR扩增　PCR反应体系
体积为 25μL:其中模板 40ng, 2mMdNTP3 μL, 10
×bufer2.5 μL;Taq酶 2 U, 随机引物 10 pmol。
PCR扩增程序为:94 ℃预变性 4 min;94 ℃变性 1
min, 38 ℃退火 1.3 min, 72 ℃延伸 2 min, 45个循
环;最后 72 ℃延伸 10min。用含 GoldView的 1.5%
琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果 ,在 VIBERLOUR-
MAT(INFINITY3000)凝胶成像系统上观察。
2.3　引物筛选及 DNA多态性分析　以上海英骏
生物技术有限公司合成的 104条随机引物(BAO1
～ BOA100, BAO201, BAO224, BAO227, BAO276)
作为筛选的对象 ,筛选出有差异性条带的有效引物
进行 RAPD分析。
2.4　数据的统计与分析　按琼脂糖凝胶同一位置
上 DNA带的有无进行统计 ,有带(包括弱带)记为
“1”,无带记为 “0”。利用 Waston等 〔10〕系数计算出
各物种之间的遗传距离 D=(b+c)/(2a+b+c)
(a为两样品共有的带 , b、c为两样品各自的特异
带),再用 UPGMA法对其进行聚类分析 , 并构建
DNA分子系统树图 。
3　结果与分析
3.1　引物筛选　选取了上海英骏生物技术有限公
司合成的 104条随机引物 ,筛选出 12条有差异性条
带的有效引物 ,见表 2。
　表 2　　　　　　各样品的 RAPD分析
引物名称 引物序列 总带数 多态性带 单态性带 多态性/%
BAO8 GTCCACACGG 35 14 21 40.00
BAO18 CCACAGCAGT 34 13 21 61.90
BAO33 CAGCACCCAC 50 22 28 44.00
BAO38 AGGTGACCGT 39 25 14 64.10
BAO42 GGACCCAACC 45 17 28 37.78
BAO54 CTTCCCCAAG 26 26 0 100.00
BAO60 ACCCGGTCAC 29 22 7 75.86
BAO86 GTGCCTAACC 26 19 7 73.08
BAO90 AGGGCCGTCT 33 12 21 36.36
BAO91 TGCCCGTCGT 22 15 7 68.18
BAO201 GGGCCACTCA 50 29 21 58.00
BAO276 CAGCCTACCA 42 21 21 50.00
3.2　聚类分析　首先根据距离系数 D=(b+c)/
(2a+b+c)计算得到 7个种间的遗传距离矩阵。
遗传距离越大 ,种间亲缘关系也就越远。在表 2的
基础上以 UPGMA法 〔10〕对其进行聚类 ,得出 7个样
品的 DNA分子系统树图 ,见图 1。
图 1　马蓝样品分子系统树图
·184· JournalofChineseMedicinalMaterials　　第 33卷第 2期 2010年 2月
图 2　引物 BAO 38的 PCR扩增图谱
图 3　引物 BAO 276的 PCR扩增图谱
　　从图 1可以看出:6、4、3、5、2这几个马蓝居群
的样品遗传距离较近 ,构成一组;而 1、7这 2个样品
的遗传距离较近 ,构成另一组。除样 1和 7同取自
莆田大洋外 ,从分组情况看不出其与样品地理分布
位置有密切关系 。从形态学特征来看 ,栽培类型的
马蓝较野生类型矮 ,四川马蓝 (样 4)最矮;样 1(大
洋栽培马蓝)和样 7(大洋野生马蓝)的叶片都较小 ,
叶深绿色;样 5(贵州栽培马蓝)和样 1在形态上的
区别除了植株高度外 ,样 5的叶片长于样 1,且更
绿 。各材料间的相异系数变化范围在 0.2676 ～
0.5821,平均值为 0.3903;5和 1这 2个样品的相异
系数最大 ,为 0.5821,表明这 2个样品即贵州栽培
马蓝和莆田大洋栽培马蓝存在着较大的遗传差异 ,
亲缘关系较远。野生类群内相异系数变化范围为
0.3067 ～ 0.4493,平均值为 0.4000;栽培类群内相
异系数变化范围为 0.3611 ～ 0.5821, 平均值为
0.4631;说明马蓝栽培类群间遗传多样性比野生类
群间相对丰富 ,但二者间的差异还不足以从分子水
平上严格区分为两大类。
3.3　RAPD多态性　本试验采用 12条由上海英骏
生物技术有限公司合成的随机引物分别对 7个不同
自然居群的马蓝样品进行 RAPD扩增 。结果表明 ,
扩增产物的多少因随机引物的改变及试材的不同而
获得不同基因组的 DNA扩增谱带 。 12条引物共扩
增出 422条扩增谱带 ,不同引物获得的扩增谱带 26
～ 50条不等 ,平均为 35.2条 。在 422条谱带中 ,多
态性条带 235条 ,多态性程度为 55.69%,为分析各样
品间的亲缘关系提供了可能性。
4　讨论
　　在 RAPD操作过程中 ,由于涉及 PCR扩增中的
变性 、退火 、延伸温度和时间 ,以及扩增循环数 ,特别
是退火温度 ,同时受反应体系中的多种试剂来源及
浓度 ,镁离子和模板 DNA浓度等诸多因素影响 ,会
出现重复性差等一些问题〔11〕。因此 ,很多研究者认
为尽管其灵敏度高 ,但不稳定。笔者在实验操作过
程中认为 ,只要反应条件恒定 ,体系中各种试剂来源
和浓度保持一致 ,保证各个循环及其参数的稳定性 ,
且各种反应参数必须事先优化选择 ,在操作中每一
步都必须小心谨慎 ,是可以得到较稳定的结果的。
RAPD因其引物没有严格的种属界限 ,而具有广泛
性和通用性 ,且成本较低 ,因此可以作为一较好的方
法用于同一物种不同种群遗传关系的研究。
　　有研究表明 , RAPD标记划分的类型同地理分
布有一定关系 ,地理位置较近的材料多数能聚到一
起;但也有研究表明遗传差异与与形态差异联系较
紧。本试验的结果表明 ,马蓝遗传差异与形态特征
有一定联系 ,但并不十分紧密。野生资源往往比栽
培类型遗传多样性更大 〔7〕 ,但本试验结果中 ,马蓝
栽培类群间遗传多样性相对高于野生资源 ,这可能
是因为人工栽培用种多是通过就地野生驯化而来 ,
很少进行异地远距离引种 ,在驯化过程中人们往往
进行了有意识地选择 ,从野生类群中筛选出符合自
己需要的生产用种 ,从而形成了各具不同特异性状
的栽培类群 ,在一定程度上扩大栽培类群间的遗传
多样性。
参 考 文 献
[ 1] 国家药典委员会 .中华人民共和国药典 [ S] .一部 .北
京:化学工业出版社 , 2005:138.
[ 2] 钱云川 .浙南马蓝资源调查 [ J] .时珍国医国药 , 1999,
10(3):243-244.
[ 3] DawsonIK, ChalmerKJ, WaughR, etal.Detectionand
analysisofgeneticvariationinHordeumspontaneumpopu-
lationsfromIsraelusingRAPDmarkers[ J] .MolEcol,
1993, 2(3):151 -159.
[ 4] VirkPS, Ford-iloydBV.UseofRAPDforthestudyofdi-
versitywithinplantgermplasmcolections[ J] .Heredity,
1995, 74(25):170-179.
·185·JournalofChineseMedicinalMaterials　　第 33卷第 2期 2010年 2月
[ 5] 马小军 ,汪小全 , 孙三省 ,等 .野生人参 RAPD指纹的研
究 [ J].药学学报 , 1999, 34(4):312-316.
[ 6] ShawPC, ButPPH.Authenticationofpanaxspeciesand
theiradulterantsbyrandom-primedpolymerasechainreac-
tion[ J] .PlantaMed, 1995, 61(5):466-469.
[ 7] 马毅 ,丁永辉 .当归与 “莲花归”RAPD分析 [ J] .中药
材 , 2006, 29(2):101-103.
[ 8] 刘叔倩 ,马小军 , 郑俊华 .银杏不同变异类型的 RAPD
指纹研究 [ J] .中国中药杂志 , 2001, 26(12):822-825.
[ 9] YamazakiM, SatoA, ShimomuraK, etal.Geneticrelation-
shipsamongGlycyrrhizaplantsdeterminedbyRAPDand
RFLPanalysis[ J].BiolPharmBul, 1994, 17(11):l529-
l531.
[ 10] WatsonL, WiliamsWT, LanceGN.Angiospermtax-
onomy:Acomparativestudyofsomenovelnumerical
techniques[ J] .JournalLinnaeanSociety, 1966, 59
(380):491-501.
[ 11] 焦峰 ,楼程富 .RAPD技术应用中的一些问题及对策
[ J].西北农业学报 , 2000, 9, (4):98-102.
湘西地区蛇足石杉资源调查研究
周　毅 1, 2 ,黄衡宇1, 2＊ ,李　菁 1, 2
(吉首大学 1.植物资源保护与利用湖南省高校重点实验室;2.生态研究所 ,湖南 吉首 416000)
　　摘要　目的:系统调查湘西地区蛇足石杉的分布现状 、更新频度 、产销状况 ,并为蛇足石杉资源的可持续利用
提供对策。方法:采用调查访问和采样方法。结果:随着对蛇足石杉资源掠夺性地采收加上其种群自然更新频度
偏低 , 导致很难维持其种群的动态平衡 ,野生资源蕴藏量迅速下降 , 种质资源正逐步消失。结论:应加强蛇足石杉
野生种质资源的保护和合理开发利用。
　　关键词　蛇足石杉;生物量;自然更新频度;产销状况;保护对策
　　中图分类号:R282.71　　文献标识码:A　　文章编号:1001-4454(2010)02-0186-04
收稿日期:2009-06-02基金项目:湖南省科学技术厅科技计划(2007NK3075);广东省科学技术厅科技计划(2007B020704003)作者简介:周毅(1976-),男(土家族),硕士研究生 ,研究方向:植物生理生态学;Tel:13739027595, E-mail:zhouyi7595@163.com。＊通讯作者:黄衡宇 , E-mail:hhyhhy96@ 163.com。
　　千层塔 Huperziaserrata(Thunb.exMurray)
Trev.又名蛇足草 、蛇足石杉 、金不换等 ,为石松科多
年生草本植物 〔1〕 ,是一种多年生小型草本植物 ,生
于密林下或沟谷石上 ,喜阴凉潮湿环境。民间用于
治疗痈疖肿毒 、跌打损伤等〔2〕 ,其所含生物碱石杉
碱甲和石杉碱乙具有很强的抑制胆碱酯酶(ChE)活
性 ,临床试验证实石杉碱甲对治疗重症肌无力和早
老性痴呆有显著疗效 ,已被国际上列为第二代的乙
酰胆碱酯酶(AchE)抑制剂之一 〔3〕 ,是广为瞩目的新
的石松生物碱。湘西地区复杂多样的植被类型及适
宜的地域条件为蛇足石杉的分布 、生长和发育提供
了优越的环境 ,但是近年来蛇足石杉资源被严重破
坏 ,为了深入了解湘西地区蛇足石杉资源现状 ,笔者
对湘西地区蛇足石杉的天然生物量 、自然更新频度 、
产销状况进行了调查研究 ,并提出了相应的保护对
策 。
1 　研究方法
1.1 　野外调查与访问　在实地调查前 ,向当地药
材公司 、林业局 、药材收购点和老中医 、老药农了解
蛇足石杉资源分布情况 ,大致数量 、保护与利用状
况 ,以及近年来蛇足石杉资源产销情况 。本课题组
于 2007年 9月至 2008年 10月期间 ,对湘西地区的
泸溪 、古丈 、凤凰 、保靖 、永顺 、龙山 、吉首 、花垣等县
市地进行了调查。
1.2　调查数据处理
1.2.1　出现度计算:在每一县市选出 1 ～ 2个典型
的适合蛇足石杉生长的样点 ,然后随机地在每一样
点设置 5条调查线带 ,每一条带设 5个 10 ×10 m2
主样方 ,然后在每一主样方对角线上各设 3个同样
大小面积的副样方记录出现频度 ,用此频度对适生
环境的面积(1 hm2)进行修正。按公式 F=n/(N1
+N2)计算出目的种在样地中的出现度。其中:F
为出现度;n为目的种出现的主副样方数;N1为目
的种在群落中的主样方数;N2为该群落的副样方
数。
1.2.2 　生物量调查:收获各主样方内发现的所有
蛇足石杉个体 ,并逐一在 80 ℃下烘干至恒重 ,用天
平称重得到实测生物量 ,以主样方大小和数量与调
·186· JournalofChineseMedicinalMaterials　　第 33卷第 2期 2010年 2月