全 文 ：遗 传 学 报 , 2 6 ( l ) : 4 9 一 5 3 , 19 9 9
月c 匆 ` 亡n e 万c a iS n ic a
应用原位杂交及 R A P D 技术标记抗黄矮
病小麦一中间堰麦草染色体异附加系
徐琼芳 马有志 辛志勇 陈 孝 林志珊
(中国农业科学院作物所 农业部作物遗传育种重点 开放实验室 北京 10 0 ()8 l)
摘要 以生物素 ( iB o it n 一 16一d L )T P)标记 中间堰麦草基 因组 D N A 为探针 , 与抗黄矮病小麦一中
间堰麦草染色体异附加系 Z 。进行原位杂交 , 鉴定出附加的 I 对中间堰麦草染色体 。 对异附加
系 2 6和 L ,及它们的小麦亲本进行了 RA PD 分析 , 从 120 个随机引物中
, 筛选出 2 个引物可以
扩增出附加染色体的特异 D N A 片段 , 可作为鉴定导人小麦的中间堰麦草染色质的分子标记 。
关键词 异附加系 , 原位杂交 , 1毛入P D , 分子标记
分类号 Q34 3
中间堰麦草 (几加娜、 ru m in 扮 r m e itl u m , Z n 一 4 2 )染色体异附加系 2 6是通过普通小麦
与小麦一中间堰麦草部分双二倍体无芒 中 4 (Z n = 5 6) 杂交 、 回交选育出的二体异附加系
(Z n 一 4 4 ) [ , ] 。 高抗大麦黄矮病毒 ( b a r l e y y e l lo w d w a fr v iur s , B YVD )
。 由于 z 。 的小麦亲
本中 8 4 23 不抗 B YVD
, 说明 Z 。的抗 B YVD 基 因是来 自附加的中间堰麦草染色体
。 同工酶
及 R F L P 分析结果证实 Z 。的外源染色体属第二部分同源群染色体 , 并被定名为 Z iA 一2染
色体 2[] 。 C au de r on 等 3[] 从小麦一中间堰麦草部分双二倍体 丁A 4F 6 ( 2n = 5 6) 中选育 出抗
B Y vD 异附加系 L 、
。 研究表明 , L 〕携带的外 源染色体属第 七部分 同源群 , 并被命名为
7A i
一 1染色体卜 6〕。 辛志勇等 川已成功地将 L , 的抗 B Y VD 基 因导人小麦
, 获得抗 B Y D V 小
麦种质 。 L ar ik n 等 2[] 的研究证实 , T A 4F 6 与无芒中 4 分别携带着不同的抗 B Y I ) v 基因 。 特
别是无芒中 4 携带的抗 B Y I〕 V 基因对在我国流行的 G PV 株系具有极好的抗性 , 将成为我
国选育抗 B YVD 小麦品种的又一重要抗源 s[]
。 因此 , 对 2 6 、 L I携带的外源染色体进行标
记 、 鉴定 , 不仅有助于 应用细胞工 程分别将 两种抗 B Y I ) V 基 因导人小麦 品种 , 创造抗
B Y D V 小麦新种质 , 同时也可为实现抗性基因累积提供选择标记 。
原位杂交 (in 、 iut h y b ir id z iat o n) 技术是利用标记的 D N A 作为探针 , 与染色体 D N A 进
行分子杂交 ,直接检测与探针互补的 D N A 顺序的存在位置 。 它是在分子水平上鉴定识别
染色体的有效方法 。 特别是基因组原位杂交 ( g e n o m i e i , , 、 i r。 h y b` d i z a t i o n , o xs H ) 已广泛
应用于染色体组型分析和外源染色体鉴定 。 RA PD 技术是以 一个 随机的寡聚核昔酸链
( l o b p )为引物 , 以基因组 D N A 为模板进行 P c R I) N A 扩增 , 进而检测扩增产物的多态性 。
近年来 1毛A P D 技术广泛应用于品种鉴定 、 基因标记等 。
本文于 19 7司卜21 收到 , ! 9 9 7一 6一28 修 回
国家 ” 8 6 3 ” i寸一划 ” 及 国家自然科学基金资助项 目
50遗 传 学 报 26卷
本文报道了采用 G ISH 法对 Z 。 , 应用 RA PD 技术对 2 6
、
L , 的中间堰麦草染色体及来
自 L , 的抗 B YVD 易位系中的中间堰麦草染色体片段进行鉴定
、 标记的结果 。
I 材料和方法
1
.
1 实验材料
无芒 中 4 、 中间堰麦草 、 Z 。及其普通小麦亲本中 8 4 23 、 L , 普通小麦亲本 iV lm o ir n 2 7 、
来 自 L , 的抗 B Y VD 的小麦易位系 Y 9 5 01 1 (2 n 一 4 2)
、 普通小麦品种 中国春 。
1
.
2 D N A 提取
参照 《分子克隆》 。
1 3 R A P D 分析
p C R D
NA 扩增反应在 2 5户 l 混合液中进行
, 其中模板 D N A 5 0 n g 、 gM C I 2 l
.
s m m o l /
L
、
d N T p 0
.
l mm o一/ L 、 T a g D N A p o ly m e r as e l u 、 随机引物 ( o 详 or n 公司产品 ) 0 . 2拜m o l /
L
。
4 5 个循环 , 每个循环的条件分别是 : 95 ℃ 15 、 37 ℃ 5s 、 72 ℃ l m in 。 扩增产物在 1 . 5% 琼
脂糖凝胶上电泳 , 共检测了 120 个引物 , 每个引物都重复 3 次以上 。
1
.
4 原位杂交
以生物素 ( iB o it n 一】6一d U T P )标记中间堰麦草基因组 D N A 作为探针 , 以 中国春基因组
D N A 为封阻 DNA
, 与异附加系 Z 。 的中期染色体 D N A 进行了原位杂交 。
1
.
4
.
1 探针的制备 按随机引物法标记探针 。
1
.
4
,
2 染色体标本的制作及预处理 参照 uF ku i 和 Iij m alo ]的酶解法制作染色体标本 。
然后 , 在每张染色体标本上滴加 6 0 0召 1 RN a s e A (0 . l m g / m l , s i g m a 公司 ) 3 7 aC 温育 l h 。 移
至 70 % 、 9 5% 、 10 0% 的酒精中依次脱水 , 每步 s m in , 最后取出空气干燥 。
1
.
4
.
3 杂交 按每张染色体标本 巧 尸 l的用量配制杂交液 , (50 % 甲酞胺 、 2 x s s c 、 10尸g
鲜鱼 D NA
、
8 0 gn 探 针 D N A 和 8 一 10 户g 封 阻 D N A ) , 杂交 液在 85 一 92 ℃ 水浴 锅 中保持
10 m
ln 后 , 迅速转人冰水中保持 5一 10 m in 。 然后 , 将其滴加到染色体标本上 , 37 ℃过夜 。
1
.
4
.
4 杂交后 的漂洗 、 杂交信 号的放 大与检测 参照 uF k iu 等 l0] 的方法进 行 。 用
A vi d l n 一曰T C检测探针 D N A , 用 PI 复染染色体 。
2 结果
原位杂交结果表明 , 在异附加系 Z 。 中有 1对染色体整个区域显示黄色荧光信号 (图
1)
, 这种信号是 由呈绿色的荧光色素 FI T C 和呈红色的荧光色素 PI 复合而成 。 说 明探针
D
NA 与这一对染色体发生了分子杂交
,这一对染色体即是 Z 。携带的中间堰麦草染色体 。
以无芒中 4 、 Z 。 及其小麦亲本 中 842 3 、 L 【、 L 【的小麦亲本 iV lm o ir n2 7 及来 自 L , 的抗
B Y D V 易位系 Y 9 5 0 l 的基因组 D N A 为模板进行了 RA P D 分析 。 从中筛选到 2个引物可
以在中间堰麦草染色体 D N A 上扩增出特异产物 。
引物 O P问 l( 5’ 一 A C (汇玉A T C C T G 3` )在 Z 。 及无芒 中 4 上可扩增 出 6 种不同长度的
D N A 产物 , 在 Z 。 的小麦亲本中 8 4 2 3 上扩增出 3 种不同长度的 DNA 产物 (图 2)
。 其中在
Z 。及无芒中 4 上都能扩增 出 1条长度约 1 5 0 0 b p的 DNA 特异带
, 这条特异带在每次重复中
都能稳定地出现 , 在中 8 4 2 3 没有此带 。 说明 D N A 片段 O P -F o l 、 50 是在 2 6 携带的中间僵麦
草染色体 O N A 上扩增出的特异 D N A 产物 , 可作为鉴定 Z 。的外源染色体的分子标记 。 在
L l 和抗 B YVD 易 位 系 Y 9 5 0l l 上 得 到 8 种 不 同 长度 的 扩增 产 物
, 在 L , 的小 麦 亲 本
1期 徐琼芳等 :应用原位杂交及 A RP I对支术标记抗黄矮病小麦一中间堰麦草染色体异附加系 5 3
dw ar f v lr u s by b lo t e eh no lo } g
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in et r m e id u m A d d i t io n L i n e s i n W h e a t w i t h B a r l e y Y e l lo w
D w a r f V i r u s R e s i s t a n e e
X U Q i o n g一aF n g M A Y o让 Z ih X I N Z h i一Y o n g C H E N X i a o L IN Z h i一 S h a n
(人劝 山b o r a l o lr o / 〔汾印 G e n e r , 〔二 a n d Br e e id n g 肠 n ls r。 · of gO r ,` 、 u i ru r e nI s t i la l e o / rC 叩 Br e e id n g a n d
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(Z n = 4 4 )
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s (B Y D V )
.
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er s u l仁 a P a i r o f 几 . 动 et r m e d i u m e h or m o s o m e s a d d e d i n w h e a t b ac k g or u n d w as
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ad d i it o n l i n e w i ht B Y D V er s i s at n e e ) a n d t h e i r Pa er n st w e er a n a l y z e d b y RA PD
a n a ly s i s
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