全 文 ：基金项目：国家重点基础研究发展计划 (973)项目前期基础研究专项 (No. 2014CB160307)和国家自然科学基金 (No.
31401717和No. 31360432)
收稿日期：2016-08-20 接受日期：2016-10-20
象耳豆根结线虫纤维素结合蛋白Me-cbp-1基因的克隆与功能分析
龙海波 1，2 魏丽莎子 1 赵志祥 1* 陈绵才 1*
1海南省农业科学院植物保护研究所/海南省植物病虫害防控重点实验室，海口 571100；2中国热带农业科学院环境与植物保护研究所，
海口 571101
*通讯作者，zhaozhixiang0207@126.com；miancaichen@163.com
摘 要 纤维素结合蛋白(cellulose binding protein, CBP)是植物寄生线虫在侵染过程中分泌的重要效应
蛋白。为了获得象耳豆根结线虫 (Meloidogyne enterolobii)纤维素结合蛋白序列信息、并分析其在线虫寄
生致病过程中的功能地位，本研究利用已构建的象耳豆根结线虫二龄幼虫转录组数据库，结合 cDNA末
端快速扩增(rapid-amplification of cDNA ends, RACE)技术克隆了象耳豆根结线虫纤维素结合蛋白基因
Me-cbp-1 (GenBank登录号: KU350655) cDNA全长序列。生物信息学分析表明，Me-cbp-1 cDNA全长809
bp，其5末端和3末端的非编码区长度分别为43和 139 bp，以及含有1个长度为627 bp的完整开放阅读
框(ORF)，推导编码208个氨基酸。预测蛋白Me-cbp-1含有起分泌功能的信号肽结构和纤维素结合结构
域。同源性搜索比对分析表明，象耳豆根结线虫Me-cbp-1与南方根结线虫 (M. incognita)、爪哇根结线虫
(M. javanica)及花生根结线虫(M. arenaria)纤维素结合蛋白具有88%~91%的相似性。原位杂交显示，Me-
cbp-1在象耳豆根结线虫二龄幼虫的亚腹食道腺细胞特异表达。利用RNAi技术对象耳豆根结线虫二龄
幼虫的Me-cbp-1基因进行沉默后，导致二龄幼虫的侵染率显著降低。本实验结果初步证明了纤维素结合
蛋白在象耳豆根结线虫二龄幼虫侵染寄主的过程中具有重要地位，推测其通过与细胞壁主要成分纤维素
结合，促进植物细胞壁的软化和降解，从而有利于提高线虫的侵染和寄生能力。本研究为揭示象耳豆根
结线虫分子寄生致病机制以及进一步研究防治根结线虫病害新策略提供了理论依据。
关键词 象耳豆根结线虫，纤维素结合蛋白，原位杂交，RNA干扰
中图分类号 S432.4；Q946.5 文献标识码 A
Cloning and Functional Analysis of a Cellulose Binding Protein Gene
Me-cbp-1 from the Root-Knot Nematode Meloidogyne enterolobii
LONG Hai-Bo1,2 WEI Li-Sha-Zi1 ZHAO Zhi-Xiang1* CHEN Mian-Cai1*
1 Institute of Plant Protection of Hainan Academy of Agricultural Sciences, Hainan Key Laboratory for Control of Plant Diseases and Insect
Pests, Haikou 571100, China; 2 Institute of Environment and Plant Protection, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Haikou
571101, China
* Corresponding authors, zhaozhixiang0207@126.com; miancaichen@163.com
Abstract Cellulose binding proteins (CBP) are cell wall- related effectors secreted by plant- parasitic
nematodes during parasitism. In this study, a new cellulose binding protein gene Me- cbp- 1 (GenBank No:
KU350655) was cloned from the root-knot nematode Meloidogyne enterolobii by rapid-amplification of cDNA
ends (RACE) based on transcriptome sequencing analysis. The full- length of Me- cbp-1 cDNA was 809 bp,
including a 627 bp open reading frame (ORF). The cDNA contained of 43 bp 5-untranslated region (UTR)
Online system: http://www.jabiotech.org
农 业 生 物 技 术 学 报
Journal of Agricultural Biotechnology
2017, 25(2): 196~204
DOI: 10.3969/j.issn.1674-7968.2017.02.003
根结线虫(Meloidogyne spp.) 是一类高度专化
型的植物病原线虫，可寄生于包括蔬菜、粮食作物、
经济作物、果树以及观赏植物等主要农作物在内的
3 000多种植物上(Abad et al., 2003)。根结线虫种
类众多，其中生产上危害最为严重的有北方根结线
虫(M. hapla)、南方根结线虫(M. incognita)、花生根
结线虫(M. arenaria)和爪哇根结线虫(M. javanica)等
(Perry et al., 2006)。象耳豆根结线虫(M. enterolobii)
是近几年引起广泛关注和重视的根结线虫种类，在
世界范围内均有发生分布，该线虫具有极其广泛的
寄主范围，而且能在分别携带Mi和N抗原基因的
辣椒(Capsicum annuum)和番茄(Lycopersicon esculen⁃
tum)上寄生繁殖 (Yang, Eisenback, 1983; Castag-
none-Sereno, 2012)，已逐步取代南方根结线虫，成
为我国热带和亚热带地区最为严重的根结线虫种
类。据报道，该线虫在海南、广西、广东等地均有发
生，主要为害冬种瓜菜、热带水果和南药植物(符美
英等, 2012;龙海波等, 2015)。
植物细胞壁富含纤维素和果胶质成分。同
时，还包含少部分的蛋白和脂类物质。根结线虫
侵染性二龄幼虫在侵入寄主根系、迁移至取食位
点以及诱导巨形细胞形成的过程中，都需要克服
细胞壁对迁移、寄生的影响。研究表明，根结线虫
要想在植物根系迁移、寄生，首先必须利用口针多
次穿刺寄主植物细胞壁，然后，分泌一系列的降解
酶类对细胞壁进行降解、软化和松弛，如果胶酸裂
解酶、纤维素酶、钙网蛋白和扩展蛋白等(Vanhol-
me et al., 2004)。纤维素结合蛋白(cellulose bind-
ing protein, CBP)含有典型的纤维素结合结构域
(cellulose binding domain, CBD)，通过与细胞壁中
的纤维素结合，提高相应的酶的水解效率，但CBP
本身并不具备纤维素水解活性 (Shoseyov, Doi,
1990)。Ding等(1998)首次从南方根结线虫中分离
克隆了第一个植物寄生线虫CBP基因Mi-cbp-1，并
通过免疫标记在二龄幼虫的食道腺细胞和口针分
泌物检测到其特异编码蛋白，证实了根结线虫在
寄生过程中分泌 CBP至体外起作用。Adam等
(2008)利用RNAi对爪哇根结线虫纤维素结合蛋白
基因Mj-cbp-1进行沉默后，导致二龄幼虫的侵染率
和雌虫产卵数显著降低。在大豆孢囊线虫(Het⁃
erodera glycines)中，纤维素结合蛋白基因Hg-cbp-1
在整个寄生期都有表达，且表达量在固着性取食
阶段达到最高水平，说明纤维素结合蛋白极有可
能与取食位点的建立和维持密切相关(Gao et al.,
2004)。本研究首次从象耳豆根结线虫中分离克隆
了一个纤维素结合蛋白基因 Me- cbp-1，并利用
RNAi技术分析Me-cbp-1在象耳豆根结线虫寄生过
程中的功能，以期为深入了解象耳豆根结线虫的
分子致病机制及其与寄主植物之间的互作机理提
供理论依据。
1 材料与方法
1.1 供试线虫
象耳豆根结线虫(Meloidogyne enterolobii)从海
南乐东佛罗辣椒(Capsicum annuum)病根上获得。
并经单卵囊接种于感病番茄品种‘特级大明星’(Ly⁃
and 139 bp of 3-UTR. The ORF encodes a deduced protein of 208 amino acids with a calculated molecular
weight of 22.2 kD and a pI of 4.0. The predicted protein Me-cbp-1 had a putative signal peptide for secretion
and a cellulose binding domain. Homology analysis showed that Me-cbp-1 shared 88%~91% identities with
cellulose binding proteins from root- knot nematodes M. incogntia, M. javanica and M. arenaria. In situ
hybridization analysis showed that the transcript of Me- cbp- 1 accumulated exclusively within cells of
subventral gland on the J2s of M. enterolobii. To illustrate the importance of Me-cbp-1 in the parasitism of M.
enterolobii, gene expression was knocked down using RNAi. Knocking down the expression of Me-cbp-1 in
pre-parasitic nematodes significantly reduced the penetration rate of plants by more than 26%. The proportion
of nematodes inside the roots relative to those transferred to the roots was 26.8% for the nematodes treated
with Me-cbp-1 dsRNA, whereas 36.4% of the nematodes from the gfp dsRNA treatment were found inside the
roots 10 days after inoculation. It was indicated that an important role of Me- cbp- 1 in the early stages of
invasion and migration of J2s in the root. These above results are useful for deeper elucidating the molecular
mechanism of parasitism and pathogenesis of M. enterolobii.
Keywords Meloidogyne enterolobii, Cellulose-binding protein, In situ hybridization, RNA interference
象耳豆根结线虫纤维素结合蛋白Me-cbp-1基因的克隆与功能分析
Cloning and Functional Analysis of a Cellulose Binding Protein Gene Me-cbp-1 from Meloidogyne enterolobii 197
农业生物技术学报
Journal of Agricultural Biotechnology
copersicon esculentum Tejidamingxing)，温室内纯化
培养。
1.2 方法
1.2.1 线虫分离与收集
取象耳豆根结线虫单卵囊接种 90 d左右的番
茄病根，自来水下冲洗干净后剪断成长度约 1 cm
的片段，置于家用豆浆碾磨机中绞碎。将获得的根
碎片先后过 100和 500目网筛，其中 500目筛网收
集卵块。将收集的卵块于 1% NaClO中消毒 5 min
后，于25~28 ℃孵化获得二龄幼虫。幼虫经无菌的
磷酸盐缓冲液 (phosphate buffered saline, PBS)清
洗，液氮中保存、备用或直接后续实验。
1.2.2 RNA提取与反转录
参照 Invitrogen公司(美国)生产的RNA提纯试
剂盒说明书，采用TRIzol法提取象耳豆根结线虫二
龄幼虫及各虫态的总RNA并电泳检测。参考北京
天根生物技术有限公司生产的FastQuant RT (with
gDNase)试剂盒说明书，反转录合成 cDNA第一
链。进而按照GeneRacerTM RACE 试剂盒(Invitro-
gen,美国)说明合成5′RACE和3′RACE。
1.2.3 Me-cbp-1 cDNA序列获得
在已有的象耳豆根结线虫 cDNA文库序列信
息的基础上，设计末端特异性引物扩增Me-cbp-1基
因，结合RACE接头引物，采用巢式PCR分别进行
5′RACE和 3′RACE扩增。5′RACE扩增第一轮所
用引物见表 1，分别为为 GeneRacer 5′ primer和
CBP-A1。反应体系及参数为：10× PCR Buffer 5
μL，dNTP 4 μL，Mg2+ 4 μL，上下游引物各2 μL (终
浓度 1 μmol/L)，Ex Taq酶 0.5 μL，RACE模板 1
μL，补充灭菌双蒸水至总体积 50 μL，Tm为 58 ℃，
共 35个循环。第二轮 PCR以第一轮 PCR产物为
模板，所用引物为 GeneRacer 5 nested primer和
CBP-A2(表 1)，反应体系及参数为：10× PCR Buf-
fer 5 μL，dNTP 4 μL，Mg2 + 4 μL，上下游引物各 2
μL(终浓度 1 μmol/L)，Ex Taq酶 0.5 μL，第一轮
PCR产物模板 1 μL，补充灭菌双蒸水至总体积 50
μL，褪火温度为 56 ℃，共 35个循环。3末端序列
的扩增第一轮PCR所用引物为GeneRacer3 primer
和CBP-S1(表1)，第二轮PCR所用引物为GeneRac-
er 3nested primer和 CBP-S2(表 1)，PCR扩增体系
及方法与 5末端序列扩增一致。根据所获的末端
序列，设计全长特异引物CBP-F和CBP-R(表1)，扩
增Me-cbp-1 cDNA全长。PCR反应体系：10× PCR
Buffer 5 μL，dNTP 4 μL，Mg2+ 4 μL，上下游引物各
2 μL(终浓度1 μmol/L)，Ex Taq酶0.5 μL，cDNA模
板 1 μL，补加 ddH2O至总体积 50 μL，57 ℃退火 35
s，34个循环。产物经电泳检测后，纯化、连接至
PMD-18T载体(Takara,大连)，送诺赛基因公司(北
京)测序。
1.2.4 原位杂交
设计合成探针引物CBP-Situ1和CBP-Situ2(表
1)，以Me-cbp-1 cDNA全长为模板扩增获得杂交靶
标序列，反应体系为：10 × PCR Buffer 2.5 μL，
dNTP 2 μL，Mg2+ 2 μL，上下游引物各1 μL(终浓度
1 μmol/L)，Ex Taq酶0.5 μL，cDNA模板0.5 μL，补
加 ddH2O至总体积 25 μL，55 ℃退火，32个循环。
以杂交靶标序列为模板，结合单引物CBP-Situ1或
CBP- Situ2，用 PCR DIG Probe Synthesis Kit
(Roche,美国)分别合成地高辛(DIG)标记的正义单
链探针和反义单链探针。原位杂交步骤参照De
Boer等(1998)描述的方法进行，略有修改：新鲜孵
化的二龄幼虫在 3%的多聚甲醛中 4 ℃固定 16 h
后，再转入室温固定5 h。杂交温度为47 ℃。
1.2.5 离体RNAi
离体RNAi采用 dsRNA浸泡法，参照Urwin等
(2002)和 Chen等(2005)描述的方法进行，略有修
改。设计在5端引用T7启动子序列的dsRNA特异
引物 CBP- I1和 CBP- I2(表 1)，结合 MEGA®script
RNAi kit(Life Technologies, 美国)反转录合成Me-
cbp-1 特异的 dsRNA序列。浸泡体系为：2 mg/mL
dsRNA，0.5%间苯二酚，0.05%明胶，3 mmol/L亚精
胺，浸泡溶液用1×PBS缓冲液调节。对照处理分两
组，一组加入绿色荧光蛋白基因 gfp为模板合成的
dsRNA片段，所用引物为Gp-1和Gp-2(表 1)，另一
组为清水处理。所用二龄幼虫量为20 000条，浸泡
时间为 12 h，温度为 22 ℃，在杂交炉中保持慢速转
动。浸泡结束后用灭菌水反复冲洗虫体，每处理取
10 000条二龄幼虫提取 RNA，分别取等量浓度
RNA(200 ng/μL)反转录合成 cDNA，RT-PCR分析
沉默效果，所用引物为CBP-Situ1和CBP-Situ2(表
1)，反应体系为：10 × PCR Buffer 2.5 μL，dNTP 2
μL，Mg2+ 2 μL，上下游引物(终浓度 1 μmol/L)各 1
μL，Ex Taq酶0.5 μL，cDNA模板1 μL，补充灭菌双
198
蒸水至总体积 25 μL，褪火温度为 55 ℃，扩增30个
循环。
1.2.6 侵染力表型分析
将 dsRNA浸泡处理(含对照)的二龄幼虫接种
至生长 30 d番茄苗根部，每个处理接种 300条线
虫，设 5组重复。接种 10 d后收集番茄根系，采用
酸性品红染色法，显微镜下观察统计二龄幼虫的侵
染数量。数据采用Duncan新复极差法进行差异显
著性分析，所用软件为SPSS 19.0。
2 结果与分析
2.1 Me-cbp-1 cDNA序列
利用RACE技术分别克隆获得了象耳豆根结
线虫Me-cbp-1 cDNA的 5末端和 3末端序列，拼接
后获得的全长序列为 809 bp(GenBank登录号:
KU350655)。Me-cbp-1 cDNA由 5 非编码区、3 非
编码区和一个完整的开放阅读框组成，其中5非编
码区长度为43 bp、开放阅读框长度为627 bp，以及
3非编码区长度为139 bp(含Poly A尾)(图1)。
2.2 Me-cbp-1蛋白序列特征
Me-cbp-1开放阅读框推导编码一个由208氨基
酸残基组成的蛋白Me-cbp-1，DNAMAN软件预测
其分子量为22.2 kD，等电点4.0。Signal P 4.0含20
个氨基酸残基的起分泌功能的信号肽前体序列(图
1)。BlastP同源性搜索显示，Me-cbp-1蛋白羧基端
(C)含有一个保守的纤维素结合结构域(CBD-Ⅱ)，
位于谷氨酸Glu116至天冬氨酸Asp163之间(图1)。序
列分析比对表明，象耳豆根结线虫纤维素结合蛋白
Me-cbp-1与南方根结线虫、爪哇根结线虫以及花生
根结线虫的纤维素结合蛋白具有88%~91%的相似
性(图2)。此外，与孢囊线虫(Heterodera spp.)不同的
是，在根结线虫纤维素结合蛋白序列N端还含有70
多个氨基酸，该段序列与数据库中的其他蛋白无任
何相似性，且功能未知(图2)。
引物名称
Primer name
GeneRacer5′primer
GeneRacer5′nested primer
CBP-A1
CBP-A2
GeneRacer3primer
GeneRacer3nested primer
CBP-S1
CBP-S2
CBP-F
CBP-R
CBP-Situ1
CBP-Situ2
CBP-IF
CBP-IR
Gp-1
Gp-2
ActinF1
ActinR1
引物序列(5~3)
Primer sequence
CGACTGGAGCACGAGGACACTGA
GGACACTGACATGGACTGAAGGAGTA
AAACATTGTCTCCGACTTTCTCA
TAGTTGGGGCTCCGTTATTAGAA
TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT
CGCGGATCCTCCACTAGTGATTT
CACTATAGG
CAGGGGATGATTTAGTTGAAGGT
GCCAGAACCTCTTCCAACAATCA
ATGTCATCCTTTTTTTATTTTTTAT
TTAGTACTGTTTGCATGTCGCCTCT
GTCCTCCGACCTACCAGACGATG
GACTCCTGGACCAAGTTGAATGT
TAATACGACTCACTATAGGGAGAT
GCGAAGATGACGACG
TAATACGACTCACTATAGGGAGA
CTGGACCAAGTTGAATGTAG
TAATACGACTCACTATAGGGAGA
GACGGGAACTACAAGACA
TAATACGACTCACTATAGGGAGA
AACTCAAGAAGGACCATG
GCGGATATTTAGTTAATTGGGATAC
TTGAATTTCTTTAGGGAATTTAGAT
扩增目标
Amplification target
Me-cbp-1 5末端 Me-cbp-1 5RACE
Me-cbp-1 5末端 Me-cbp-1 5RACE
Me-cbp-1 5末端 Me-cbp-1 5RACE
Me-cbp-1 5末端 Me-cbp-1 5RACE
Me-cbp-1 3末端 Me-cbp-1 3RACE
Me-cbp-1 3末端 Me-cbp-1 3RACE
Me-cbp-1 3末端 Me-cbp-1 3RACE
Me-cbp-1 3末端 Me-cbp-1 3RACE
Me-cbp-1 cDNA全长 Me-cbp-1 cDNA full length
Me-cbp-1 cDNA全长 Me-cbp-1 cDNA full length
Me-cbp-1探针 Me-cbp-1 in situ hybridization probe
Me-cbp-1探针 Me-cbp-1 in situ hybridization probe
Me-cbp-1 dsRNA合成 Me-cbp-1 RNAi dsRNA
Me-cbp-1 dsRNA合成 Me-cbp-1 RNAi dsRNA
绿色荧光蛋白dsRNA合成 gfp RNAi dsRNA
绿色荧光蛋白dsRNA合成 gfp RNAi dsRNA
Me-actin基因片段 Me-actin gene fragment
Me-actin基因片段 Me-actin gene fragment
表 1 本研究所用的PCR引物
Table 1 PCR primers used in this study
象耳豆根结线虫纤维素结合蛋白Me-cbp-1基因的克隆与功能分析
Cloning and Functional Analysis of a Cellulose Binding Protein Gene Me-cbp-1 from Meloidogyne enterolobii 199
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Journal of Agricultural Biotechnology
2.3 Me-cbp-1表达定位
通过PCR法分别合成了地高辛标记的Me-cbp-
1基因正义单链探针和反义单链探针。杂交显色
后，反义探针信号特异的出现在象耳豆根结线虫二
龄幼虫的两个亚腹食道腺细胞，而对照正义探针无
杂交信号(图 3)，结果表明，Me-cbp-1基因在二龄幼
虫亚腹食道腺细胞特异表达。
2.4 Me-cbp-1 dsRNA沉默
通过引入T7启动子序列，体外反转录合成了
Me- cbp- 1 (404 bp)和 gfp (408 bp)同源 dsRNA片
段。象耳豆根结线虫二龄幼虫分别用Me-cbp-1
dsRNA、gfp dsRNA和清水浸泡处理 24 h后，RT-
PCR检测Me-cbp-1基因的沉默效果。结果显示，
PCR扩增30个循环时，Me-cbp-1 dsRNA、gfp dsRNA
和清水处理后都可检测出特异条带，但经Me-cbp-1
dsRNA 浸泡处理后的条带亮度明显低于 gfp
dsRNA和清水浸泡处理(图 4A)。相对应的是，非
靶标内参基因β-actin在不同处理条件下均稳定表
达(图 4B)。因此，以上结果说明，Me-cbp-1 dsRNA
特异性降低了二龄幼虫Me-cbp-1基因的表达，但并
未完全抑制。
2.5 Me-cbp-1 RNAi表型分析
将经各浸泡处理的象耳豆根结线虫二龄幼虫
接种至番茄幼苗根部，10 d后取番茄根系进行酸性
品红染色，显微镜下观察统计二龄幼虫的侵染率。
结果显示，象耳豆根结线虫二龄幼虫经Me-cbp-1
dsRNA浸泡处理后其侵染率相比对照 gfp dsRNA
处理减少约27%。其中，经Me-cbp-1 dsRNA浸泡处
理后的象耳豆根结线虫二龄幼虫平均侵染率为
26.8%，而 gfp dsRNA和不含 dsRNA的缓冲液对照
浸泡处理后的二龄幼虫平均侵染率分别为 36.4%
和36.6%，且对照之间差异不显著(表2)。
3 讨论
纤维素是植物细胞壁的主要组成成分之一，构
成了细胞壁的骨架结构。植物寄生线虫主要通过
分泌纤维素酶(β-1,4-内切葡聚糖酶)直接水解纤维
素，达到降解细胞壁的目的(Smant et al., 1998;彭焕
等, 2009; Long et al., 2013)。与纤维素酶不同的
是，纤维素结合蛋白本身并不具备纤维素水解活
性，但具有高度的纤维素亲和能力，尤其对晶体状
纤维素的降解具有至关重要的作用(Goldstein et
al., 1993; Tomme et al.,1998; Carrard et al., 2000)。
研究证实，嗜纤维杆菌(Clostridium cellulovorans)纤
维素结合蛋白能够介导纤维素酶和难溶底物的互
作亲合，在底物表面增加酶的有效浓度，从而决定
难溶纤维素的降解效率(Goldstein et al., 1993)。目
图 1 象耳豆根结线虫纤维素结合蛋白基因Me-cbp-1 cDNA及其编码氨基酸序列
Figure 1 cDNA and predicted amino acid sequence of Me-cbp-1 fromMeloidogyne enterolobii
下划线：预测信号肽序列；加粗字体：纤维素结合结构域
Single underline: Putative secretion signal peptide; Bold: Cellulose-binding domain sequence
1 tccacaatccaaaaaactttctaataaaaatcctcttctaaaATGTCATCCTTTTTTTATTTTTTATTTATTTCTGTTAGTCTTTTGATT
M S S F F Y F L F I S V S L L I
91 ATTGCTAATGCTGATGATGCTGGTAGTTATCCTTCAGGGGATGATTTAGTTGAAGGTACTACTGATGCTCGACTTCATGCGTCCTCCGAC
I A N A D D A G S Y P S G D D L V E G T T D A R L H A S S D
181 CTACCAGACGATGATGAAGAAGAGTGTGAGTGCGAAGATGACGACGAGACAACGGTCGCAACTCCCATTTCTACACGTAGCAATGGATAC
L P D D D E E E C E C E D D D E T T V A T P I S T R S N G Y
271 CCTTCTAATAACGGAGCCCCAACTAGCACTGGACGTCCTTCAAACAACGGAGGCTCAAACAATGGAGGCTCAAACAATGGAGGCCCAAGC
P S N N G A P T S T G R P S N N G G S N N G G S N N G G P S
361 TCTGTCACAGGCTCTGTTATATTGAGAGAGAAATGGGGAAACGGTGCCAATTGTATTTTGGCATTCAAAAATAATGGAAACGCTAGAGCA
S V T G S V I L R E K W G N G A N C I L A F K N N G N A R A
451 TGTGGTGTCAAGTTCGAGCTGACTCTTGGTGATAATCAAAGAATCCAAAGCATTTGGAACGTTGAGAAAGTCGGAGACAATGTTTACCGA
C G V K F E L T L G D N Q R I Q S I W N V E K V G D N V Y R
541 ATTCCGGACTACATTCAACTTGGTCCAGGAGTCGAAAACAGGGATATAGGAGTTGTCTATAATGATGTGCCAGAACCTCTTCCAACAATC
I P D Y I Q L G P G V E N R D I G V V Y N D V P E P L P T I
631 AAGGTTCTTGGACAAGAGGCGACATGCAAACAGTACTAAataaacaatatggaattttacatttattaaaagatataaaaattattaaag
K V L G Q E A T C K Q Y *
721 attgtgaatattaaaatttttggcaatttaaaaaataatggcagaatataaaatacagtgtgtaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa
200
前，在植物寄生线虫中鉴定的纤维素结合蛋白也均
表现出对纤维素较高的亲和力(Ding et al., 1998;
Gao et al., 2004)，并且在南方根结线虫(M. incogni⁃
ta)二龄幼虫的口针分泌物中检测到纤维素结合蛋
白产物MI-CBP-1，预示着纤维素结合蛋白参与到
线虫对寄主细胞壁的修饰过程(Ding et al., 1998)。
本研究获得的象耳豆根结线虫纤维素结合蛋白
Me-cbp-1含有信号肽和纤维素结合结构域，序列上
与南方根结线虫纤维素结合蛋白MI-CBP-1具有
91%的相似性，可以推测象耳豆根结线虫二龄幼虫
在侵染过程中，Me-cbp-1通过口针分泌至线虫体
外，参与寄生致病过程。
原位杂交显示，Me-cbp-1转录物在象耳豆根结
线虫二龄幼虫的 2个亚腹食道腺细胞中累积。植
图 2 象耳豆根结线虫纤维素结合蛋白Me-cbp-1与其他植物寄生线虫纤维素结合蛋白多序列比对
Figure 2 Multiple sequence alignment of Meloidogyne enterlobii cellulose binding protein Me-cbp-1 with cellulose bind⁃
ing proteins from other plant-parasitic nematodes
MA-CBP-1：花生根结线虫纤维素结合蛋白(GenBank登录号CAM33389)；MI-CBP-1：南方根结线虫纤维素结合蛋白(Gen-
Bank登录号AAC05133)；MJ-CBP-1：爪哇根结线虫纤维素结合蛋白(GenBank登录号CAM33385)；HS-CBP-1：甜菜孢囊线
虫纤维素结合蛋白(GenBank登录号ABY49997)；HG-CBP-1：大豆孢囊线虫纤维素结合蛋白(GenBank登录号AAN32887)；
HA-CBP-1：禾谷孢囊线虫纤维素结合蛋白(GenBank登录号ADD62691)。黑色背景：高度保守氨基酸残基；灰色背景：相似
氨基酸残基
MA-CBP-1 from Meloidogyne arenaria (GenBank No: CAM33389); MI-CBP-1 from M. incognita (GenBank No: AAC05133);
MJ-CBP-1 from M. javanica (GenBank No: CAM33385); HS-CBP-1 from Heterodera schachtii (GenBank No: ABY49997); HG-
CBP-1 from H. glycines (GenBank No: AAN32887); HA-CBP-1 from H. avenae (GenBank No: ADD62691). Highly conserved
residues are shaded in black, conserved substitutions are shaded in grey
处理
Treatment
Me-cbp-1 dsRNA
gfp dsRNA
不含dsRNA缓冲液
Non-dsRNA buffer
线虫接种数
Number of nematodes
used for inoculation
300
300
300
线虫侵染数
Number of penetrating
nematodes
80.4±15.8
109.4±13.0
109.8±13.8
线虫侵染率/%
Percentage of penetrating
nematodes
26.8±5.3b
36.4±4.3a
36.6±4.6a
表 2 dsRNA和无dsRNA浸泡处理象耳豆根结线虫接种10 d后的侵染数
Table 2 Number of Meloidogyne enterolobii inside the roots 10 days after being inoculated with dsRNA and non-dsRNA
treated nematodes
同列数据后不同字母表示差异显著(Duncan法, P≤0.05)
Data in the same column followed by different letters are significantly different at 0.05 level by using Duncans multiple range test
象耳豆根结线虫纤维素结合蛋白Me-cbp-1基因的克隆与功能分析
Cloning and Functional Analysis of a Cellulose Binding Protein Gene Me-cbp-1 from Meloidogyne enterolobii 201
农业生物技术学报
Journal of Agricultural Biotechnology
物寄生线虫具有3个典型的膨大食道腺细胞，包括
2个亚腹食道腺细胞和1个背食道腺细胞。食道腺
细胞分泌物能够通过口针直接释放至体外，是线虫
诱导寄主发生病变的的关键因子，在改变寄主细胞
结构、抵抗寄主防御反应、操纵寄主基因表达以及
建立取食位点等过程中发挥重要作用(Davis et al.,
2008; Hassan et al., 2010;周采文等, 2013)。研究表
明，孢囊线虫和根结线虫的亚腹食道腺细胞分泌物
主要参与到早期的寄生过程，如寄主识别、侵入寄
主以及在寄主体中的迁移，而在寄生中后期背食道
腺细胞代谢频繁，主要参与建立和维持取食位点的
形成(Davis et al., 2000)。Me-cbp-1在象耳豆根结线
虫二龄幼虫的亚腹食道腺细胞特异表达，表明纤维
素结合蛋白Me-cbp-1与早期寄生行为密切相关，
推测其在侵入寄主和在寄主体内迁移的过程中发
挥着重要作用。
本研究利用RNAi技术对象耳豆根结线虫二龄
幼虫的Me-cbp-1基因进行沉默后，导致二龄幼虫的
侵染率显著降低，原因很可能是Me-cbp-1基因的下
调表达影响了线虫对纤维素的降解能力，该结果也
进一步证实了Me-cbp-1基因在象耳豆根结线虫早
期侵染过程中的重要地位。令人感兴趣的是，大豆
孢囊线虫纤维素结合蛋白在固着性寄生阶段高丰
度表达，被认为其还参与到孢囊线虫取食细胞——
合胞体的诱导形成与维持等重要过程(Gao et al.,
2004)。甜菜孢囊线虫(H. schachtii)纤维素结合蛋白
HS-CBP-1还可以通过直接和拟南芥 (Arabidopsis
thaliana)果胶甲基酯酶 3(pectin methylesterase 3,
PME3)互作，共同修饰植物细胞壁(Hewezi et al.,
2008)。然而，在南方根结线虫和爪哇根结线虫中
克隆鉴定的纤维素结合蛋白基因都仅在寄生早期
阶段表达(Ding et al., 1998; Adam et al., 2008)，说明
根结线虫纤维素结合蛋白并未参与到巨形细胞的
诱导形成过程，这也可能与合胞体和巨形细胞在结
构上具有明显的差异相关。与孢囊线虫不同的是，
根结线虫纤维素结合蛋白N末端普遍多了一段功
能未知的氨基酸序列，该段区域与其他序列无任何
相似性，有可能在寄生过程中具有其他特殊的作
用。此外，象耳豆根结线虫纤维素结合蛋白Me-
cbp-1是否类似于甜菜孢囊线虫HS-CBP-1，能够通
过与寄主蛋白互作直接或间接参与寄主植物细胞
壁的修饰还有待进一步深入研究。
4 结论
本研究从象耳豆根结线虫中克隆了一个新的
纤维素结合蛋白基因Me-cbp-1，其编码蛋白在氨基
酸水平上与其他根结线虫的纤维素结合蛋白具有
88%~91%的相似性。保守结构域分析显示，Me-
cbp-1含有一个信号肽和一个纤维素结合结构域，
无纤维素催化结构域，属于纤维素结合蛋白的典型
特征。利用原位杂交技术，检测出Me-cbp-1在象耳
图 3 象耳豆根结线虫Me-cbp-1基因组织表达定位
Figure 3 Localization of Me-cbp-1 transcripts in Meloido⁃
gyne enterolobii
A. Me-cbp-1 反义探针杂交；B. Me-cbp-1 正义探针杂交。
SVG：亚腹食道腺细胞；M：中食道球；S：口针；标尺：50 μm
A. Nematode sections were hybridized with Me- cbp- 1 anti-
sense probe; B. Nematode sections were hybridized with Me-
cbp-1 sense probe. SVG: Subventral gland cell; M: Metacor-
pus; S: Stylet; Scale bar: 50 μm
图4 半定量RT-PCR检测Me-cbp-1(A)和β-actin(B)基因的
表达
Figure 4 Semiquantitative RT-PCR showing the expres⁃
sion ofMe-cbp-1 (A) and β-actin (B)
M：DNA分子量标记；1：Me-cbp-1 dsRNA浸泡处理；2：gfp
dsRNA浸泡处理；3：无 dsRNA缓冲液浸泡处理
M: DNA marker; 1: Pre-parasitic second-stage juveniles (pre-
J2s) of Meloidogyne enterolobii soaked in dsRNA against Me-
cbp- 1; 2: pre- J2s soaked in dsRNA against gfp; 3: pre- J2s
soaked in the soaking buffer without dsRNA
5000
2000
1000
750
403 500
300
100
bp M 1 2 3bp
5000
2000
1000
750
500
300
100
bp M 1 2 3
425
bp
A B
202
豆根结线虫二龄幼虫的亚腹食道腺细胞特异表达，
表明其转录产物具有通过口针分泌到体外参与寄
生致病过程的可能性。进一步利用RNAi技术对
Me-cbp-1基因进行沉默后，导致二龄幼虫的侵染率
下降，证实了Me-cbp-1基因在线虫寄生早期发挥了
重要作用。本研究结果为揭示象耳豆根结线虫寄
生致病机制提供了策略和理论依据，同时也为研究
利用RNAi技术控制根结线虫病害提供了新思路
和研究基础。
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(责任编辑 张丽春)
204