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蒲公英总黄酮对病毒性心肌炎小鼠心肌细胞凋亡的影响



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中相当于阴痒、带下病范畴,中医学认为其发生机
制主要系脾虚生湿,湿热下注,湿蕴生虫或外阴不
洁,邪毒内侵,虫蚀阴中所致,治以清热解毒,除湿止
痒为原则。净得康喷雾剂集中使用了白花蛇舌草、
鬼画符、大叶桉叶、苦参等药物,从而共奏清热解毒、
燥湿杀虫、止痒之功。实验结果也表明,净得康喷雾
剂对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、绿脓杆菌、大
肠杆菌、白色念珠菌等阴道感染常见的细菌具有不
同程度的抑制作用,对大鼠细菌性阴道炎、霉菌性阴
道炎也有明显的抑制作用;并能明显抑制磷酸组织
胺所致豚鼠瘙痒反应;对巴豆油诱发小鼠耳廓肿胀
也有明显的抑制作用。
[参考文献]
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[责任编辑 聂淑琴]
[收稿日期] 20101121003
[通讯作者] * 李建红,本科,博士,主管药师,从事医院药学研究,Tel:13569519195,0378-5951740,E-mail:1020312422@ qq. com
蒲公英总黄酮对病毒性心肌炎小鼠心肌细胞凋亡的影响
李建红 *
(开封市回族医院,河南 开封 475000)
[摘要] 目的:研究蒲公英总黄酮(total flavones from taraxaci herba,TF)对病毒性心肌炎小鼠心肌的保护作用。方法:100
只雄性 BALB / c 小鼠随机分为正常对照组、模型组、利巴韦林组、蒲公英总黄酮低、中、高(25,50,100 mg·kg - 1)剂量组。模型
组和给药组小鼠腹腔接种 CVB3 病毒,观察蒲公英总黄酮对模型鼠的生存率的影响,于接种第 1,3,7,9,14 天处死部分小鼠取
材,TUNEL 法观察神经元凋亡细胞数,免疫组织化学法检测半胱氨酸蛋白酶-8(caspase-8)蛋白阳性细胞数。结果:模型组细胞
凋亡率[7 d(73. 3 ± 2. 4)%;14 d(16. 3 ± 0. 1)%]明显高于对照组[7 d(1. 1 ± 0. 7)%;14 d(1. 3 ± 0. 3)%]。各时间点治疗组上
述指标较模型组显著改善,其中利巴韦林组[(7 d(18. 9 ± 2. 7)%;14 d(8. 7 ± 1. 6)%],蒲公英总黄酮中、高剂量组分别为[7 d
(31. 2 ± 2. 3)%;14 d(18. 3 ± 1. 2)%;7 d(21. 7 ± 3. 1)%;14 d(13. 1 ± 1. 4)%]。病毒接种后数天,模型组 caspase-8 阳性细胞
表达明显增加,7 d 达最高峰(27. 2 ± 1. 17)%,然后有所下降,14 d 为(9. 2 ± 1. 17)%,明显高于对照组 7 d(1. 8 ± 0. 2)%;14 d
(2. 1 ± 0. 2)%。各时间点治疗组上述指标较模型组显著改善,其中利巴韦林组[7 d(10. 12 ± 1. 15)%;14 d(2. 12 ± 1. 15)%];
蒲公英总黄酮中、高剂量组分别为[7 d(18. 3 ± 2. 7)%;14 d(4. 3 ± 2. 7)%,7 d(13. 2 ± 2. 7)%;14 d(3. 2 ± 2. 7)%]。结论:蒲
公英总黄酮能有效的抑制病毒性心肌炎小鼠心肌细胞凋亡。
[关键词] 蒲公英总黄酮;病毒性心肌炎;细胞凋亡;半胱氨酸蛋白酶-8
[中图分类号] R285. 5 [文献标识码] A [文章编号] 1005-9903(2011)10-0215-04
Effects of Total Flavones from Taraxaci Herba
on Ardiomyocyte Apoptosis in Mice with Viral Myocarditis
LI Jian-hong*
(The Hui Nationality Hospital of Kaifeng,Kaifeng 475000,China)
[Abstract] Objective:To explore the protection effects of total flavones from Taraxaci Herba(TF)on rats
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第 17 卷第 10 期
2011 年 5 月
中国实验方剂学杂志
Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae
Vol. 17,No. 10
May,2011
DOI:10.13422/j.cnki.syfjx.2011.10.074
with viral myocarditis. Method:Fifty male BAIB / c mice were randomly divided into control group,model group,
ribavirin group,TF low dose group(25 mg·kg - 1),medium dose group(50mg·kg - 1)and high dose group(100mg·
kg - 1). The mice in model group and therapy group were inoculated with CVB3. At 1 st,3 rd,7 th,9 th and 14 th d,a part
of the mice were killed,ardiomyocyte apoptosis was detected by the immunohistochemical technique and caspase-8
expression was detected by TUNEL staining method. Result:As compared with control group[(7 th d(1. 1 ±
0. 7)%;14 th d(1. 3 ± 0. 3)%],the level of ardiomyocyte apoptosis in model group[7 th d(73. 3 ± 2. 4)%;14 th d
(16. 3 ± 0. 1)%]showed elevation. These indexes were obviously improved in treatment group,ribavirin group was
[7 th d(18. 9 ± 2. 7)%;14 th d(8. 7 ± 1. 6)%]and those in TF medium,high dose groups were[(7 th d(31. 2 ±
2. 3)%;14 th d(18. 3 ± 1. 2),7 th d(21. 7 ± 3. 1);14 th d(13. 1 ± 1. 4)%]accordingly. The positive cell expression
in model group was incressed significantly after inoculation it reached the peak at 7 th d(27. 2 ± 1. 17)%,and then
declined,it was (9. 2 ± 1. 17)% on the 14 th d,which showed significantly elevation compared with control group[7 th
d(1. 8 ± 0. 2)%;14 th d(2. 1 ± 0. 2)%],All of these indexes were obviously improved in treatment groups:ribavirin
group was[7 th d(10. 12 ± 1. 15)%;14 th d(2. 12 ± 1. 15)%]and those in TF medium and high dose groups were
[7 th d(18. 3 ± 2. 7);14 th d(4. 3 ± 2. 7)],[7 th d(13. 2 ± 2. 7)%;14 th d(3. 2 ± 2. 7)%]respectively. Conclution:
TFD has a protective effect on ardiomyocyte in mice with viral myocarditis.
[Key words] total flavones from Taraxaci Herba;viral myocarditis;apoptosis;caspase-8
近年来病毒性心肌炎(viral myocarditis,VMC)
的发病率呈上升趋势,已成为临床的常见病和多发
病。VMC 的发病主要与病毒直接损伤心肌细胞、免
疫损伤及生化机制有关[1]。目前对该病的治疗仍缺
乏有效手段。蒲公英含有丰富的黄酮,具有较强的
清除自由基、抗氧化、抗炎、抗动脉粥样硬化、细胞保
护作用,以及抗菌、消炎、抗肿瘤等多种药理作用[2],
本文旨在通过观察蒲公英总黄酮对病毒性心肌炎小
鼠的保护作用及机制。
1 材料
1. 1 药物 蒲公英总黄酮(TF) 自制,精密称取
干燥粉碎过 40 目菊科植 物 蒲 公 英 Taraxacum
mongolicum Hand. Mazz 1 000 g,75%乙醇提取 3 次,
固液比30∶ 1,提取液浓缩过 D101 树脂,70% 乙醇洗
脱,浓缩冷冻干燥得总黄酮,高效液相色谱仪(岛
津)检测纯度为 91. 3%,以无菌 0. 9%氯化钠溶液配
制成不同浓度。
1. 2 病毒 CVB3Nancy 株和 Hela 细胞株均由郑州
大学提供,CVB3Nancy 株在 Hela 细胞中传代,冻融
离心 3 次,上清液分装,Hela 细胞测 50% 组织感染
率(TCID50)为 10
- 6。
1. 3 动物 Balb / c 雄性小鼠,3 ~ 4 周龄,体重
(13 ~ 20)g,由郑州大学动物实验中心提供,动物许
可证号豫动字 P0010003。
1. 4 试 剂 与 仪 器 兔 多 抗 caspase-8 (批 号
20071007)、原位末端标记(Tunel)检测试剂盒(批号
20081021):武汉博士德生物工程有限公司;奥林巴
斯荧光显微镜、显微镜:奥林巴斯公司。
2 方法
2. 1 半数有效率 (ED50)的测定 140 只雄性
BALB / c 小鼠随机分成蒲公英总黄酮(5,25,50,75,
95,115 mg·kg - 1)剂量组和模型组,每组 20 只,各组
ip 含 CVB3Nancy 病毒 1 × 10
- 6 /mL 的 MEM Eagle 液
0. 1 mL /只,接种 CVB3 2 h 后蒲公英总黄酮组按照
0. 01 mL·g - 1剂量 ig,其余则每日给予相应剂量的生
理盐水 ig,2 次 / d,给药 14 d 后处死,无菌取心脏,左
心室中、下 1 /3 心室肌,置 5. 4%甲醛固定 24 h。常规
梯度乙醇脱水、透明、浸蜡、包埋、连续冠状切片,HE
染色,观察心肌病理变化并计算各组小鼠 14 d 生
存率。
2. 2 分组及给药方法 240 只雄性 BALB / c 小鼠,
随机分为正常对照组、模型组、利巴韦林组(50 mg·
kg - 1),蒲公英总黄酮低(25 mg·kg - 1)、中(50 mg·
kg - 1)、高(100 mg·kg - 1)剂量组,每组 40 只。除正
常对照组,其余各组腹腔 ip 含 1 × 10 - 6 TCID50·mL
- 1
MEM Eagle 液 0. 1 mL;对照组 ip 不含 CVB3 的 MEM
Eagles 液 0. 1 mL[3],给药 14 d。病毒接种后第 1,3,
7,9,14 天除正常对照组,各组随机抽取 6 只小鼠,
正常对照组第 14 天作为总体对照,无菌取心脏,置
5. 4%甲醛固定 24 h。常规梯度乙醇脱水、透明、浸
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2011 年 5 月
中国实验方剂学杂志
Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae
Vol. 17,No. 10
May,2011
蜡、包埋、连续冠状切片,备用。
2. 3 心肌病理组织学检查 光镜观察 14 d 后处死
小鼠心肌病理变化,按 Rezkalla 的方法计算心肌病
理组织学积分,即每张切片随机取 6 个高倍视野,计
算每个视野中整个心肌切片面积之比:无病变计 0
分,病变面积 < 25%,计 1 分,25% ~ 50% 计 2 分,
51% ~ 75%计 3 分,> 75%计 4 分[4]。
2. 4 原位末端标记(TUNEL)染色 用 TUNEL 方法
检测给药 7 d,14 d 后处死小鼠心肌凋亡细胞的
DNA 片段,在荧光显微镜下计数凋亡细胞,每张切
片随机选取 5 个视野(× 400 倍),记数凋亡阳性细胞,
棕黄色颗粒者为阳性细胞,即凋亡的细胞,以凋亡指
数(apoptosis index,AI)反映各组心肌凋亡情况。
AI =视野内凋亡细胞个数 /视野内所有心肌细胞个数
× 100%
2. 5 caspase-8 蛋白的检测 采用免疫组化法检测
给药 1,3,7,9,14 d 后处死小鼠心脏组织切片。心
肌细胞质黄色或棕黄色为阳性细胞,在高倍镜下(×
400),取每张切片中梗死灶区域相互不重叠 4 个视
野,采用 Meta Morph 图像分析系统,记录 caspase-8
蛋白积分吸光度(A)。
2. 6 统计学方法 用 SPSS13. 0 统计软件进行数据
的统计学处理,结果用 珋x ± s 表示,组间比较用 t 检验,
多组间比较采用方差分析,P < 0. 05 有统计学意义。
3 结果
3. 1 半数有效率 ED50的测定 由表 1 可知,伴随蒲
公英总黄酮剂量的加大,小鼠死亡率减少,均可以显
著减少心肌组织坏死(P < 0. 05,P < 0. 01),对数剂量-
概率单位回归法得回归方程 Y = 0. 87 + 0. 683X
(r = 0. 998),有剂量-效应关系,其 ED50 = 57 mg·kg
- 1。
表 1 蒲公英总黄酮对 CVB3 病毒感染小鼠生存率及
心肌坏死程度的影响(珋x ± s)
组别
剂量
/mg·kg - 1
生存率
/%
心肌组织坏死
积分 /分
模型 - 22. 1 1. 89 ± 0. 61
蒲公英总黄酮 5 39. 7 1. 21 ± 0. 54
25 57. 0 0. 84 ± 0. 68
50 76. 1 0. 61 ± 0. 491)
75 83. 7 0. 24 ± 0. 411)
95 92. 0 0. 19 ± 0. 372)
115 100 0. 18 ± 0. 422)
注:与模型组比较1)P < 0. 05,2)P < 0. 01(表 2 ~ 4 同)。
3. 2 CVB3 对小鼠累积死亡率的影响 模型组小
鼠于感染第 3 天开始发病,行动迟缓,毛色灰暗,感
染后第 3 天开始死亡,第 7 天进入死亡高峰,药物治
疗组死亡时间推迟到第 7 天,并出现体质量减轻,尾
部缺血、坏死等外周组织缺血、缺氧症状和体征,而正
常对照组无 1 例死亡。第 9 天开始,死亡数下降,症
状不断改善,第 14 天各组小鼠均无死亡,药物治疗组
小鼠与模型组比较外周组织缺血明显改善,死亡率明
显降低(P < 0. 05,P < 0. 01),呈剂量效应关系。见
表 2。
表 2 蒲公英总黄酮对各组小鼠染毒
第 14 天存活率的影响(n = 40)
组别
剂量
/mg·kg - 1
存活数
/只
存活率
/%
正常对照 - 40 1002)
模型 - 8 20
利巴韦林 50 37 92. 52)
蒲公英总黄酮 25 24 60
50 32 801)
100 36 902)
3. 3 蒲公英提取物对病毒性心肌炎心肌细胞凋亡
的影响 病毒感染第 7 天模型组细胞凋亡率与对照
组相比,明显增多(P < 0. 05),这可能与小鼠感染病
毒后,免疫介导细胞溶解有关。药物治疗组的小鼠
细胞凋亡率与模型组的比较,均明显下降(P <
0. 05,P < 0. 01),说明治疗药物对病毒性心肌炎心
肌细胞凋亡具有抑制作用,并存在着一定的量效关
系。从第 7 天开始,细胞凋亡率开始下降,病毒开始
从体内清除,大多数动物康复。但由于病毒不存在
的情况下,炎症过程还可持续数周、数月,因此第 14
天,模型组小鼠的凋亡率较高,相对于药物治疗组,
药物治疗组细胞凋亡率明显下降,这可能与黄酮的
药效有一定的联系。见表 3。
表 3 蒲公英提取物对病毒性心肌炎
心肌细胞凋亡的影响(珋x ± s,n = 6)
组别
剂量
/mg·kg - 1
凋亡指数 /%
7 d 14 d
正常对照 - 1. 1 ± 0. 72) 1. 3 ± 0. 31)
模型 - 73. 3 ± 2. 4 16. 3 ± 0. 1
利巴韦林 50 18. 9 ± 2. 72) 8. 7 ± 1. 61)
蒲公英总黄酮 25 43. 2 ± 2. 1 27. 3 ± 0. 6
50 31. 2 ± 2. 31) 18. 3 ± 1. 21)
100 21. 7 ± 3. 12) 13. 1 ± 1. 42)
3. 4 蒲公英提取物对病毒性心肌炎心肌 caspase-8
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李建红:蒲公英总黄酮对病毒性心肌炎小鼠心肌凋亡的影响
的影响 模型组阳性细胞表达与对照组比较,数量
明显增加(P < 0. 05,P < 0. 01),第 7 天阳性表达达
到最高峰,此时可能与病毒急性感染期有关,相对于
不同剂量的药物治疗组,药物治疗组阳性细胞表达
明显下降(P < 0. 05,P < 0. 01),说明蒲公英提取物
对病毒性心肌炎均具有显著的抑制作用,能明显抑
制 caspase-8 表达,且存在着一定的量效关系。从第
7 天开始,各组阳性表达开始下降,这可能与病毒感
染慢性期有关,药物组的阳性表达相对于模型组下
降更加明显(P < 0. 05,P < 0. 01),这与蒲公英黄酮
的药效有一定的联系。见表 4。
表 4 蒲公英总黄酮对病毒性心肌炎心肌 caspase-8 的影响(珋x ± s,n = 6)
组别
剂量
/mg·kg - 1
caspase-8 阳性表达率 /%
1 d 3 d 7 d 9 d 14 d
正常对照 - 1. 6 ± 0. 11) 1. 8 ± 0. 21) 1. 8 ± 0. 22) 1. 9 ± 0. 11) 2. 1 ± 0. 22)
模型 - 4. 7 ± 1. 21 13. 7 ± 1. 37 27. 2 ± 1. 17 13. 4 ± 1. 36 9. 2 ± 1. 17
利巴韦林 50 2. 12 ± 1. 131) 4. 39 ± 1. 541) 10. 12 ± 1. 152) 7. 12 ± 1. 642) 2. 12 ± 1. 151)
蒲公英总黄酮 25 3. 9 ± 1. 31 9. 7 ± 1. 51 24. 1 ± 2. 1 10. 6 ± 1. 51 6. 1 ± 2. 1
50 2. 34 ± 1. 23 7. 21 ± 1. 31 18. 3 ± 2. 71) 9. 3 ± 1. 351) 4. 3 ± 2. 71)
100 2. 36 ± 1. 651) 5. 69 ± 1. 941) 13. 2 ± 2. 72) 8. 3 ± 1. 372) 3. 2 ± 2. 72)
4 讨论
细胞凋亡是细胞自杀过程,是保证细胞正常生
长和维持稳态的重要条件,其目的是去除各种异常、
受损和癌变的细胞,是对各种应激如生长因子缺乏、
细胞因子释放、DNA 损伤、细胞周期功能异常、癌基
因激活等的正常反应。病毒感染后所致心肌细胞凋
亡是引起心肌细胞丢失,最终导致心功能障碍的重
要机制。本研究中,正常对照组中有少量的凋亡细
胞,治疗组的凋亡阳性细胞数较对照组增多,但较模
型组减少,且高剂量组减少最为明显,提示蒲公英提
取物均能够抑制细胞凋亡,达到保护心肌细胞的
作用。
细胞凋亡的发生是一个主动过程,它依赖于大
分子物质合成,caspase 家族被认为是细胞凋亡不可
逆的进入最后实施阶段的关键分子,其中 caspase-8
是研究较多的 caspase 蛋白酶,属上游起始 caspase,
在死亡受体介导的细胞凋亡过程中扮演着重要角
色,本研究表明,模型组 caspase-8 大量的表达,通过
不同剂量蒲公英提取物治疗,不同剂量治疗组
caspase-8 阳性细胞数均明显减少,表明蒲公英提取
物对病毒性心肌炎促凋亡基因表达产生了积极的抑
制作用,对心肌细胞损伤产生保护作用。
综上所述,蒲公英提取物能减少病毒性心肌炎
心肌细胞凋亡,这可能与抑制 caspase-8 蛋白的表达
有关。
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[责任编辑 聂淑琴]
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