全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2012, 38(10): 18181826 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn
本研究由国家自然科学基金项目(31071406)和江苏省普通高校研究生科研创新计划项目(2011-997)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 陈建民, E-mail: jmchen@yzu.edu.cn, Tel: 0514-87979286
第一作者联系方式: E-mail: gjy19871013@126.com, Tel: 0514-87979286
Received(收稿日期): 2012-02-23; Accepted(接受日期): 2012-06-06; Published online(网络出版日期): 2012-07-03.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20120703.0858.201209.0_015.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2012.01818
基于抑制消减杂交开发长穗偃麦草(Lophopyrum elongatum)特异分子
标记
葛江燕 陈士强 高营营 高 勇 朱 雪 黄泽峰 陈建民
扬州大学生物科学与技术学院, 江苏扬州 225009
摘 要: 分别以二倍体长穗偃麦草和普通小麦中国春的基因组 DNA 作实验组和对照组, 运用抑制消减杂交(SSH)技
术去除 2 个基因组 DNA 之间的同源序列, 获得长穗偃麦草特异的 DNA 片段构建的单向抑制消减文库, 并对随机克
隆测序。根据测序结果设计引物, 获得 36个长穗偃麦草基因组特异分子标记 , 成功率高达 69.2%。这些标记均能在
具有长穗偃麦草 E 染色体的不同小麦背景和不同世代中稳定表现, 可用于小麦背景中跟踪长穗偃麦草染色体或片
段。
关键词: 普通小麦; 长穗偃麦草; 基因组特异分子标记; SSH
Development of Genome-Specific Molecular Markers for Lophopyrum elonga-
tum Based on Suppression Subtractive Hybridization
GE Jiang-Yan, CHEN Shi-Qiang, GAO Ying-Ying, GAO Yong, ZHU Xue, HUANG Ze-Feng, and CHEN
Jian-Min*
College of Bioscience and Biotechnology, Yangzhou University, Yangzhou 225009, China
Abstract: The unidirectional subtracted library of the tester Lophopyrum elongatum (2n=2x=14, EE) and the driver wheat (Triti-
cum aestivum cv. Chinese Spring, 2n=6x=42, AABBDD) was constructed by suppression subtractive hybridization (SSH) method
to remove the homologous sequences and enrich the difference of sequences between L. elongatum and Chinese Spring. After
cloning and sequencing the specific fragments of L. elongatum, we obtained 36 genome-specific molecular markers of L. elonga-
tum with the efficiency of 69.2%. These markers could be stably inherited in different wheat backgrounds and different hybrid
generations with L. elongatum chromosomes, indicating that they are applicable in the detection of chromosomes or chromosomal
fragments of L. elongatum in wheat background.
Keywords: Triticum aestivum; Lophopyrum elongatum; Genome-specific molecular marker; Suppression subtractive hybridiza-
tion
小麦 (Triticum aestivum)是世界上种植面积最
大、总产量仅次于玉米的粮食作物。20世纪中期以
来, 品种改良的成果使小麦单产和总产不断提高。
在育种过程中频繁地使用少数几个亲本, 使小麦品
种的遗传组成趋向单一化, 势必减少小麦的遗传变
异[1]。从小麦野生近缘种中获取抗病、抗逆境的有
利基因, 扩大小麦育种的基因库已经成为小麦遗传
育种学家的共识, 如已成功地进行了小麦与大赖草
(Leymus racemosus) 、 长 穗 偃 麦 草 (Lophopyrum
elongatum)、中间偃麦草 (L. intermedium)、黑麦
(Secale cereale)、簇毛麦(Haynaldia villosa)等近缘种
的杂交, 并获得了一些抗赤霉病的材料[2]。
长穗偃麦草是禾本科小麦族偃麦草属植物, 其
E基因组与小麦 A、B、D基因组的遗传分化程度相
对较小。该物种生长繁茂、多花多实, 具有抗多种
小麦病害(赤霉病、锈病、白粉病、黄矮病等)和抗
寒、耐盐碱、耐干旱以及高蛋白等许多优良性状, 是
小麦遗传改良不可多得的优异外源基因供体[3]。我
第 10期 葛江燕等: 基于抑制消减杂交开发长穗偃麦草(Lophopyrum elongatum)特异分子标记 1819
国科学家李振声、陈溯阳等通过普通小麦与长穗偃
麦草杂交, 先后育出了小偃 4号、小偃 5号、小偃 6
号等系列优良品种, 充分证明长穗偃麦草在小麦遗
传改良中的重要作用[4]。通常, 远缘杂交后通过常规
选择方法获得具有偃麦草属有利基因的小麦个体难
度大、周期长。随着分子生物学技术的发展, 借助
DNA 分子标记可直接检测外源遗传物质的存在及
基因组水平的差异。目前, 分子标记已经在种质资
源的鉴定、遗传多样性分析、遗传图谱的构建、分
子标记辅助育种及基因克隆等领域得到了应用。开
发长穗偃麦草特异的分子标记, 对于从小麦背景中
检测长穗偃麦草染色质快捷有效, 如明确这些分子
标记与长穗偃麦草中相关抗性基因的连锁关系, 则
作为标记可在小麦育种中利用长穗偃麦草优良基因
时进行辅助选择而提高选择效率。长穗偃麦草的 1E
染色体[5-6]和 7E染色体上均发现有较强的抗赤霉病
基因[7-10]。通过 1E 和 7E 染色体特异分子标记进行
辅助选择, 将有利于提高利用长穗偃麦草的抗赤霉
病基因进行小麦抗赤霉病育种的效率。开发有效的
长穗偃麦草特异分子标记将是标记辅助选择的重要
前提, 目前, 已利用 RGAP[11]、RFLP[12]、RAPD、
SSR[13-15]和 AFLP[16]标记技术开发了一些长穗偃麦
草特异分子标记, 但均存在效率不高、标记数量有
限、稳定性不好等缺点。因此, 开发更多且稳定的
长穗偃麦草特异分子标记对于利用长穗偃麦草进行
小麦遗传改良具有重要作用。
抑制消减杂交(suppression subtractive hybridi-
zation, SSH)是以 mRNA差别显示技术为基础, 将消
减杂交与抑制 PCR相结合抑制非目的基因片段扩增
而选择性扩增目的基因片段的技术[17-19]。SSH 技术
特别适合于分离植物发育阶段转型前后, 个体内不
同器官之间, 以及受环境因子影响较大的差异表达
基因[20]。如小麦在逆境胁迫条件下对细胞保护作用
的有关基因 [21], 与能量和初级代谢相关的基因 [22],
与信号转导、转录调控等相关基因[23]。依据该技术
的原理, 本研究以二倍体长穗偃麦草基因组 DNA 为
实验组, 普通小麦中国春基因组 DNA 为对照组, 通
过 2 轮消减杂交可去除实验组和对照组之间的同源
序列而获得丰度较低的差异片段, 这些差异片段可
视为长穗偃麦草DNA特异片段, 在其两侧连接不同
序列的接头, 再结合 2 轮抑制性 PCR 的富集, 能高
效地扩增出长穗偃麦草特异 DNA片段。经回收、测
序, 最后转化成长穗偃麦草基因组特异分子标记。
这些标记可以用来检测小麦背景中的长穗偃麦草染
色质, 为利用长穗偃麦草进行小麦抗病以及抗逆境
育种的分子标记辅助选择提供坚实的基础。此外 ,
该研究可为小麦育种中快速便捷检测外源染色质的
分子标记开发提供借鉴。
1 材料与方法
1.1 植物材料及其 DNA提取
普通小麦中国春、二倍体长穗偃麦草(EE)、中
国春-长穗偃麦草二体附加系(DA1E、DA2E、DA3E、
DA4E、DA5E、DA6E 和 DA7E)和长穗偃麦草代换
系[DS3E(3D)、DS3E(3A)、DS7E(7A)], 以上材料由
加拿大农业部 Fedax博士惠赠。扬麦 158、扬麦 16、
宁麦 13、0425、扬麦 14和安农 8455由江苏省里下
河地区农业科学研究所程顺和院士提供。以长穗偃
麦草不同代换系与普通小麦品种进行杂交, 其中代
换系 DS3E(3D)与安农 8455杂交, 代换系 DS3E(3A)
和 DS7E(7A)分别与扬麦 16杂交。
供试材料生长至二叶一心期, 以改良后的 SDS
法[24]提取基因组 DNA。
1.2 引物设计
根据 NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore)
公布的 18S rRNA基因的核苷酸序列(GenBank登录号
为 HQ870412.1), 在 2个 Rsa I位点间序列设计引物
18S-254, 其序列分别为 F: 5′-GCTCTGGATACA
TTAGCATGGGATA-3′和 R: 5′-TCGGCATCGTTTAT
GGTTGAG-3′, 扩增片段长度为 254 bp, 该扩增片
段可在构建文库时检测连接效率和消减效率。依据
试剂盒(PCR-Select cDNA Subtraction Kit, Clontech)
提供的接头 1 (adaptor 1) 和接头 2R (adaptor 2R)序
列设计 3个引物, 即 PCR primer 1 (5′-CTAATACGA
CTCACTATAGGGC-3′)、Nest primer 1 (5′-TCGAGC
GGCCGCCCGGGCAGGT-3′)和 Nest primer 2 (5′-A
GCGTGGTCGCGGCCGAGGT-3′)。
1.3 SSH文库构建
1.3.1 DNA 酶切和连接 通过 Rsa I酶(Clontech)
对长穗偃麦草、中国春小麦的基因组DNA进行酶切,
酶切反应总体积 50 μL, 37℃温育 24 h, 中间补加一
次 Rsa I 1.5 μL。将长穗偃麦草的酶切产物分别与接
头 1、接头 2R 连接, 检查连接产物的连接效率, 按
PCR-Select cDNA Subtraction Kit说明书对连接产物
进行 2轮消减杂交和 2轮 PCR扩增。
1.3.2 消减杂交 第 1 轮消减杂交是将具有接头
1820 作 物 学 报 第 38卷
1 和接头 2R 连接的长穗偃麦草 Rsa I 酶切基因组
DNA分别与中国春小麦 Rsa I酶切基因组 DNA (100
ng μL1)混合, 完成杂交后立即进入第 2轮。在无菌
PCR 管中混合变性后的中国春小麦 Rsa I 酶切基因
组 DNA 和第 1 轮杂交产物, 68℃温育 24 h 后加入
200 μL 稀释液 , 68℃ 7 min 终止非特异性杂交 ,
20℃保存。
1.3.3 抑制性 PCR 扩增 取稀释后的第 2轮消减
杂交产物、未消减杂交对照 DNA分别加至无菌 PCR
管中进行第 1轮抑制性 PCR。首先在 72℃作用 5 min
以补平接头, 紧接着, 94℃ 2 min; 94℃ 45 s, 66℃ 45
s, 72℃ 1.5 min, 28个循环; 72℃ 5 min。取第 1轮 PCR
产物稀释 10 倍后作为第 2 轮 PCR 的模板。反应体
系中除以 Nest primer 1和 Nest primer 2 (10 μmol L1)
替换 PCR primer 1外, 其他成分相同。第 2轮 PCR
程序为 94℃ 2 min; 94℃ 45 s, 68℃ 45 s, 72℃ 1.5
min, 15个循环; 72℃ 5min。用 2%琼脂糖电泳检测
扩增产物。其余样品保存于20℃。扩增反应在
Eppendorf梯度 PCR仪(Mastercycler pro)中完成。
1.3.4 消减杂交效率 取稀释 10 倍后的消减杂
交与未消减杂交对照的 2 轮 PCR 产物, 加入引物
18S-254 F 和 18S-254 R, 扩增程序为 94℃ 5 min;
94℃ 45 s, 50℃ 1 min, 72℃ 1.5 min, 18个循环; 取出
5 μL 产物后剩余样品继续进行 5 个循环, 再取出 5
μL产物, 照此每 5 个循环重复一次 , 直至 38个循
环。以 2%琼脂糖凝胶电泳检查所有扩增进程的 PCR
结果。
1.3.5 消减片段的连接反应 将经过消减后的第
2 轮 PCR 产物与 pMD18/19-T 载体(TaKaRa, Code
D102A)连接。以连接产物转化感受态大肠杆菌(E.
coli), 蓝白斑筛选构建抑制消减杂交文库。
1.4 长穗偃麦草标记开发和稳定性检验
挑取单个白色菌落, 利用引物 Nest primer 1和
Nest primer 2进行菌落 PCR。PCR程序为 94℃ 5 min;
94℃ 45 s, 68℃ 1 min, 72℃ 1.5 min, 35个循环; 72℃
10 min。用 2%琼脂糖电泳检测 PCR产物。
根据菌落 PCR的结果, 选择大小合适的阳性克
隆测序, 将测序结果与已公布的小麦基因组序列比
对, 选择与小麦近缘物种同源性高或与小麦同源性
低的序列设计引物, 对长穗偃麦草的 7个附加系和 6
个小麦品种进行 PCR扩增, 根据扩增结果获得稳定
的基因组特异分子标记。选择特异分子标记
MEG-1303检验长穗偃麦草代换系与普通小麦的杂种
F1~F3代, 以验证标记的稳定性。
2 结果与分析
2.1 实验组酶切片段与接头连接效率
长穗偃麦草和中国春小麦基因组 DNA经 Rsa I
酶切后的电泳结果显示, 未消化的基因组DNA位于
凝胶加样孔的顶端, 表明提取的基因组DNA没有发
生降解, 质量较好。而消化后的基因组 DNA则表现
为小于 2 500 bp弥散的片段, 酶切后 DNA片段集中
在 200~2 000 bp, 和预期结果一致。将酶切后的实验
组 DNA片段与接头 1和接头 2R连接得到实验组-1
和实验组-2。
以 18S rRNA 为参照基因, 利用其特异性引物
18S-254 F和 18S-254 R, 在实验组-1和实验组-2中
扩增出长度为 254 bp 的片段, 而对具接头的片段,
而利用 PCR primer 1和 18S-254 F可扩增出 850 bp
左右的片段, 从 2 种长度片段的亮度比较可反映连
接效率。以实验组-1 和实验组-2 为模板, 用引物
PCR primer 1和 18S-254 F获得 850 bp左右的片段,
表明连接成功。该产物的亮度相当于 18S-254 F 和
18S-254 R 扩增所得产物的亮度的 1/4, 符合试剂盒
中连接效率的标准, 表明酶切产物与接头的连接效
率满足要求(图 1-A)。
2.2 两轮抑制性 PCR及消减效率
以长穗偃麦草和中国春小麦基因组 DNA 经消
减杂交和未消减杂交的产物和未经消减杂交的产物
为模板分别进行 2 轮 PCR, PCR 产物均呈现连续的
弥散型条带 (图 1-B) , 消减组产物主要分布在
150~2 000 bp的范围内 , 与酶切产物的片段大小相
近, 而在弥散的条带中还有一些较集中的扩增条带,
应为实验组中特有的差异片段。经第 2轮 PCR扩增,
其产物浓度高于第 1轮 PCR。说明经过 2次 PCR使
差异片段特异性扩增, 从而得到富集。
以消减组的 PCR 产物和未消减组的 PCR 产物
为模板, 利用引物 18S-254 F和 18S-254 R进行消减
效率的分析。未消减组在 18 个循环即出现 254 bp
的特异性条带, 而消减组在 23个循环才表现 254 bp
的特异性条带(图 2), 说明本研究的消减效率较高。
2.3 消减文库的构建
通过热激法转化感受态大肠杆菌, 共挑取 454
个白色菌落构建抑制消减文库。图 3-A 为部分菌落
PCR结果, 插入片段大小不等, 其范围为 150~2 000
bp, 消减文库构建成功, 可用于长穗偃麦草特异片
段的测序分析。
第 10期 葛江燕等: 基于抑制消减杂交开发长穗偃麦草(Lophopyrum elongatum)特异分子标记 1821
图 1 酶切片段与接头的连接效率及两轮 PCR 结果
Fig. 1 Ligation efficiency of digestion fragments with adapters and products after two rounds of PCR
照片 A中, M: DL2000; 1: 扩增引物为 PCR primer 1/18S-254 F; 2: 扩增引物为 18S-254 F/18S-254 R。照片 B中, M: DL2000; 第 1轮
PCR的引物为 primer 1, 第 2轮 PCR的引物为 Nest primer 1和 Nest primer 2。1: 消减后; 2: 未消减。
In panel A, M: DL2000; 1: Amplification with primer pair PCR primer 1/18S-254 F; 2: Amplification with primer pair 18S-254 F/18S-254 R.
Tester-1: digested DNA fragments ligated to adaptor 1; Tester-2: digested DNA fragments ligated to adaptor-2R. In panel B, M: DL2000;
primary PCR was conducted with primer 1, and second PCR was conducted with Nest primers 1 and 2. 1: PCR products after subtraction;
2: PCR products without subtraction.
图 2 消减杂交的效率
Fig. 2 Efficiency of subtractive hybridization
M: DL2000; 1~5: 消减后 2轮 PCR产物, 扩增循环数依次为 18、23、28、33和 38; 6~10: 未消减 2轮 PCR产物, 扩增循环数依次为
18、23、28、33和 38。
M: DL2000; 1–5: Two rounds of PCR products after subtraction with amplification cycles of 18, 23, 28, 33, and 38, respectively; 6–10: Two
rounds of PCR product without subtraction with amplification cycles of 18, 23, 28, 33, and 38, respectively.
图 3 消减文库克隆(A)及基因组特异分子标记(B)
Fig. 3 PCR-amplified differential clone inserts from the subtractive library (A) and genome-specific molecular marker (B)
照片 A中, M: DL2000; 1~14泳道为不同克隆。照片 B中, M: DL2000; 1~7泳道依次为中国春–长穗偃麦草附加系 DA1E、DA2E、DA3E、
DA4E、DA5E、DA6E和 DA7E; 8泳道为二倍体长穗偃麦草; 9~14泳道依次为普通小麦中国春、扬麦 158、扬麦 16、宁麦 13、0425
和扬麦 14。
In panel A, M: DL2000; lanes 1–14 were loaded with different clones. In panel B, M: DL2000; lanes 1–7 were loaded with PCR products
from template DNAs of Chinese Spring-Lophopyrum elongatum addition lines DA1E, DA2E, DA3E, DA4E, DA5E, DA6E, and DA7E, re-
spectively; lane 8 was loaded with PCR product from template DNA of L. elongatum (EE); and lanes 9–14 were loaded with PCR products
from template DNAs of wheat varieties Chinese Spring, Yangmai 158, Yangmai 16, Ningmai 13, 0425, and Yangmai 14, respectively.
1822 作 物 学 报 第 38卷
2.4 基因组特异分子标记
随机挑取 55 个插入片段在 400 bp 以上的克隆
进行测序, 并对测序结果进行网上比对(http://blast.
ncbi.nlm.nih.gov/), 去除 90%以上区段与小麦同源
性大于 90%的 8 条序列, 以 90%以下区段与小麦具
有不同程度同源性的 47 条序列设计了 52 对引物。
对 7个附加系、二倍体长穗偃麦草(EE)和 6个普通小
麦品种进行 PCR 扩增, 图 3-B 为引物 MEG-2301的扩
增结果, 共获得 36个长穗偃麦草基因组特异分子标
记(表 1)。以测序的克隆计算 , 开发标记的成功率
表 1 长穗偃麦草基因组特异分子标记的引物序列
Table 1 Primer sequences of genome-special molecular markers for L. elongatum
序列 Sequence (5′–3′) 序号
Series No.
引物 1)
Name of primer 1) 正向 Forward 反向 Reverse
扩增的染色体 2)
Amplified chromosome 2)
1 MEG-1303 TGGATGGTGGCTGCTGAT CCGTTATGCTGCCCGATT 1E–7E (7)
2 MEG-1258 ACCAGCGGTAGCCCAGTCT ATCTGTGCGATTTCCCTA 1E–7E (7)
3 MEG-1253 CCAGCGGTAACCCAGTCT AGTGCGATTTCCCTGACG 5E, 7E (2)
4 MEG-1211 GCTCATCAACAGCCTACC TGTGACTTTCCCACCATT 1E–7E (7)
5 MEG-1242 GAAAGGCTCCGAGAACAC GTCAAAGGCTTAGCAATC 1E–7E (7)
6 MEG-1177 TTGGGCTCAAGAACATTA GGCAGGTACGACACCTAT 1E–7E (7)
7 MEG-2301 TGTGCTGAGCCCGAAGAT TGGAACGGATGAAGACCC 1E–7E (7)
8 MEG-2249 GCCGACTCAGGAGGTGTT TTGCATCCGTTGGTATTG 1E–7E (7)
9 MEG-2304 TGTCCCACCATTGAGCAG CCGGGCAGGTTAGACTATA 2E, 4E, 5E, 6E, 7E (5)
10 MEG-2237 CAGTGGCTTGTCAGAGTT CGTAGCAGGATGGTTAGA 2E, 3E, 4E, 5E, 6E, 7E (6)
11 MEG-2422 GCTTGCGTCATCTCCTTC TGATATGCCACTTCTCCTC 4E, 5E, 7E (3)
12 MEG-2407 TTAGTTAGGCAGTAGAGCA CGACAAAGTAAGGTGGTG 1E–7E (7)
13 MEG-2371 TGGGTAATGCCCGTCCTC TCTGAATGTTTCCGCTTGT 1E–7E (7)
14 MEG-3258 ATAGGGTTGCCAGTGAGGAG GATTCATCATTTCCCATAGAG 1E–7E (7)
15 MEG-3273 TTTACAAGGTGAAGGTCT CATTGCGGACTATGATTT 1E–7E (7)
16 MEG-3236 AGTGGCTTGTCAGAGTTG CGTAGCAGGATGGTTAGA 1E–7E (7)
17 MEG-3239 TGCGATTTCCCTGTCATT TCCCAGCCAGATCAAGAG 1E–7E (7)
18 MEG-3254 ATCTGTGCGATTTCCCTG GCGGTAGCCAAGTCTGGT 1E–7E (7)
19 MEG-3253 CCAGCGGTAACCCAGTCT AGTGCGATTTCCCTGACG 1E, 2E, 4E, 5E, 6E, 7E (6)
20 MEG-3293 TGTTCACTCAGCCATCTC ATCAACTTCAGCATCTTTA 1E–7E (7)
21 MEG-3267 AGGGGCAACAAGGATAAG TACACTACCGACGAGCAG 1E–7E (7)
22 MEG-3367 ATGAGCCCAGTTGAGTTGTTT TACTATGGTTGACCACCTAAAGAG 1E–7E (7)
23 MEG-3211 GCTCATCAACAGCCTACC TGTGACTTTCCCACCATT 1E–7E (7)
24 MEG-4265 TAACGCCGACACTTAGGA GGAAACCCAGGGACATCA 1E–7E (7)
25 MEG-4253 CCTTGTGAGCCCAGTTAT GCAGGTTCTTCCACCATTA 1E–7E (7)
26 MEG-4268 GCTTGCGTCATCTCCTTC TTCGGTCATAGTTGCTCTTC 1E–7E (7)
27 MEG-4280 CCGTCTGTTACTCCATCG CTCTGAAGCGGCGTCTGC 1E–7E (7)
28 MEG-4353 CCTTGTGAGCCCAGTTAT GCAGGTTCTTCCACCATTA 1E–7E (7)
29 MEG-4483 ATCCCAATCTCAAATCAAG TCAAATACTCAGCACGAAT 2E, 3E, 5E, 7E (4)
30 MEG-5350 CCCCAGGCAGAGGAACTA CCCGGGCAGGTACATCTC 1E, 3E, 4E, 5E, 6E, 7E (6)
31 MEG-5385 CAATCTCGGAGCCATCAT GGCCAGGTTCACATAAGG 5E (1)
32 MEG-5260 CATCTTCAGCGGTCTTGC CGAGCGTGTTGGGTAAGT 1E, 2E, 3E, 4E, 5E, 7E (6)
33 MEG-5377 AAGTCAAGGCTGTCCCATA ACTTTTCCCATGCTCACA 1E–7E (7)
34 MEG-5254 ATTGAGCCTGCCGTAGAG GTCATTGAGCGTATCCTGTT 1E–7E (7)
35 MEG-5456 TCGCTGTCGTGCTTATCT TGTATTTGGTGTTCCCTCC 1E–7E (7)
36 MEG-5333 TTTGTGACGAAGAGGAGCAT GCCCGTAGACAGGAGAAGT 1E–7E (7)
1) 引物名称中的字母和数字依次表示分子标记(M)、二倍体长穗偃麦草(E)、基因组(G)、测序批次(1~5)和扩增片段大小。2) 括
号中数字表示扩增的染色体数目。
1) Primers are named with orderly letters and figures, which represent for molecular marker (M), L. elongatum (E), genome (G), se-
quencing batch (1–5), and size of the amplified segment. 2) The number of E chromosomes amplified is given in the parenthesis.
第 10期 葛江燕等: 基于抑制消减杂交开发长穗偃麦草(Lophopyrum elongatum)特异分子标记 1823
为 65.5%; 以设计的引物计算, 则成功率为 69.2%。
在 36 对长穗偃麦草基因组特异分子标记的引物中,
27对能特异扩增出长穗偃麦草 7条 E染色体, 4对能
特异扩增 6条 E染色体, 各有 1对能特异扩增出 1~5
条 E染色体(表 1), 表明所开发的基因组特异分子标
记仅在长穗偃麦草中稳定出现, 可以在不同小麦背
景和不同世代中跟踪 E组染色体。
2.5 基因组特异分子标记稳定性
引物 MEG-1303 在代换系 DS3E(3D)与安农
8455、代换系 DS3E(3A)与扬麦 16、代换系 DS7E(7A)
与扬麦 16杂交的不同后代中的扩增条带大小与预
期相同(图 4)。长穗偃麦草代换系、杂种 F1代均能
扩增出目标片段 , 但在小麦中没有相应的扩增产
物。在杂种 F2 代中扩增产物有与无的分离比约为
3∶1, 表明该引物能够有效地检测出不同小麦背景
杂交后代中的 3E染色体, 相同分子标记在同一杂交
组合的不同世代中可以稳定遗传(图 4-A)。7E 染色
体也同时能被有效检出(图4-B), 图中 F3单株是来自
F2的 1个单株, 说明该标记可以甄别 2条 7E染色体
的纯合个体。
图 4 特异引物 MEG-1303 在长穗偃麦草代换系与普通小麦品种杂交后代中的扩增结果
Fig. 4 Amplification profile of specific primer MEG-1303 in the progenies of hybrid between L. elongatum substitution lines and
common wheat varieties
照片 A中, M: DL2000; 1: DS3E (3D); 2: 安农 8455; 3和 4: DS3E (3D) × 安农 8455的 F1代; 5: DS3E(3A); 6: 扬麦 16; 7~21: 扬麦 16 ×
DS3E(3A)的 F2代。照片 B中, M: DL2000; 1: DS7E (7A); 2: 扬麦 16; 3和 4: 扬麦 16 × DS7E(7A)的 F1代; 5~21: 扬麦 16 × DS7E (7A)
的 F3代。
In panel A, M: DL2000; 1: DS3E (3D); 2: Annong 8455; 3 and 4: F1 generation of DS3E (3D) × Annong 8455; 5: DS3E (3A); 6: Yangmai 16;
7–21: F2 generation of Yangmai 16 × DS3E (3A). In panel B, M: DL2000; 1: DS7E (7A); 2: Yangmai 16; 3 and 4: F1 generation of Yangmai
16 × DS7E (7A); 5–21: F3 generation of Yangmai 16 × DS7E (7A).
3 讨论
3.1 利用 SSH技术开发特异标记的可行性
在长穗偃麦草中寻找新的操作简便、花费低、
重复性好的分子标记已经成为有效利用长穗偃麦草
优良种质的一项重要内容。相对于染色体特异分子
标记而言 , 基因组特异分子标记较易获得。采用
RAPD、RFLP、SSR 引物或随机引物的方法开发了
部分长穗偃麦草 E 染色体组的特异分子标记[12-15],
但其效率太低。利用 PCR增效减法杂交的方法从长
穗偃草基因组中分离出 2个基因组特异重复序列
pThe124和 pThe125, 它们可开发为长穗偃草基因组
特异分子标记, 但同样存在效率不高的问题[25]。陈
国跃等[11]根据已知植物抗病基因编码氨基酸保守区
域设计了简并引物, 利用 42个引物组合构建了一套
完整的长穗偃麦草 1E~7E染色体的 30个特异RGAP
标记。张丽等[16]用 5 对 AFLP 引物获得二倍体长穗
偃麦草 E 染色体组 7 个不同染色体上的 28 个特异
AFLP 标记, 将其中的 4 个标记成功转换为结果稳
定、操作更简单的序列特异性的 STS 分子标记, 并
证实这些标记为长穗偃麦草所特有, 可用于外源长
穗偃麦草遗传物质的检测。
上述研究中开发分子标记的方法均存在操作繁
琐、效率不高的缺陷。由于偃麦草的基因组序列未
知, 其与普通小麦基因组又存在较高的同源性, 这
给特异标记的开发带来一定的难度。本研究的主要
目的是获得长穗偃麦草基因组特异的DNA片段, 在
此基础上开发特异分子标记。我们利用 SSH技术获
得去除了小麦和长穗偃麦草的同源序列后的差异序
列即为长穗偃麦草的特异片段, 经测序可用于开发
长穗偃麦草基因组特异分子标记。本研究构建了包
含 454个克隆的抑制消减杂交文库, 随机选取其中
55个克隆进行测序, 并根据 47条序列的测序结果设
计了 52对引物, 最终成功获得基因组特异分子标记
36个, 按设计引物计算, 成功率高达 69.2%。由此可
见, 通过 SSH 开发基因组特异分子标记的方法不仅
1824 作 物 学 报 第 38卷
可行, 而且具有相对较高的效率。分析成功开发基
因组特异分子标记的 36 对引物所对应的片段序列
发现, 全序列与小麦其他近缘种同源的占 50%, 换
言之, 与现有网上公布小麦序列不同源的占 50%。
全序列与小麦同源性片段小于 90%的占 41.7%, 而
全序列与小麦同源性片段大于 90%的仅占 8.3%。16
对引物未成功获得基因组特异分子标记, 其中全序
列与小麦近缘种同源的占 56.2%, 全序列与小麦同
源性片段小于 90%的占 18.8%, 而全序列与小麦同
源性片段大于 90%的占 25.0%。成功和未成功获得
基因组特异分子标记所对应的序列分析表明, 测序
结果经在线比对首先选择与小麦同源性低而与小麦
近缘种有较高同源性的片段, 如与山羊草属、大麦
属、百萨偃麦草、短柄草等同源, 与近缘种序列同
源性高就很容易获得基因组特异分子标记。其次选
择全序列与小麦同源性的片段小于 90%的序列进行
引物设计。选取这些片段中与小麦同源性低的位置,
遵循引物设计的一般原则, 比较容易获得基因组特
异分子标记。
本研究对 SSH 技术进行改良后以基因组 DNA
为材料, 通过 SSH 技术去除小麦和长穗偃麦草基因
组DNA间的同源序列, 获得长穗偃麦草基因组特异
DNA片段。虽然基因组 DNA远大于 cDNA, 且复杂
性也有所增加, 但理论上两者都为 DNA 双链片段,
并且都能够很好地完成酶切、连接、2轮消减杂交
与 2 轮抑制 PCR。由于基因组 DNA 具有内含子等
系列, 而 cDNA 中没有内含子等系列结构, 使得在
以基因组为起始材料时, 基因组DNA比 cDNA增加
了许多非编码区序列以及内含子序列。因此, 在进
行消减杂交时, 应尽量减小基因组 DNA的复杂性。
本研究对基因组 DNA 进行较长时间酶切(24 h), 并
且中间补加一次酶, 使酶切后的最大起始片段降低
为 2 000 bp以下, 从而在一定程度上降低了基因组
DNA的复杂性。由于片段的缩短使得小麦与长穗偃
麦草DNA序列同源性高的片段出现的几率增加, 有
利于通过消减杂交去除小麦和长穗偃麦草基因组
DNA间的同源序列。将酶切后的对照组、实验组产物
浓度分别定为 100 ng μL1和 80 ng μL1。尽管长穗偃
麦草与小麦具有较高的同源性, 但它们的基因组DNA
差异仍然存在, 通过 SSH 技术可将差异扩大化, 从而
使所构建的 SSH文库的质量进一步提高。
3.2 基因组特异分子标记的应用
在作物育种研究中, 远缘杂交常被用于丰富作
物的遗传背景、拓宽遗传变异。小麦是异源六倍体,
是最容易进行远缘杂交的作物, 已经获得多种远缘
杂种[2]。在远缘杂交中, 整个基因组增加或个别染色
体置换无法达到目的, 而获得含有外源优良基因的
易位系则是最理想结果, 这样既获得了外源有利基
因, 又保持了小麦基因组的完整性。基因组特异分
子标记可以对远缘杂交后代的外源染色质进行全面
检测, 所以基因组特异分子标记在远缘杂种的鉴定
中具有重要作用。基因组特异分子标记也可以用于
特定染色体或染色体片段的检测。向小麦导入外源
染色质通常是利用已知有利基因所在特定染色体代
换系和小麦品种杂交, 在杂交后代中同样可以利用
基因组特异分子标记进行检测, 因基因组特异分子
标记在染色体间的相似性, 每次检测的结果都能表
示特定染色体的存在与否。在本研究中, 利用引物
MEG-1303分别对DS3E(3D)×安农 8455的杂交 F1代、
扬麦 16×DS3E(3A)的 F2代、扬麦 16×DS7E(7A)的
F1 代、F3 代检测, 结果开发的基因组特异分子标记
在具有 E 组染色体的不同小麦背景和不同世代间均
稳定表现, 且与预期结果一致, 说明可利用这些标
记对长穗偃麦草染色体或染色体片段在世代间跟踪
检测。同时, 也证明利用基因组特异分子标记可以
检测单个染色体, 在每次检测中就相当于染色体特
异标记。当基因组特异分子标记的数量增加时, 利
用小麦-长穗偃麦草附加系进行 PCR 扩增, 势必存
在染色体特异的标记, 这对检测特定染色体更具有
目标性。因此, 利用基因组特异分子标记不但可以
检测小麦背景中的长穗偃麦草染色质, 为小麦育种
中长穗偃麦草染色质的快速便捷检测提供新途径 ,
而且可以为长穗偃麦草相关染色体上抗病、抗逆基
因的定位和克隆奠定基础, 并作为标记为小麦遗传
改良中利用长穗偃麦草的抗病和抗逆基因进行有效
的辅助选择。另外, 除偃麦草属向小麦转移有利基
因外, 其他小麦近缘种也具备有利基因可以向小麦
转移。本研究采用的技术路线也可以用于小麦其他
野生近缘种的特异标记开发, 达到跟踪或检测小麦
背景中外源染色质的目的, 为小麦的遗传改良研究
提供方便快捷的检测手段。
4 结论
通过抑制消减杂交可去除长穗偃麦草和普通小
麦中国春 2个基因组 DNA之间的同源序列。以差异
片段构建消减文库和对随机克隆测序, 获得 36个长
第 10期 葛江燕等: 基于抑制消减杂交开发长穗偃麦草(Lophopyrum elongatum)特异分子标记 1825
穗偃麦草基因组特异分子标记, 成功率高达 69.2%。
所获标记的特异性稳定, 均能在含有长穗偃麦草 E
染色体的不同小麦背景和不同杂交世代中表现, 可
用于在小麦背景中跟踪长穗偃麦草染色体或片段。
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