全 文 :浙江大学学报(农业与生命科学版) 38(3):293~298,2012
Journal of Zhejiang University(Agric.&Life Sci.)
文章编号:1008-9209(2012)03-0293-06 DOI:10.3785/j.issn.1008-9209.2012.03.009
收稿日期:2011-08-01
基金项目:四川省科技厅产学研创新联盟合作资助项目(2010Z00028);四川省科技厅支撑计划资助项目(2008F20148)。
作者简介:赵颖(1980—),女,四川雅安人,讲师,主要从事生物无机化学方面的研究。E-mail:zhaoying.chem@yahoo.
com.cn。
通信作者:张利,女,博士,教授,主要从事药用植物化学与成分分析方面的研究。Tel:0835-8569011;E-mail:zhang843@
sina.com.cn。
宝兴鼠尾草的有效成分提取及含量测定
赵颖,刘琪,王萌,张利
(四川农业大学 生命科学与理学院,四川 雅安625014)
摘要 采用超声提取法、回流提取法及索氏提取法对宝兴鼠尾草有效成分的提取效果进行比较,并采用
高效液相色谱法(HPLC)对所提取成分含量进行测定,并与栽培丹参的相应成分进行比较。结果表明:
对于样品中的脂溶性成分,超声提取法以低温、高效的特点明显优于其他2种方法;而对于水溶性成分,
索氏提取4h的效果更佳;对其含量分析表明,宝兴鼠尾草的脂溶性成分含量较高,其中丹参酮IIA的
含量达到《中国药典》规定,但水溶性成分含量偏低。说明宝兴鼠尾草具有一定的药用价值,但能否作为
丹参代用品有待进一步研究。
关键词 宝兴鼠尾草;丹参;高效液相色谱法;水溶性;脂溶性
中图分类号 R 284.2 文献标志码 A
ZHAO Ying,LIU Qi,WANG Meng,ZHANG Li(College of Life and Science,Sichuan Agricultural
University,Ya′an,Sichuan 625014,China)
Extraction and determination of active ingredients from Salvia paohsingensis.Journal of Zhejiang
University(Agric.&Life Sci.),2012,38(3):293-298
Abstract Ultrasonic extraction,alcohol reflux,and Soxhlet extraction al stood to be tested on a
comparative basis for effect in active ingredients of Salvia paohsingensis extraction.The high
performance liquid chromatography(HPLC)was applied for assay of extracted constituents,and they
were compared with corresponding constituents in Salvia miltiorrhiza Bunge.The main results were as
folows:with respect for the fat-soluble constituents,ultrasonic extraction featured with low temperature
and high efficiency was better than other two methods,while the 4-hour Soxhlet extraction was better
when considered the water-soluble constituents.The assay by HPLC showed that the fat-soluble
constituents of S.paohsingensis were relatively high and the content of tanshinone IIA reached the level
stipulated in Chinese Pharmacopoeia,nevertheless,the water-soluble constituents were relatively low.
It is suggested that S.paohsingensis possesses certain medicinal value,however,whether it can be used
as a substitute of S.miltiorrhiza needs further research.
Key words Salvia paohsingensis C.Y.Wu;Salvia miltiorrhiza Bunge;high performance liquid
chromatography;water-solubility;fat-solubility
浙江大学学报(农业与生命科学版)
宝兴鼠尾草(Salvia paohsingensis C.Y.
Wu)为唇形科(Labiatae)、鼠尾草属(Salvia)多
年生草本植物,产于四川西部海拔2 800m林
下,直生根常分叉,外皮红褐色,密生纤细须根;
茎纤细,上升或近直立,被卷曲长柔毛,上部尤
为密集;叶有基出叶及茎生叶,叶片均为三角状
卵圆形,上表皮疏被近平伏的粗伏毛,下表皮沿
脉 处 被 卷 曲 长 柔 毛[1]。 丹 参 (Salvia
miltiorrhiza Bunge)与宝兴鼠尾草同属,其根
供药用,是历版《中华人民共和国药典》收载中
药丹参的唯一来源,具有活血调经、镇静安神、
消肿止痛等功能[2];临床上可增加冠脉流量、降
低心肌兴奋性和传导性,对急性心肌缺血缺氧
所致的心肌损伤具有明显地保护作用[3-4]。中
药丹参中的有效成分主要为脂溶性隐丹参酮、
丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA,以及水溶性成分原儿茶
醛、丹酚酸A和丹酚酸B。
在民间用药和地方中药材收载中,可将鼠
尾属多种植物的根用作丹参入药,如雪山鼠尾
草、云南鼠尾草等[5-6],但对宝兴鼠尾草的研究
记载并不多见。本实验通过对宝兴鼠尾草根部
有效成分进行提取,并用高效液相色谱法
(HPLC)测定各成分含量,旨在研究其是否具
有作为丹参替代品入药的价值。
1 材料与方法
1.1 试剂与仪器
丹参酮ⅡA、丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、原儿茶
醛、丹酚酸A、丹酚酸B 6种对照品由中国药品
生物制品检定所提供;甲醇、乙腈均为色谱纯;
乙醇和磷酸均为分析纯(AR)。
LC-20A 高效液相色谱仪(日本岛津)、
JP99-2D超声波细胞粉碎仪、BT-124S分析天
平、FW400倾斜型粉碎机、溶剂过滤器、超纯水
机、电热套、索氏提取器。
1.2 实验方法
1.2.1 供试样品前处理 取宝兴鼠尾草根
部,去泥沙,自然风干,样品粉碎过60目筛,粉
末在80℃下于干燥箱中烘干至恒质量,备用。
1.2.2 对照品混合液制备 精密称取丹参
酮ⅡA、丹参酮Ⅰ、隐丹参酮对照品适量于100
mL容量瓶中,加甲醇溶解定容,制成脂溶性对
照品混合液。同法制备水溶性对照品混合液。
1.2.3 脂溶性成分提取 回流提取:精确称
取供试药材粉末0.4g(精确至0.1mg)于圆底
烧瓶中,加适量80%乙醇,电热套加热回流,提
取液放置至室温,定容至25mL,过滤,作供试
液。分别对回流1、2和3h的提取效果进行
测定。
索氏提取:精确称取供试药材粉末0.4g
(精确至0.1mg)于索氏式提取器中,加适量
80%乙醇,电热套加热提取,提取液浓缩定容至
25mL,过滤,作供试液。分别对索氏提取1、2、
3和4h的提取液进行测定。
超声提取:精确称取供试药材粉末0.4g
(精确至0.1mg)置于碘量瓶中,加入80%乙醇
25mL,使用超声波细胞粉碎仪对其进行超声
提取,期间不断补质量,过滤,作供试液。分别
对超声提取10、20、30、40、50和60min的提取
液进行测定。
1.2.4 水溶性成分提取 水溶性成分的提
取方法同1.2.3节,称取丹参药材粉末0.5g
(精确至0.1mg),提取液为超纯水,其余操作
同1.2.3节。
1.2.5 色谱条件
1.2.5.1 脂溶部分.对流动相进行前处理,用
0.45μm滤膜过滤,超声处理20min。
色谱柱:ODS C18柱(250mm×4.6mm,5
μm);流动相:0.1%磷酸水溶液,甲醇(色谱
纯),流速0.8mL·min-1;梯度洗脱程序:0~
75min,60%~68%甲醇;75~80min,68%~
70%甲醇;80~110min,70%甲醇;检测波长:
254nm;进样量为10μL;柱温30℃。
1.2.5.2 水溶部分.流动相前处理方法同
1.2.5.1节。
色谱柱:ODS C18柱(250mm×4.6mm,5
μm);流动相:0.03%磷酸水溶液,乙腈(色谱
纯),流速1.0mL·min-1;梯度洗脱程序:0~
20min,8%~23%乙腈;20~35min,23%~
28.5%乙腈;35~40min,28.5%乙腈;40~45
min,8%乙腈;检测波长:288nm;进样量为10
μL;柱温25℃。
1.2.6 有效成分含量测定 运用 HPLC法
492 第3 8卷
赵颖,等:宝兴鼠尾草的有效成分提取及含量测定
测定用不同方法所提取的供试液中各成分的含
量,筛选出最适提取方法,在该方法下对样品进
行前处理,测定提取液中的有效成分含量。
2 结果与分析
2.1 线性关系考察
精密量取一定体积脂溶性对照品混合液于
容量瓶中,稀释成不同浓度的对照品混合液,依
次进样,进样量为10μL,按1.2.5.1节色谱条
件测定,以进样量X/μg为横坐标,色谱峰面积
Y 为纵坐标,绘制标准曲线,回归方程见表1。
水溶性对照品处理方法同脂溶性对照品,按
1.2.5.2节色谱条件测定,回归方程见表2。由
表1、2中的数据可得,在实验浓度范围内,各元
素峰面积与浓度的线性关系良好。
表1 脂溶性成分标准曲线回归方程
Table 1 Regression equation of standard curve of fat-
soluble constituents
成分 回归方程 R2
隐丹参酮 Y=1.40×10-5 X+0.53 0.999
丹参酮Ⅰ Y=2.91×10-5 X+0.43 0.999
丹参酮ⅡA Y=2.09×10-5 X+0.36 0.999
表2 水溶性成分标准曲线回归方程
Table 2 Regression equation of standard curve of water-
soluble constituents
成分 回归方程 R2
原儿茶醛 Y=1.05×10-5 X+0.15 0.999
丹酚酸B Y=8.81×10-5 X+2.15 0.999
丹酚酸A Y=6.19×10-5 X+0.79 0.999
2.2 精密度考察
精密吸取同一脂溶性对照品混合溶液10
μL,连续进样5次,结果表明,脂溶性成分中丹
参酮ⅡA、丹参酮Ⅰ、隐丹参酮的相对标准偏差
(RSD)分别为0.74%、0.59%和0.81%(n=
5)。用同样的方法对水溶性对照品混合液的测
定结果表明,原儿茶醛、丹酚酸A、丹酚酸B的
RSD分别为0.89%、0.63%和0.71%(n=5)。
说明仪器精密度良好,方法可行。
2.3 不同提取工艺比较
2.3.1 脂溶性成分提取 按照1.2.3节所
述方法对样品进行处理,所得供试液中脂溶性
成分含量见表3。从中可知,对脂溶性成分采
用80%乙醇作为提取溶剂、超声20min的提
取效果较好,原因是脂溶性的代表成分丹参酮
ⅡA见光受热易分解,不宜采用需长时间高温
处理的回流法与索氏提取法;而超声提取具有低
温、高效的特点,更适合对此类物质进行提取;因
此,后文对脂溶性成分的提取均采用该方法。
表3 脂溶性成分提取前处理数据
Table 3 Data of pre-treatment of fat-soluble constituents
w/%
方法 时间 隐丹参酮 丹参酮Ⅰ 丹参酮ⅡA
1h 0.071 0.066 0.158
回流提取法 2h 0.064 0.068 0.176
3h 0.069 0.071 0.172
索氏提取法
1h 0.050 0.052 0.102
2h 0.069 0.069 0.183
3h 0.070 0.065 0.185
4h 0.085 0.068 0.174
超声提取法
10min 0.072 0.074 0.183
20min 0.082 0.081 0.200
30min 0.077 0.079 0.198
40min 0.075 0.079 0.201
50min 0.077 0.080 0.205
60min 0.074 0.073 0.198
2.3.2 水溶性成分提取 分别按照1.2.4
节所述的不同提取方法对样品进行处理,所得
供试液中水溶性成分含量见表4。由于超声提
取后所得供试液中仅能测得丹酚酸B含量,其
他2种水溶成分含量未能测得,故后文仅对索
氏提取和回流提取2种方法进行比较。实验证
明,对于多数水溶性成分,索氏提取3h以上的
效果明显优于回流法。可能是由于回流提取法
提取到一定阶段后缺乏浓度梯度,不利于成分
的进一步溶出;因此,后文对水溶性成分采用超
纯水作提取溶剂,索氏提取4h。
592 第3期
浙江大学学报(农业与生命科学版)
1:隐丹参酮 (cryptotanshinone);2:丹参酮Ⅰ(tanshinone I);3:丹参酮ⅡA(tanshinoneⅡA)。
图1 样品(A)及标准品(B)中脂溶性成分的HPLC图
Fig.1 HPLC chromatograms of fat-soluble constituents in sample(A)and standard solution(B)
表4 水溶性成分前处理数据
Table 4 Data of pre-treatment of water-soluble constituents
w/%
方法 时间 原儿茶醛 丹酚酸B 丹酚酸A
索氏提取法
1h 0.000 0.035 0.001
2h 0.001 0.077 0.009
3h 0.005 0.099 0.049
4h 0.007 0.130 0.067
1h 0.001 0.134 0.004
回流提取法 2h 0.003 0.132 0.028
3h 0.004 0.128 0.031
2.4 重复性实验
取同批样品粉末2份,分别按2.3.1节及
2.3.2节中筛选出的方法制备供试品溶液各5
份,在相应色谱条件下测定其含量。结果表明:
脂溶性成分中的丹参酮ⅡA、丹参酮Ⅰ、隐丹参酮
平均含量的RSD分别为1.1%、0.97%和1.6%
(n=5);水溶性成分中的原儿茶醛、丹酚酸A、丹
酚酸B平均含量的RSD分别为1.7%、1.4%和
2.1%(n=5)。说明该方法重现性较好。
2.5 回收率实验
实验采用加标回收法,精密称取已知各成分
含量的样品粉末10份,其中5份分别加入一定
浓度的脂溶性混合对照品液,按2.3.1节中筛选
出的方法制备供试液;另5份分别加入一定浓度
的水溶性混合对照品液,按2.3.2节中筛选出的
方法制备供试液,分别测定含量,计算回收率。
平行测定结果显示,丹参酮ⅡA、丹参酮Ⅰ、隐丹参
酮平 均 回 收 率 依 次 为 103.1%、97.38% 和
102.9%,RSD分别为2.2%、1.7%和2.9% (n=
5);原儿茶醛、丹酚酸A、丹酚酸B的平均回收率
依次为98.31%、104.2%和97.63%,RSD分别
为2.8%、1.4%和3.3% (n=5)。
2.6 样品成分测定
按照2.3节中筛选出的提取方法对样品粉
末进行处理,在给定的色谱条件下平行测定4
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赵颖,等:宝兴鼠尾草的有效成分提取及含量测定
1:原儿茶醛 (protocatechuic aldehyde);2:丹酚酸B(salvianolic acid B);3:丹酚酸A(salvianolic acid A)。
图2 样品(A)及标准品(B)中水溶性成分的HPLC图
Fig.2 HPLC chromatograms of water-soluble constituents in sample(A)and standard solution(B)
次。结果(表5)表明:样品中脂溶性成分的代
表丹参酮ⅡA含量较高,水溶性成分的代表丹
酚酸B含量次之;平行测定的 RSD在0.72%
~1.3%之间,精密度好。HPLC图显示各组
分分离良好(图1,2)。
表5 各成分的测定结果
Table 5 Determination result of chemical compositions from
S.paohsingensis
成分 ρ/(μg·mL-1) w/% RSD/%
隐丹参酮 5.44 0.085 0.79
丹参酮Ⅰ 3.28 0.083 1.3
丹参酮ⅡA 10.08 0.203 0.53
原儿茶醛 1.36 0.007 1.2
丹酚酸B 27.86 0.129 0.81
丹酚酸A 14.16 0.070 0.72
3 讨论
样品中的有效成分含量是衡量其能否成为
丹参替代品的重要指标;而合适的提取方法既
能保证样品有效成分的充分提取,又可使损失
率降至最低,真正达到准确、有效地评价药材的
质量。本实验针对同一样品,比较了多种方法
的提取效果。结果表明,超声提取法以低温、高
效的特点特别适用于样品中脂溶性成分的提
取,它能直接作用在药材的根皮上促使乙醇溶
剂快速进入根皮细胞中,打破细胞壁,使细胞中
丹参酮类物质快速溶于溶剂中,以便其中的有
效成分被快速提出[7];但对于多种水溶性成分
的提取,超声法具有一定的局限性,而传统的索
氏提取法更为适宜。因此,在对样品中的不同成
分进行提取时,应有针对性地选取适宜的方法。
792 第3期
浙江大学学报(农业与生命科学版)
通过 HPLC法测定样品中各成分含量,对
比相关研究结果发现,栽培丹参中隐丹参酮、丹
参酮I、丹参酮ⅡA平均含量约为宝兴鼠尾草
的2.6倍、1.3倍、1.5倍[8];原儿茶醛、丹酚酸
B的平均含量约为宝兴鼠尾草的 2 倍、29
倍[9]。栽培丹参中丹酚酸 A的含量未发现有
可供参考的报道。由于丹酚酸B的热稳定性
较差[10],推测本实验中长时间索氏提取使丹酚
酸B有一定的损耗,致使测定结果中含量偏
低。但根据相关文献[11]表明,这一损耗对测定
出的含量无决定性影响。
2010年版《中国药典》规定,丹参脂溶性成
分的代表丹参酮ⅡA及水溶性成分的代表丹
酚酸B的含量分别不得少于0.20%及3.0%。
经测定,宝兴鼠尾草中丹参酮ⅡA 的含量为
0.203%,已达到药典要求,但丹酚酸B的含量
为0.129%,远低于标准。
综上所述,宝兴鼠尾草的脂溶性指标成分
含量与丹参相当,但水溶性指标成分含量远低
于丹参,其是否能作为中药丹参的代用品,仍需
要结合药物的具体用途作进一步研究;同时值
得指出的是,结合 HPLC图谱显示,宝兴鼠尾
草含有多种中药丹参并不具有的化学成分,具
有广阔的开发前景,值得进一步深入研究。
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