全 文 :麦类作物学报 2013,33(3):435-439
Journal of Triticeae Crops
网络出版时间:2013-04-26
网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20130426.0950.026.html
小麦-中间偃麦草衍生后代的细胞学和SSR标记鉴定
收稿日期:2013-01-28 修回日期:2013-03-05
基金项目:国家高技术研究发展计划(863计划)项目(2011AA100103);西北农林科技大学唐仲英育种基金项目。
作者简介:刘紫垠(1986-),女,在读硕士,研究方向为小麦分子染色体工程育种。E-mail:zi_conglin@yahoo.com.cn
通讯作者:吉万全(1963-),男,博士,教授,博士生导师,主要从事小麦分子染色体工程与育种研究。E-mail:jiwanquan2003@
126.com
刘紫垠,王长有,陈春环,吉万全
(旱区作物逆境生物学国家重点实验室/西北农林科技大学农学院,陕西杨凌712100)
摘 要:为了鉴定小麦与八倍体小偃麦的杂交组合 NZ2W5的衍生后代中是否含有中间偃麦草的遗传
物质,利用细胞学和SSR技术对该组合的12个衍生单株进行了鉴定。结果表明,NZ2W5组合衍生后代的根
尖细胞染色体数目均为2n=42,花粉母细胞减数分裂中期I染色体构型均为2n=21II。以相关亲本中间偃麦
草、小麦-中间偃麦草部分双二倍体远中2、普通小麦合作2号和阿勃以及衍生后代为材料,选取均匀分布于小
麦各条染色体上的480个 SSR 标记进行分析,结果表明,Xbarc008、Xbarc195、Xwmc489、Xcfb3440、
Xwmc331 和Xgwm608等20个标记在中间偃麦草中具有特异条带,其中定位在小麦4D染色体上的标记
Xwmc331可以在NZ2W5组合衍生的12个单株中检测到中间偃麦草119bp的特异条带。研究结果表明,
NZ2W5组合衍生后代的细胞遗传学基本稳定,携带中间偃麦草的遗传物质,涉及的外缘遗传物质可能同源于
小麦的第四部分同源群。
关键词:小麦-中间偃麦草衍生后代;细胞学;SSR
中图分类号:S512.1;S330 文献标识码:A 文章编号:1009-1041(2013)03-0435-05
Cytologic and SSR Identification of Derivatives
from Wheat-thinopyrum intermedium
LIU Zi-yin,WANG Chang-you,CHEN Chun-huan,JI Wan-quan
(State Key Laboratory of Crop Stress Biology for Arid Area/Cologe of Agronomy,Northwest
A&F University,Yangling,Shaanxi 712100,China)
Abstract:In order to identify the chromatin of Thinopyrum intermediumin wheat-Th.intermedium
derivatives,12individuals from the combination NZ2W5were analyzed wtih cytological and SSR
markers.Chromosome numbers of NZ2W5derivatives in root tip cels were 2n=42and chromosome
configuratiuon of that at PMC M I were 2n=21II.Using Th.intermedium,wheat-Th.intermedium
partial amphiploid Yuanzhong 2,common wheat Hezuo 2and Abbondanza and 12derivatives as mate-
rials,480SSR(simple sequence repeat)markers were used to investigate the polymorphisms among
parents and to detect the alien chromatin in derivatives.20markers,such as Xbarc008,Xbarc195,
Xwmc489,Xcfb3440,Xwmc331 and Xgwm60 ,had specific bands in Th.Intermedium.Marker
Xwmc331located on wheat 4Dcould detect an 119bp specific band of Th.Intermediumin 12individ-
uals.The results showed that 12derivatives of NZ2W5were cytogeneticaly stable and had Th.inter-
mediumchromatin,it was possible that the alien chromation was homologous to the homoeologous
group 4.
Key words:Wheat-Thinopyron intermediumderivatives;Cytology;SSR
中间偃麦草(Thinopyrum intermedium,2n
=42)是野生的多年生禾本科异花授粉植物[1],对
小麦白粉、条锈、叶锈、秆锈、黄矮、根腐病和赤霉
病等多种病害免疫或高抗,是偃麦草属中最早与
小麦杂交成功并为小麦育种提供有益基因的远缘
物种[2-3]。迄今,利用中间偃麦草与小麦杂交,已
经选育出多个抗小麦锈病、白粉病或黄矮病的小
麦-中间偃麦草异附加系、异代换系和易位系[4-6]。
黑龙江省农业科学院育种所小麦室20世纪50年
代利用普通小麦与中间偃麦草杂交,然后用普通
小麦回交,再经系统选育而育成了八倍体小偃麦
远中1~远中7[7]。韩方普[8]研究认为,八倍体小
偃麦远中2的染色体组型为ABDE1或ABDE2;
辛文利等[9]通过研究初步得到远中2的染色体组
型为AABBDDXX。可见对于远中2的染色体组
型至今没有统一的、确定的认识。
细胞学方法是鉴定小麦外源染色质最基本、
最常用的方法[10]。SSR(Simple sequence repeat)
标记又称微卫星标记,它具有多态性频率高,共显
性、重复性好、稳定可靠、所需DNA量少等优点。
近年来,SSR标记已在植物遗传育种研究中得到
广泛应用[11]。任永康等[12]通过SSR标记对小
麦-中间偃麦草异代换系进行了鉴定。王红梅
等[13]应用SSR等分子标记技术筛选出了高抗黄
矮病的小麦新品系。但关于八倍体小偃麦远中2
号衍生后代的细胞学及SSR鉴定的研究很少见
报道。本实验以组合 NZ2W5(阿勃5D非整倍
体//阿勃5D非整倍体/远中2)衍生的F3 代为研
究对象,利用细胞学和SSR标记技术对它们进行
了鉴定,以期为这些材料的进一步研究和应用奠
定基础。
1 材料与方法
1.1 实验材料
普通小麦(Triticum aestivum L.)品种合作
2号引自中国农业科学院作物科学研究所,中间
偃麦草、八倍体小偃麦远中2、普通小麦品种阿勃
和组合 NZ2W5(阿勃5D非整倍体//阿勃5D非
整倍体/远中2)衍生的12个F3 代单株(编号为1
~12)由西北农林科技大学农学院提供。
1.2 研究方法
1.2.1 形态学鉴定
参考全国小麦育种攻关协作组小麦良种区域
试验的田间记载标准进行形态学记载[14]。
1.2.1 细胞学鉴定
(1)根尖染色体数目鉴定:种子在室内浸泡至
露白,然后于25℃条件下发芽,当根长1.5~2.0
cm时取根尖,冰浴24h,固定液(无水乙醇∶冰醋
酸=3∶1)固定≥48h[15]。固定好的材料用1%
的醋酸洋红染色压片,45%的醋酸压片观察[16],
统计染色体数目并照相。
(2)花粉母细胞染色体减数分裂构型分析:田
间取合适的幼穗,用卡诺固定液(无水乙醇∶氯仿
∶冰醋酸=6∶3∶1)固定≥48h,选取花粉母细
胞减数分裂中期I的花药,用1%醋酸洋红染色,
镜检并照相,分析染色体构型[17]。
1.2.2 DNA提取
采用CTAB法[18]提取小麦幼嫩叶片DNA。
1.2.3 SSR扩增及电泳检测
SSR标记的分析程序主要包括获取引物、
PCR扩增和PCR产物的检测和数据处理等[19]。
所用480个 SSR 引物对根据 GrainGenes
(http://www.wheat.pw.usda.gov)公布的信
息,由上海生物工程有限公司或北京奥科鼎盛生
物技术有限公司合成。扩增体系总体积为10
μL,包括1.0μL 10×PCR Bufer(Mg
2+),1.0μL 2
mmol·L-1 dNTPs,每个引物(5μmol·L
-1)1.0
μL,0.1μL 5U·μL
-1 Taq 酶,50~100ng基因组
DNA,其余用 ddH2O 补至10μL。扩增程序为
95℃预变性3min;94℃变性30s,50℃、55℃或
60℃(根据引物选择)退火45s,72℃ 延伸1min,
35个循环;最后72℃延伸10min。反应产物4℃
保存备用。扩增产物采用8%非变性聚丙烯酰胺
凝胶电泳检测,参考 Wang等[20]的方法,经硝酸
银染色后观察照相,并统计带型。
2 结果与分析
2.1 NZ2W5衍生后代的植物学特征
植物学性状调查结果 (表 1)表明,组合
NZ2W5的12个衍生后代单株的几个性状变动
范围比较大。在芒性方面,双亲阿勃和远中2均
无芒,12个后代单株中4株顶芒,8株无芒;亲本
及衍生后代穗形均为纺锤形;在熟性方面,远中2
表现极晚熟,阿勃晚熟,衍生后代则表现为晚熟至
极晚熟。
·634· 麦 类 作 物 学 报 第33卷
表1 亲本及NZ2W5衍生后代的主要性状特点
Table 1 Main characteristics of NZ2W5and their parents
单株
编号
株 高
/cm
有效
分蘖
穗长
/cm
主穗
小穗数 穗粒数
远中2 125 12 17.7 22 46
阿勃 97 18 12.5 20 42
1 131 10 14.5 26 44
2 137 24 12.0 21 52
3 131 27 13.5 21 34
4 92 18 10.5 18 46
5 96 7 10.7 16 42
6 103 5 10.0 19 42
7 96 6 11.2 18 40
8 89 7 8.5 22 37
9 103 17 10.0 15 43
10 107 29 12.0 16 40
11 115 11 9.4 17 40
12 101 10 9.8 18 39
1~12为衍生后代单株编号。
2.2 NZ2W5衍生后代的细胞学鉴定结果
经鉴定,组合NZ2W5的12个衍生后代单株
根尖染色体数目均为2n=42(图1),花粉母细胞
减数分裂中期I染色体构型均为2n=21II(图2),
未发现单价体或其他类型的配对情况,表明这些
单株在细胞遗传学上基本稳定。
2.3 NZ2W5衍生后代的SSR分析
首先以中间偃麦草、远中2、阿勃和合作2号
为材料进行标记的筛选,在480个供试的SSR
标记中有345个在中间偃麦草中具有稳定的扩增
图1 NZ2W5衍生后代的根尖染色体数目(2n=42)
Fig.1 Chromosome numberss of NZ2W5
derivatives in root tip cel(2n=42)
图2 NZ2W5衍生后代的减数分裂中期
I染色体构型(2n=21II)
Fig.2 Chromosome configuratiuon of NZ2W5
derivatives at PMC M I(2n=21II)
产物,说明SSR标记在中间偃麦草中位点丰富。
有20个标记在远中2中具有中间偃麦草特异性
条带 (表 2),例如标记 Xbarc008、Xbarc195、
Xwmc489和Xcfb3440在远中2中分别具有中间
偃麦草214bp、100bp、440bp、335bp的特异条
带(图3A~3D),说明中间偃麦草和远中2具有
不同于两个普通小麦亲本的特异SSR位点。利
用筛选的20个标记对组合NZ2W5衍生的12个
单株鉴定发现,仅有定位于小麦4D染色体上的
标记Xwmc331在所有单株中均具有中间偃麦草
119bp的特异条带(图4),说明所鉴定的单株中
均含有中间偃麦草的遗传物质。
表2 中间偃麦草的20个特异性SSR标记
Table 2 20SSR Markers with specific bands
of Thinopyron intermedium
标记名称 染色体定位 标记名称 染色体定位
Xbarc008 1B Xcfd61 1D
Xbarc195 6A、7A Xgwm63 7A
Xbarc240 1A、1B、1D、5B Xwmc31 1B
Xbarc140 2B、5B、5D Xwmc215 3A、5A、5D
Xbarc20 4B、7B Xwmc331 4D
Xbarc24 6B Xwmc382 2A、2B
Xcfb3440 3B Xwmc47 4B、5A、5B
Xcfd13 6B、6D Xwmc96 3A
、4A、5A、
5D、6A、7A
Xcfd29 5D Xwmc580 6A
Xwmc489 1D、2B、3A、4D、5A、7D Xgwm608
1D、2D、4D、5B、
6B
·734·第3期 刘紫垠等:小麦-中间偃麦草衍生后代的细胞学和SSR标记鉴定
M.DL2000;AB.阿勃;HZ.合作2号;ZJ.中间偃麦草;Z2.远中2。图中箭头均指特异性条带。下同。
图3 具有中间偃麦草特异条带的4个SSR标记
Fig.3 Result of four SSR markers with specific bands of Thinopyron intermedium
M.DL2000;AB.阿勃;HZ.合作2号;ZJ.中间偃麦草;Z2.远中2;1~12.NZ2W5衍生的12个后代。
图4 标记Xwmc331对NZ2W5衍生的12个单株的鉴定结果
Fig.4 Xwmc331idetification to 12individuals of NZ2W5
3 讨 论
利用小麦-中间偃麦草的部分双二倍体(八倍
体小偃麦)与小麦杂交是应用偃麦草属有益基因
的有效途径。运用此方法,当代结实好,后代育性
也好,变异类型丰富,相对于小麦与中间偃麦草直
接杂交而言可以缩短育种年限,因而目前被普遍
应用[21]。Lakin等[9]利用中5(即远中5)与普通
小麦杂交得到了Z1~Z6 6个异附加系和代换
系[22]。任永康等[12]利用八倍体小偃麦TAI-7045
与普通小麦杂交得到了后代CH-9916,并且进行
了细胞学鉴定和SSR标记鉴定分析,由标记所在
的小麦染色体位置得出其可能是由偃麦草的染色
体代换了小麦2D染色体的异代换系。
本研究在对(八倍体小偃麦)远中2与小麦杂
交组合NZ2W5衍生后代的形态学和细胞学鉴定
的基础上,利用SSR标记对它们携带的中间偃麦
草遗 传 物 质 进 行 了 鉴 定。结 果 表 明,标 记
Xwmc331在被鉴定的单株中均具有中间偃麦草
特异性条带,说明这些单株含有中间偃麦草遗传
物质。标记Xwmc331被定位于小麦4D染色体
上,说明导入到这12单株中的中间偃麦草染色体
或染色体片段可能同源于小麦的第四同源群;另
外,可以继续筛选定位于小麦第四同源群的标记,
对这些材料进行进一步分析和鉴定。利用标记
Xwmc331对组合NZ2W5衍生后代的4号单株分
析中还发现,缺少了普通小麦阿勃和合作2号的
条带,仅具有中间偃麦草的特异条带,推测该单株
的4D染色体可能被中间偃麦草部分同源染色体
代换,或者4D染色体区段与中间偃麦草染色体
发生了易位。基因组原位杂交(GISH)技术可以
直观地检测小麦背景中的外源染色体[23],后续研
·834· 麦 类 作 物 学 报 第33卷
究将利用GISH技术对本研究的材料进行分析。
参考文献:
[1]贺润丽,畅志坚,刘建霞,等.小麦中源于中间偃麦草抗白粉病
基因PmCH5026 的SSR定位[J].山西大学学报,2009,32
(3):455-462.
[2]张延滨,祁适雨,肖志敏,等.远中号八倍体小偃麦及中间偃麦
草的SDS-PAGE和A-PAGE分析[J].自然科学学报,1998,
14(1):8490.
[3]闫金龙,畅志坚,孙美荣,等.中间偃麦草抗小麦白粉病基因导
入及其抗性评价[J].华北农学报,2010,25(3):225-230.
[4]张荣琦,陈春环,赵晓农,等.八倍体小偃麦与普通小麦杂交选
育优质小麦新品种的研究[J].西北农林科技大学学报,2004,
32(3):26-32.
[5]王长有,吉万全,薛秀庄,等.小麦-中间偃麦草异附加系条锈
病抗性的研究[J].西北植物学报,1999,19(6):54-58.
[6]Lakin P J,Banks P M,Lagudah E S,et al.Disomic Thinopy-
rum intermediumaddition lines in wheat with barley yelow
dwarf virus resistance and with rust resistances[J].Genome,
1995,38:385-394.
[7]祁适雨,肖志敏,辛文利,等.“远中”号小麦在小麦育种上的应
用[J].麦类作物学报,2000,20(1):10-15.
[8]韩方普.天蓝冰草及八倍体小冰麦染色体组成研究[J].遗传
学报,1994,16(5):31-34.
[9]辛文利,高 智,韩方普,等.八倍体小偃麦远中2染色体组构
成的研究[J].自然科学学报,1998,14(2):81-84.
[10]宿俊吉,董永梅,柴守诚.普通小麦中外源异染色质的检测研
究进展[J].作物杂志,2008,3(3):14-17.
[11]郑 威,李先文,孙东发.SSR标记在小麦遗传资源利用中的
应用[J].安徽农业科学,2008,36(36):15791-15793.
[12]任永康,畅志坚,詹海仙,等.小麦-中间偃麦草异代换系的细
胞学和SSR 标记鉴定[J].山西农业科学,2007,35(1):
22-25.
[13]王红梅,王浩瀚,岳维云,等.抗黄矮病小麦新品系的分子标
记检测研究[J].植物保护学报,2012,38(3):86-89.
[14]李立会,李秀全,杨欣明,等.小麦种质资源描述规范和数据
标准[M].北京:中国农业出版社,2006,9.
[15]赵逢涛,王黎明,李文才,等.小麦-中间偃麦草双体异附加系
的选育和鉴定[J].实验生物学报,2005,38(2):134-139.
[16]王小利,张改生,李红霞,等.植物分子细胞遗传学实验[M].
上海:上海科学技术出版社,2010:8.
[17]石丁溧,傅体华,任正隆.抗白粉病小麦-中间偃麦草染色体
小片段易位系的选育与鉴定[J].植物病理学报,2008,38
(3):298-303.
[18]SaghaiM,Maroof Ma,SolimanK,et al.Ribosoma IDNA spac-
er length polymorphism sin barley:mendelian inheritance,
chromosomal location and population dynamics[J].Proceed-
ing soft the National Academy of Sciences of the United
States of America,1984,81:8014-8018.
[19]王长有,吉万全,王秋英,等.SSR标记在小麦遗传育种中的
应用研究进展[J].麦类作物学报,2004,24(1):70-74.
[20]Wang C Y,Ji W Q,Zhang G S,et al.SSR markers and pre-
liminary chromosomal location of a powdery mildew resist-
ance gene in common wheat germplasm N9134[J].Acta Ag-
ronomica Sinica,2007,33(1):163-166.
[21]吕伟东,徐鹏彬,蒲 训.偃麦草属种质资源在普通小麦育种
中的应用现状简介[J].草业学报,2007,16(6):136-140.
[22]高海波,陈 孝,陈 明,等.小麦-中间偃麦草异附加系Z4的外
源染色质的分子标记[J].西南农业学报,2005,18(5):634-
637.
[23]林志珊,辛志勇,唐益苗,等.应用GISH与STS标记鉴定小
麦-中间偃麦草抗黄矮病端体系[J].作物学报,2006,32
(12):1855-1859.
·934·第3期 刘紫垠等:小麦-中间偃麦草衍生后代的细胞学和SSR标记鉴定