全 文 ：第 20 期
收稿日期：2011－12－09
基金项目：国家自然科学基金项目（U0933601）
作者简介：于 瑶（1985－），女，陕西宝鸡人，在读硕士研究生，主要从事植物分子生物学方面的研究，（电话）15912524103（电子信箱）
camellia133＠163．com；通讯作者，张汉尧，教授，（电话）13759506687（电子信箱）hanyaoz＠163．com。
第 51 卷第 20 期
2012年 10 月
湖北农业科学
Hubei Agricultural Sciences
Vol． 51 No.20
Oct．，2012
湿地生态系统是一类重要的自然生态系统，中
国云贵高原、 青藏高原分布着不同海拔的高原湿
地。 植被和植物群落特征是显示高原湖泊湿地的自
然性、特殊性、多样性、演变阶段、消退阶段的最好
指示要素。 水葱是云南高原湿地挺水植被群落中常
见的分布最为广泛的优势群落。 水葱的拉丁学名为
Scirpus validus Vahl．， 为莎草科多年生宿根挺水草
本植物，生长在湖边、水边、浅水塘、沼泽地或湿地
草丛中，在中国南北方分布广泛，是构建人工湿地
系统、进行污水净化的常用挺水植物，也是常用的
景观绿化植被。
ITS 序列是在 rDNA 基因中 16 S rDNA 和 28 S
rDNA基因的间隔序列，也被称为内转录间隔区，ITS
序列在被子植物中的长度变异很小，承受的选择压
力较小，相对变化较大，并且能够提供详尽的系统
学分析所需要的可遗传性状。 因此，其常被用于研
究被子植物系统发育关系，尤其是近缘属间及种间
关系［1－3］。 ITS 序列和 matK、rbcL 序列 ［4］一样都是在
研究物种遗传多样性、系统发育、物种起源及物种
确定上常用的依据［5－8］。
本研究以分布于云南高原湿地中的水葱为样
品，通过克隆其基因组 DNA 的 ITS 片段，并与 NCBI
上已收录的其他水葱属各种植物的 ITS 序列比较。
明确其在水葱属各种间的系统发育树上的位置，为
水葱的遗传改良及研究水葱属种间的系统发育提
供理论依据。
1 材料与方法
1．1 材料
试验材料采集于云南省大理州剑川县的剑湖。
采集地水葱株高 1～2 m， 茎杆高大通直， 杆呈圆柱
状，中空，多散生。
云南高原湿地植物水葱的ITS序列分析
于 瑶，张汉尧，杜建伟
（西南林业大学林学院，昆明 650224）
摘要：提取分布于云南高原湿地的水葱（Scirpus validus Vahl．）样品的 DNA，采用 ITS 序列扩增通用引
物，对其进行 PCR 扩增，并对 PCR 产物进行测序。 从 GenBank 搜索并下载水葱属其他种类的 ITS 序列，
并通过 BioEdit、ClustalX 2．02 和 MEGA 4x1 软件分析和构建系统发育树。 分析结果揭示了水葱属 14 个
种之间的亲缘关系，并确定了样品在种间的位置以及和其他种的亲缘关系。
关键词：水葱（Scirpus validus Vahl．）；ITS 序列；系统发育树
中图分类号：Q523＋．8；Q949．71＋4．3 文献标识码：A 文章编号：0439－8114（2012）20－4549-02
ITS Sequence Analysis of Wetland Plant Scirpus validus on Yunnan Plateau
YU Yao，ZHANG Han－yao，DU Jian－wei
（College of Forestry， Southwest Forestry University，Kunming 650224，China）
Abstract： DNA was extracted from a Scirpus validus Vahl. sample distributed in Yunnan plateau wetland and applied as
template for PCR of ITS sequences with universal primers． The PCR products were sequenced and analyzed together with re-
ported ITS sequences of other Scirpus species downloaded from GenBank using software BioEdit， Clustalx 2．02 and MEGA
4x1． The relationship among the 14 Scirpus species as well as the taxonomic status of the tested sample was revealed by
the constructed phylogenetic tree．
Key words： Scirpus validus Vahl； ITS sequence； phylogenetic tree
DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2012.20.002
湖 北 农 业 科 学 2012 年
1．2 方法
1．2．1 总 DNA 的提取 采用新鲜幼嫩的水葱水上
部分，放入液氮中研磨成粉末，用生工生物工程（上
海）股份有限公司的植物基因组提取试剂盒提取高
质量的水葱总 DNA。
1．2．2 PCR 扩增 参考文献 ［8］，PCR 反应体系包
括由北京百泰克生物技术有限公司合成的 ITS 通用
引物 JK5．8F （5′－GAT ACT TGG TGT GAA TTG
CAG A－3′ ）、ITS4 （5′－TCC TCC GCT TAT TGA
TAT GC－3′）各 2 μL，双链 DNA 模板 2 μL，北京百
泰克生物技术有限公司生产的 2×Power Taq PCR
MasterMix 25 μL，用去离子水补足至 50 μL。扩增条
件为：95 ℃预变性 6 min；94 ℃变性 30 s，51 ℃退火
30 s，72 ℃延伸 90 s，共 40 个循环；最后于 72 ℃延
伸 8 min，4 ℃保存。 扩增产物在 1．0％琼脂糖凝胶、
0．5×TBE 电泳缓冲液中电泳， 电压不超过 5 V ／ cm，
用溴化乙锭（EB）浸染，在 UVP 凝胶成像仪上观察
并摄影。 用回收试剂盒回收纯化扩增片段，纯化后
直接作为测序用模板。
1．2．3 DNA 的序列分析 首先用 BioEdit 软件对测
序结果进行调整，转换格式，利用 ClustalX 2．02 软
件完成 DNA序列的对比，保存 ALN 格式，然后运用
MEGA 4x1 软件进行系统发育分析， 应用自展法
（Bootstrap，1 000 Replicates）进行可信度检测，对空
位做缺失处理， 使用 1 000 次重复抽样计算邻接树
（Neighbor－joining tree，NJ）， 模型选择核算 P－dis-
tance，构建水葱属各种之间的系统发育树。
2 结果与分析
2．1 样品 PCR扩增后的电泳结果
采集水葱样本，提取基因组 DNA，用 PCR 扩增
后获得了单一的目的条带， 获得的样品的 ITS 区域
的序列片段长度为 500 bp，PCR 扩增获得的目的片
段为 5．8 S rDNA 片段、大部分 ITS2 和少量 ITS1 片
段。 在 GenBank 中利用 BLAST 对比获得水葱属的
其他相关种的 ITS序列共计 13个（表 1）。
2．2 样品 ITS的序列分析结果
由于本试验扩增出来的为样品的 ITS 部分片
段，所以在经软件 ClustalX 2．02 和 MEGA 4x1 分析
时均选用水葱属中各种的相同 ITS 片段进行序列分
析，分析结果表明，本试验所用的 14 种水葱属的植
物样品的 ITS 片段有 364 个核苷酸位点，263 个恒
定信息位点，98 个变异信息位点，51 个简约信息位
点，46 个单个碱基变化位点。 该序列的变异信息位
点所占比例仅为 26．9％。 说明水葱的 ITS 序列变异
不大，而且具有较多的遗传信息，适用于进行遗传
分析。
2．3 水葱属植物 ITS序列的聚类分析结果
用 ClustalX 2.02 软件对 14 个样本的 ITS 序列
进行了聚类分析，建立了其系统发育树（图 1）。从聚
类分析结果来看， 可以把水葱属这 14 个样本分为
两大分支， 其中 Schoenoplectus gitriqueter （三棱水
表 1 用于分析的水葱植物材料
编号
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
种名
Schoenoplectus komarovii
S. x trapezoideus
S. triangulatus
S. hondoensis
S. gemmifer
S. hotarui
S. multisetus
S. wallichii
S. juncoides
S. mucronatus
S. lineolatus
S. nipponicus
S. gitriqueter
GenBank 序列登记号
AB206261
AB523852
AB523850
AB206258
AB523848
AB206259
AB206264
AB206266
AB206260
AB206263
AB206262
AB206267
AB206269
图 1 根据 ITS 区序列数据构建的水葱属的 14 个种的系统发育树
本试验样本
（下转第 4565页）
4550
第 20 期
1990．
［9］ 王建林，陶 澜，吕振武．西藏林芝云杉林凋落物的特征研究［J］．
植物生态学报，1998，26（6）：566－570．
［10］ 方江平．西藏原始林芝云杉林群落结构与功能研究［D］．长沙：
中南林业科技大学，2010．
［11］ 陈宫燕，德吉白玛，旺 扎，等．林芝地区森林火灾的年际变化
特点及致灾原因分析［J］． 林业调查规划，2010，35（3）：11－15．
［12］ 俞国松，王世杰，容 丽，等．茂兰喀斯特森林主要演替群落的
凋落物动态［J］．植物生态学报，2011，35（10）：1019－1028．
［13］ 单延龙，关 山，廖光煊．长白山林区主要可燃物类型地表可燃
物载量分析［J］．东北林业大学学报，2006，34（6）：34－36．
［14］ 代栓发．太白山自然保护区林火隐患及预防对策［J］．陕西林业
科技，2002（1）：37－39．
［15］ 罗永忠，车克钧，蒋志荣．祁连山林区森林可燃物含水率变化规
律研究［J］．甘肃农业大学学报，2005，40（2）：239－244．
［16］ 春敏莉，谢宗强，赵常明，等．神农架巴山冷杉天然林凋落量及
养分特征［J］．植物生态学报，2009，33（3）：492－498．
［17］ 姚树人，韩焕金．中国森林防火现状及其对策的研究［J］．森林防
火，2002（4）：14－16．
［18］ 高国平，郗 娜，冯 莹．辽东地区森林地被可燃物载量的调查
研究［J］．辽宁林业科技，2001（2）：12－15．
［19］ 阚振国， 张 吴．谈西藏林区森林灭火的对策［J］．防护林科技，
2004（4）：48－49．
［20］ 孙 丹，姚树人，韩焕金，等 ．雷击火形成、分布和监测研究综
述［J］．森林防火，2006（2）：11－14．
［21］ 左宗贵 ．南方林区森林火灾的起因与预防 ［J］ ．国土绿化 ，
2004（5）：10．
［22］ 韩恩贤，周新华，张卫兵，等．陕西省森林火灾发生规律及原因
初探［J］．西北林学院学报，1997，12（4）：31－35．
［23］ 杜乐天，王 驹，陈国梁，等．区域性森林大火的真正起因［J］．地
学前缘，2006，13（2）：225－227．
［24］ 单延龙，刘乃安，胡海清，等．凉水自然保护区主要可燃物类型
凋落物层的含水率 ［J］．东北林业大学学报 ，2005，33（5）：41－
43．
［25］ 张广英，高永刚，曹晓波，等．伊春市五营森林可燃物含水率预
测模型初步研究 ［J］. 安徽农业科学，2007，35 （36）：11956－
11958．
［26］ 周志权．辽东 3 种主要林型地被可燃物载量的研究［J］．东北林
业大学学报，2000，28（1）：32－34．
［26］ 高永刚，张广英，顾 红，等．森林可燃物含水率气象预测模型
在森林火险预报中的应用 ［J］． 中国农学通报，2008，24（9）：
171－175．
［27］ 胡海清，金 森．黑龙江省林火规律研究Ⅱ．林火动态与格局影
响因素的分析［J］．林业科学，2002，38（2）：98－102．
［28］ 赵慧颍．大兴安岭东部森林火灾发生的气候条件辨识［J］．林火
研究，2006（2）：18－20．
［29］ 王明玉，舒立福，田晓瑞，等．林火在空间上的波动性及其对全
球变化的响应（Ⅱ）［J］．火灾科学，2003，12（3）：170－175．
［30］ 徐海峰，于占字 ．北京市森林火灾发生的原因、时间及对策分
析［J］．森林防火，2005（2）：24－26．
［31］ 申洁梅，夏艳芳，张麦记．河南省森林火因分析及管理对策［J］．
河南林业科技，2005，25（3）：24－26．
［32］ 张思让，张冬红，景海斌，等．宝鸡市森林火灾发生规律与对策［J］．
陕西林业科技，1998（4）：54－56．
［33］ 李先敏 ．陕西秦岭地区森林火灾相关性分析 ［J］．森林防火 ，
2005（3）：22－23．
［34］ 狄丽颖，张爱国，张艳丽，等．山西省森林火灾的年变化特点和
致灾原因分析［J］．森林防火，2007（2）：19－22．
［35］ 郭广猛．东北地区特大森林火灾的分布规律探讨［J］．地学前缘，
2004，11（2）：524．
［36］ 李忠琦，张淑云，张春梅，等．大兴安岭林区雷击火发生的相关
条件研究［J］．林火研究，2004（4）：19－21．
（责任编辑 王 珞）
（责任编辑 田宇曦）
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
（上接第 4550页）
葱）、S. nipponicus 和本试验样品为一个分支， 其余
各样本为一个分支， 其中本试验样品与 S. gitri-
queter 亲缘关系最近， 并且又与 S. nipponicus 聚为
一类。 但本试验样本与 S. gitriqueter 的自展支持率
为 100％，所以确定为一个独立的类群。
3 讨论
水葱作为中国高原湿地中常见的分布广泛的
挺水优势群落，是很好的环境指示植物，并对于湿
地水体净化、水生植被演替都有重要的意义，同时
也是重要的湿地景观植物。 但国内外相关研究却较
少。 水葱属有很多种类，但都没有系统归类和鉴别，
如研究所检索到的这 14 种都没有很好的中文译名
和鉴别。 特别是关于水葱的分子生物学的研究，属
内各种的明确定位以及遗传关系基本空白。 通过
ITS 序列分析可知， 本试验样品虽然与三棱水葱亲
缘关系最近，但自展支持率为 100％，所以很可能是
一个独立的类群。 希望以后有更多的关于水葱属植
物以及其他高原湿地植物的研究，以丰富中国高原
湿地植被的知识，为中国高原湿地植物的保护和利
用奠定分子生物学基础。
参考文献：
［1］ 王建波，陈家宽．核 rRNA 的 ITS 序列在被子植物系统与进化研
究的应用［J］．植物分类学报，1999，37（4）：407－416．
［2］ 王小全，洪 德．植物分子系统学近五年的研究进展概况［J］．植
物分类学报，1997，35（5）：465－480．
［3］ 赵志礼，董 辉 ．核糖体 DNA ITS 区序列在植物分子系统学研
究中的价值［J］．植物资源与环境学报，2000，9（2）：50－54．
［4］ 李晓贤，周浙昆．单子叶植物高级分类阶元系统演化：matK、rbcL
和 18 S rDNA序列的证据［J］． 植物分类学报，2007，45（2）：113－
133．
［5］ 史全良，诸葛强，黄敏仁，等．用 ITS 序列研究杨属各组之间的系
统发育关系［J］．植物学报，2001，43（3）：323－325．
［6］ 刘华晶，许修宏，姜廷波，等．基于 ITS 序列分析探讨大兴安岭地
区野生黑木耳菌株的遗传多样性［J］．四川农业大学学报，2011，
29（1）：41－44．
［7］ 赵卫国，潘一乐，张志芳． 桑属植物 ITS 序列研究与系统发育分
析［J］．蚕业科学，2004，30（1）：11－13．
［8］ 赵志国．基于生物信息技术对部分禾本科植物系统分类研究［D］．
山西太谷：山西农业大学，2005．
邹林红：林芝县天然林林下可燃物载量研究 4565