全 文 ：海拔（m）
568
730
1134
1634
1763
1680
采集地点
贵阳市药用植物园
贵阳市息烽县野外采集
黔南州头花蓼药植基地
黔南州榕江县栽麻乡山坡
六盘水 GAP 药植基地
六盘新场村岩石边
名称
头花蓼
头花蓼
头花蓼
头花蓼
头花蓼
头花蓼
编号
MPC-01
MPC-02
MPC-03
MPC-04
MPC-05
MPC-06
表 1 不同来源头花蓼编号及采集地点
贵州苗药头花蓼rDNAITS序列分析
牛宪立， 梅露露， 姬可平， 王晓明， 魏妮娜
（遵义医学院珠海校区，广东 珠海 519041）
摘 要：以改良 CTAB 法提取头花蓼的基因组 DNA，采用通用引物对不同来源头花蓼的 rDNA ITS 序列进行 PCR 扩增、测序
和聚类分析。结果表明，不同来源头花蓼有 13 处变异位点，序列长度变异范围为 661～666 bp，序列差异主要集中在 ITS1 区与 ITS2
区。 rDNA ITS 序列可作为分子水平鉴定头花蓼的参考依据。
关键词：头花蓼； rDNA ITS 序列； 聚类分析
中图分类号：R29；Q75 文献标识码：A 文章编号：1004-874X（2013）17-0143-03
Analysis of rDNA ITS sequences from Polygonum capitatum
NIU Xian-li, MEI Lu-lu, JI Ke-ping, WANG Xiao-ming, WEI Ni-na
(Zhuhai Campus, Zunyi Medical College, Zhuhai 519041, China)
Abstract：Total genomic DNA was extracted from Polygonum capitatum by a modified cetyltrimethyl ammonium bromide (CTAB)
protocol. The purified products of PCR amplifications were directly sequenced, associated with rDNA ITS sequences in triplicate, using
consensus primer pairs. Nucleotide sequence analysis, phylogenetic tree and homology were performed with Clustal X software and
DNAMAN programme based on DNA ITS sequences. The results indicated that the sequences of rDNA ITS were 661~666 bp in P.
capitatum, and 13 variable sites, mainly concentrated in the ITS1 and ITS2 area. We argued that rDNA ITS sequences could be applied to
explore molecular identification to determine the sampled eco-geographic origins in P. capitatum.
Key words: Polygonum capitatum; rDNA ITS sequences; cluster analysis
头花蓼（Polygonum capitatum Buch.-Han.ex D.Don）为
贵州道地苗药，别名石莽草、小红藤、满地红、红花地丁
等，为多年生匍匐草本植物，属蓼科蓼属。 其药性热，味
苦、涩，是贵州省近 10 年中药现代化重点发展的“六大苗
药”和“十五”期间重点培育的“七大中药产业链”之一，贵
州省已建立了多个通过国家认证的头花蓼 GAP 种植基
地。 头花蓼以全草入药，具有清热利湿、解毒止痛、活血散
瘀及利尿通淋之功效，主要用于治疗泌尿系统感染、肾盂
肾炎、膀胱炎、尿路结石、风湿痛、跌打损伤等 [1-2]，具有广
泛临床应用价值。 以头花蓼为独有成分的热淋清胶囊更
是常用处方药， 以其为主要成分的其他制剂也在不断研
发中，具有巨大的商业价值。
目前， 对头花蓼的研究主要集中在其化学成分及药
理作用、显微鉴别和栽培技术等方面。 王祥培等 [3]对不同
产地野生与栽培头花蓼中的总黄酮含量进行比较， 发现
存在一定的差异，提示生长环境对药材质量有影响。 吴红
梅等 [4]采用高效液相色谱法有效地鉴别了头花蓼及其混
淆品头状蓼。 为提高头花蓼的质量和产量，孙长生等 [5]在
多年研究和田间试验的基础上， 总结规范了头花蓼种植
技术。 近几年，随着头花蓼市场价值的提高，对头花蓼分
子生物学方面的研究也逐渐成为热点。 因此，本研究利用
现代分子生物学 DNA 条形码技术对贵州道地苗药头花
蓼进行鉴定、分析，初步获得了从分子水平对头花蓼进行
鉴定的标记序列。
1 材料与方法
1.1 试验材料
试验用头花蓼分别收集于贵阳市、贵州黔南州、六盘
水等地的 GAP药植基地和野外采集， 形态学鉴定由广东
省珠海市食品药品监督管理局药检所完成。样品具体来源
及编号见表 1。
主要试验仪器：电子天平（北京赛多利斯天平有限公
司）；UV-2550 紫外-可见分光光度计 （日本岛津公司）；
PCR 扩增仪（珠海市黑马医学仪器有限公司）；恒温水浴
箱 （北京长源实验设备厂）；WFH-202B 紫外透射分析仪
（上海精科实业有限公司）等。
1.2 试验方法
1.2.1 基因组 DNA 提取及纯度检测 采用 CTAB 法 [6]提
取头花蓼基因组 DNA。 取 2 μL基因组 DNA，加入 48 μL
收稿日期：2013-04-25
基金项目： 贵州省中医药管理局中医药民族医药科学技术研究
项目（QZYY2010-65)
作者简介：牛宪立（1975-），男，硕士，实验师，E-mail：nxl2008gd
@163.com
通讯作者：姬可平（1956-），男，教授，E-mail：jlhjxj@sina.com
广东农业科学 2013 年第 17 期 143
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DOI:10.16768/j.issn.1004-874x.2013.17.040
总长度（bp）
661
661
662
665
666
665
（G+C）百分含量（%）
61.12
61.72
62.08
62.11
61.41
60.75
ITS2
253
253
254
254
258
255
ITS1
243
243
243
246
243
245
名称
MPC-01
MPC-02
MPC-03
MPC-04
MPC-05
MPC-06
表 3 头花蓼 rDNA ITS 序列
长度（bp）
M 1 2 3 4 5 6
2000bp
750bp
500bp
M：DNA 标准参照物（DL2000）；1~6：样品
图 1 ITS 序列 PCR 扩增产物电泳结果
图 2 不同来源头花蓼 rDNA ITS 序列系统进化树
DNA 浓度(μg/ml)
80
480
340
100
460
440
A260/A280
1.143
1.714
1.619
2.000
1.484
1.285
A280
0.007
0.028
0.021
0.005
0.031
0.035
A260
0.008
0.048
0.034
0.010
0.046
0.045
样品编号
MPC-01
MPC-02
MPC-03
MPC-04
MPC-05
MPC-06
表 2 不同来源头花蓼 DNA 浓度
TE缓冲液稀释， 取 DNA液体 10 μL再加 3 mL ddH2O于
石英杯中，以 TE 缓冲液作空白对照，用紫外分光光度计
测定其在 260、280 nm 处的吸光度值， 根据 OD260/OD280值
判断 DNA的纯度。
1.2.2 不同来源头花蓼中 rDNA ITS 序列的 PCR 扩增
rDNA ITS 序列的通用引物序列如下：P1(5′-CGTAACAAG
GTTTTCGTAGGTGAAC-3′ )，P2 (5′-TTATTGATATGCTTA
AACTCAGCGGG-3′)，引物由上海生工生物工程有限公司
合成。 ITS序列 PCR扩增反应在50 μL PCR反应体系中进
行， 其中，10× buffer 5.0 μL，2.5 mmol/L dNTP 4.0 μL，10
μmol/L ITSF、R 各 1.0 μL， 模板 DNA 2.0 μL，Taq 酶 0.5
μL。 PCR 扩增反应条件：94℃预变性 3 min；94℃变性 0.5
min，54℃退火 45 s，72℃复性 1 min，5 个循环 ；72℃延伸
10 min。
1.2.3 检测不同来源头花蓼 PCR 产物纯度 取 6 μL
PCR 扩增产物与 2 μL 溴酚蓝混匀后， 用 1.5%琼脂糖凝
胶、0.5×TBE 缓冲液、120 V 直流电压电泳 40 min，将凝胶
置于 WFH-202B暗箱式紫外透射仪中进行纯度检测。
1.2.4 各样品 rDNA ITS 序列的测定、序列分析 各样品
PCR产物在浓度为 1.5％的琼脂糖凝胶上电泳， 紫外透射
分析仪中检测纯度后， 送深圳华大基因公司对各样品测
序。 运用 Clustal X2.0 软件对测序所得各个不同来源头花
蓼碱基序列进行分析，比较各样品序列碱基差异，构建系
统发育树。
2 结果与分析
2.1 头花蓼基因组 DNA纯度检测
应用紫外分光光度计检测不同来源头花蓼样品的
DNA纯度，测得吸光度数值见表 2。 结果显示，DNA 浓度
最高值为 440 μg/mL， 最低值为 80 μg/mL；A260最高值为
0.048， 最低值为 0.01；A280 最高值为 0.035， 最低值为
0.005；A260/A280比值在 1.1～2.0 之间，所有样品达到 PCR 扩
增标准。
2.2 PCR扩增产物电泳图谱
将不同来源头花蓼 6 个 DNA 样品用 rDNA ITS 序列
通用引物进行 PCR 扩增， 后经电泳检测得到电泳结果见
图 1。 结果显示，PCR 扩增产物条带 ITS 序列的长度都在
600~700 bp 之间，电泳条带清晰单一，符合测序要求。
2.3 测序结果及序列分析
经琼脂糖凝胶电泳检测，rDNA ITS 序列 PCR 扩增产
物均符合测序标准，各样品由深圳华大基因公司进行双向
测序。 运用 Clustal X2.0 软件比对分析不同来源头花蓼
rDNA ITS 序列， 得到 6 个样品的 ITS 区序列分析结果，
（表 3）。
从表 3可以看出，所示 ITS序列变异位点为 13个。序
列长度变异范围为 661～666 bp，ITS1 区长度 243～246 bp，
1TS2区为 253～258 bp。6个样品的 ITS序列差异主要集中
在 ITS1 区与 ITS2 区 ， 碱基变异率分别为 19.92％和
15.12％。
2.4 系统进化树构建
利用 Clustal X2.0 软件， 将测得的不同来源头花蓼
rDNA ITS碱基序列分别构建系统进化树，结果（图 2）表明，
以 rDNA ITS序列为基础构建的系统进化树表现出相似的
结果，尽管该系统进化关系的整体同源性低于 90%，来自
贵阳和黔南州的头花蓼资源形成两个分支，但与来自六盘
水的比较，它们仍然表现出很近的亲缘关系。
2.5 GenBank数据库登录号申请
将本试验所得的 rDNA ITS 序列 6 个碱基序列通过
NCBI BankIt 自带软件提交于 GenBank 数据库中，获得的
序列号为 EF672843～EF672848。
3 结论与讨论
rDNA ITS 是分子系统进化分析中最常用的序列，能
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有效解决种属间的分类问题。 中国科学院青岛生物能源
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微藻的分子鉴定中选取 4 条常用分子鉴定基因：18S 基
因、内转录间隔区（ITS）、内转录间隔区 2（ITS-2）和叶绿体
rbcL 基因，筛选出最为适用的小球藻鉴定基因，结果显示
ITS 序列变异程度高，片段长度短，序列长度在种间变异
较大，而在小球藻种内高度保守，适用于小球藻内种的鉴
定。
本研究选用 rDNA ITS序列比，对贵阳市、黔南州以及
六盘水 3 个地区栽培品和野生品共 6 个样品进行遗传分
析， 其中编号为 MPC-01 （贵阳市药用植物园）、MPC-03
（黔南州药用植物基地）、MPC-05（六盘水药植基地）的为
栽培品， 编号为 MPC-02 （贵阳市）、MPC-04 （黔南州）、
MPC-06（六盘水药植基地）的为野生品。 从进化树分析可
以看出，MPC-04 号样品与 MPC-01 号样品之间差异性最
大，说明黔南州地区野生品较栽培品变异度大，六盘水基
地位于贵州省西北部，纬度较贵阳市高，地域环境对头花
蓼遗传变异有明显改变。 rDNA ITS 序列可以有效区分不
同来源头花蓼，可以作为蓼科植物头花蓼的分子标记。
本研究通过对不同产地头花蓼的 ITS 序列比较和分
析，在分子水平上找到了头花蓼序列变异位点，这些位点
可以作为鉴别头花蓼道地品种和混淆品的分子标记，而
且为头花蓼的选种、 引种以及种质资源基因库的建立奠
定了基础。
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