全 文 ：3 讨论
转基因何首乌毛状根在基本培养基 MS 中的生
长代谢曲线初步反映了毛状根生物量的积累趋势。
诱导子浓度效应有 2 种类型:一种是反应饱和
型，即次生产物的合成随诱导子浓度增加而增加，达
到最大值后稳定;另一种是最适浓度型，即诱导反应
要求最适浓度下诱导子表现出最强的活性〔9〕。在
药用植物组织培养中主要是最适浓度型。有些诱导
量必须考虑让二者的作用达到平衡，使之既能在一
定程度上刺激细胞发生过敏反应，合成次生代谢产
物，又不严重影响细胞的生长。
不同时期的细胞对诱导子的反应灵敏度不同，
只有处于一定生长时期的细胞才能有效地接受诱导
子信号，此时诱导子表现出最强的活性。本研究利
用短期诱导实验考察了水杨酸和茉莉酮酸甲酯 2 种
诱导子的最优诱导浓度，但是由图 2 和图 3 可以看
出转基因何首乌毛状根的基础培养基中加入诱导子
茉莉酮酸甲酯，所选的各种浓度都对毛状根的生长
有严重的抑制作用。可见，实验条件下茉莉酮酸甲
酯不利于转基因何首乌毛状根的累积。而加入水杨
酸，浓度为 0. 001 mmol /L时在迟滞期和对数期的中
期时转基因何首乌毛状根的生长较在基本培养基
MS上的生长速度快，但在对数期的后期时水杨酸对
其生长又有抑制作用，可看出此期的转基因何首乌
毛状根对诱导子水杨酸的敏感较强，但是此期又是
次生代谢产物的累积时间，若此期毛状根的生长受
抑制说明水杨酸不能用作诱导何首乌毛状根的次生
代谢产物的生物合成量增加的诱导子，因为此浓度
下的水杨酸不能保证转基因何首乌毛状根的生物量
不受影响。其他所选浓度都对毛状根的生长有严重
的抑制作用。可见，水杨酸不利于转基因何首乌毛
状根次生代谢产物的提高。即所选浓度下的茉莉酸
甲酯和水杨酸都是不利于诱导转基因何首乌毛状根
生长的诱导子。
参 考 文 献
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黑三棱花粉活力与柱头可授性研究
孙亚昕，巢建国* ，谷 巍，吴启南，韩 怡
(南京中医药大学药学院，江苏 南京 210023)
摘要 目的:研究黑三棱花粉活力与柱头可授性，为杂交育种工作提供理论依据。方法:采用琼脂培养基萌发
法测定花粉活力，研究不同培养基、采集时间、贮藏条件对花粉活力的影响;用联苯胺-过氧化氢法测定柱头可授性。
结果:最佳的花粉培养基为:10%蔗糖 + 1%琼脂 + 0. 01%MgSO4·7H2O + 0. 01% Ca(NO3)2·3H2O;开花第 3 天柱头
可授性最强;低温干燥能延长花粉的贮藏时间，－ 70 ℃干燥条件下花粉可贮藏 50 d。结论:黑三棱人工授粉的最
佳时期为开花后 2 ～ 3 d。
关键词 黑三棱;花粉活力;柱头可授性
中图分类号:Ｒ282. 2 文献标识码:A 文章编号:1001-4454(2013)08-1221-04
收稿日期:2012-11-21
基金项目:江苏高校优势学科建设工程资助项目(ysxk-2010) ;国家自然科学基金(81073002) ;南京中医药大学中药学一级学科开放课题
(2011ZYX1-008) ;江苏省高等学校“中药资源化学研究”优秀科技创新团队(2011)
作者简介:孙亚昕(1989-) ，女，在读硕士研究生，专业方向:中药资源与品质评价;Tel:13813051665，E-mail:lovesunshine0603@ 163. com。
* 通讯作者:巢建国，Tel:13851562488，E-mail:jgchao1016@ 163. com。
·1221·Journal of Chinese Medicinal Materials 第 36 卷第 8 期 2013 年 8 月
DOI:10.13863/j.issn1001-4454.2013.08.009
黑三棱 Sparganium stoloniferum Buch. -Ham. 为
黑三棱科多年生草本植物，其块茎具有破血行气、消
积止痛的功效，主治癥瘕痞块、瘀血经闭、胸痹心痛、
食积胀痛〔1〕，是临床上常用的中药之一。花粉是种
子植物遗传信息的载体，早期采集、贮存花粉，花粉
活力测定是进行杂交授粉的基础〔2〕。花粉保持活
力的时间长短与柱头可授期长短结合在一起，保证
受精过程的顺利进行。目前对黑三棱的研究主要集
中在药理、药效成分上，笔者尚未见有关其花粉活力
和柱头可授性的报道。本文对黑三棱花粉的活力及
柱头可授性进行了研究，旨在探索花粉萌发最佳培
养基，确定保存花粉的合适方法与柱头可授期，为黑
三棱种质资源创新研究和杂交育种工作提供参考依
据。
1 材料与方法
1. 1 材料采集与处理 材料采自南京中医药大学
药用植物园，经南京中医药大学中药资源学教研室
巢建国教授鉴定为黑三棱科植物黑三棱 Sparganium
stoloniferum Buch. -Ham. 的花粉。试验时间为 2012
年 5 月中旬至 7 月初，自黑三棱主茎顶端雄花散粉
开始，采集当天散出的花粉，装入离心管中，避光，备
用。
1. 2 花粉活力测定 在预试验基础上，本试验采
用琼脂培养基萌发法〔3，4〕，以 10%蔗糖 + 1%琼脂为
基本培养基，不加任何营养元素为空白对照组
(CK) ，对不同营养因素进行单因子试验。H3BO3、
KNO3、MgSO4·7H2O、Ca(NO3)2·3H2O 培养液各设
置 5 个梯度:0. 01%、0. 05%、0. 1%、0. 2%、0. 5%，
分别进行单因子筛选。各处理培养基用微波炉加热
溶解后倾倒于载玻片上，呈一均匀球形薄层，冷却后
用毛笔弹撒接种适量花粉，放入垫有 2 层湿润滤纸
的培养皿中，在 25 ℃恒温箱内黑暗培养 2 h 后观
察，以花粉管长度大于花粉粒直径作为萌发的标志，
统计萌发率。试验重复 3 次，每张玻片观察 3 个视
野，试验数据采用 SPSS 17. 0 统计分析。
在单因子试验的基础上，选取对黑三棱花粉萌
发影响较大的 3 因子进行正交试验设计。操作方法
同上。筛选出花粉萌发率最高的培养基作为花粉后
续贮藏期间的活力测定配方。
1. 3 不同采集时间花粉活力测定 选晴好天气，
上午 8∶ 00 开始，至下午 4∶ 00，每隔 2 h采集花粉，采
粉后立即测定其萌发率，比较各个采集时间的花粉
活力。
1. 4 不同贮藏方法花粉活力测定 采集当天新鲜
花粉，分别进行湿存和干存。湿存是将新鲜花粉直
接存放于 1. 5 mL离心管中，干存是将新鲜花粉经真
空干燥处理至恒重，混匀分装于 1. 5 mL 离心管中。
在 25、4、－ 18、－ 70 ℃分别贮藏 2、4、6、8、10、15、
30、40、50、60 d后用“1. 2”项下筛选出的最佳萌发
培养基进行花粉活力测定。
1. 5 柱头可授性测定 采用联苯胺-过氧化氢法
测定黑三棱的柱头可授性〔5〕。早上 10∶ 00 采集开花
天数不同的雌花的柱头，将其浸入含有联苯胺-过氧
化氢反应液(1 %联苯胺∶ 3 %过氧化氢∶水 = 4∶ 1∶
22)的凹面载片中，用体视显微镜观察。若柱头具
可授性(呈现出过氧化物酶活性) ，则柱头周围的反
应液呈蓝色并有大量气泡出现，根据气泡数的多少
确定其柱头可授性的强弱，试验重复 3 次。
2 结果与分析
2. 1 培养基组分对花粉活力的影响
2. 1. 1 花粉萌发的单因子试验:花粉萌发结果表
明，H3BO3、KNO3、MgSO4·7H2O、Ca(NO3)2·3H2O单
一组分对花粉的萌发都有显著的影响(表 1)。加入
0. 01%的 Ca(NO3)2·3H2O、0. 05% MgSO4·7H2O 后
萌发率分别为 41. 4%和 39. 7%，显著高于对照组萌
发率(20. 6%) ，且它们两者之间萌发率差异不显
著;H3BO3 仅在浓度为 0. 1% 时，萌发率达到
22. 8%，高于对照组;KNO3 在 0. 1%、0. 2%时萌发
率高于对照组，达到 21. 8%和 22. 6%;以上组分在
浓度为 0. 5%时花粉均无萌发的现象。
2. 1. 2 花粉萌发的正交试验:在单因子试验的基
础上，选取对黑三棱花粉萌发影响较大的H3 BO3、
表 1 不同因素对黑三棱花粉萌发率的影响(珔x ± s)
浓度 /%
萌发率 /%
H3BO3 KNO3 MgSO4·7H2O Ca(NO3)2·3H2O
0. 01 17. 4 ± 0. 6EFef 16. 4 ± 1. 3Ff 30. 1 ± 1. 6Bb 41. 4 ± 1. 4Aa
0. 05 19. 6 ± 1. 0DEde 16. 6 ± 0. 7Ff 39. 7 ± 2. 1Aa 30. 8 ± 0. 4Bb
0. 1 22. 8 ± 2. 3Cc 21. 8 ± 0. 9CDcd 18. 1 ± 0. 6Efef 21. 6 ± 1. 1CDcd
0. 2 17. 7 ± 2. 5EFe 22. 6 ± 1. 0CDc 16. 1 ± 0. 1DEde 17. 6 ± 0. 2 EFef
注:不同大、小写字母分别表示在 0. 01、0. 05 水平上存在差异
·2221· Journal of Chinese Medicinal Materials 第 36 卷第 8 期 2013 年 8 月
MgSO4·7H2O和 Ca(NO3)2·3H2O 3 个因子，各设 3
水平，设计正交试验(表 2)。结果表明，各处理组合
对花粉萌发的影响显著，Ca(NO3)2·3H2O 与 MgSO4
·7H2O 两者以 0. 01%浓度结合花粉萌发率达到了
63. 0%，显著高于对照组(46. 7%)和其他组合。
H3BO3 与其他因素正交时在一定程度上都抑制了花
粉的萌发。因此，最佳的花粉萌发培养基组成为:
10%蔗糖 + 1%琼脂 + 0. 01%MgSO4·7H2O + 0. 01%
Ca(NO3)2·3H2O。
2. 2 不同采集时间对花粉活力的影响 上午 8∶ 00
开始，至下午 4∶ 00，间隔 2 h 采集的花粉萌发率分
别为 47. 4% 、62. 6%、37. 7%、29. 6%、26. 8%。试
验结果表明，花粉在 10∶ 00 左右的萌发率最高，明显
高于下午花粉萌发率。这一结论与黑三棱花粉集中
散粉的时间一致。
表 2 黑三棱花粉萌发的正交试验(珔x ± s)
序号
H3BO3
/%
MgSO4·7H2O
/%
Ca(NO3)2·3H2O
/%
萌发率
/%
1 0 0. 01 0. 01 63. 0 ± 5. 0 Aa
2 0 0. 03 0. 05 49. 5 ± 7. 2 Bb
3 0 0. 05 0. 1 48. 2 ± 2. 2 Bb
4 0. 05 0. 01 0. 05 22. 9 ± 3. 8 Dd
5 0. 05 0. 03 0. 1 16. 8 ± 0. 9 Dde
6 0. 05 0. 05 0. 01 33. 3 ± 6. 1 Cc
7 0. 1 0. 01 0. 1 17. 6 ± 1. 7 Dde
8 0. 1 0. 03 0. 01 16. 2 ± 0. 3 Dde
9 0. 1 0. 05 0. 05 14. 9 ± 1. 2 De
CK 0 0 0 46. 7
注:不同大、小字母分别表示在 0． 01、0． 05 水平上存在差异
图 1 不同贮藏方法对黑三棱花粉活力的影响
2. 3 不同贮藏方法对花粉活力的影响 采用不同
包装和温度贮藏黑三棱花粉，并用筛选出的最佳培
养基测定花粉活力(图 1)。结果表明，随着花粉贮
藏时间的延长，花粉萌发率均降低，尤其在室温不干
燥条件保存下第 2 天就失去活力;干法保存优于湿
法保存。其中，干燥后的花粉在 － 70 ℃条件下贮藏
后活力最高，贮藏 50 d 后萌发率仍能达到 8. 51%，
显著高于其他贮藏条件下花粉的萌发率。
2. 4 柱头可授性测定结果 将开花天数不同的雌
花柱头浸入含有联苯胺-过氧化氢反应液的凹面载
玻片中，发现柱头周围的反应液没变成蓝色，但柱头
附近产生大量气泡。黑三棱开花当天已具备活力，
开花第 3 天柱头可授性最强;开花第 4 天开始，雌花
柱头逐渐变成褐色并开始弯曲，过氧化物酶活性逐
渐消失，可授性明显减弱，观测时仅能产生少量气
泡;第 6 天过氧化物酶活性基本消失，柱头失去可授
性。
3 讨论
3. 1 不同离体培养基对花粉萌发有显著影响 黑
三棱最佳的花粉萌发培养基为:10%蔗糖 + 1%琼脂
+ 0. 01% MgSO4·7H2O + 0. 01% Ca(NO3)2·3H2O。
其中，钙主要影响花粉萌发速度和花粉管的生长速
度〔6〕，还可以抵消花粉萌发时的集体效应，利于观
察。镁的作用与钙基本类似，二者以适宜浓度结合
更有利于花粉的萌发。硼酸能增加花粉对糖的吸
收、运转和代谢，增加氧的吸收，并促进果胶物的合
成，有利于花粉管壁的形成〔7〕，但在本试验中，硼酸
与钙、镁结合后，花粉管生长缓慢，反而不利于花粉
的萌发，具体原因还有待进一步的研究。
3. 2 花粉活力和柱头可授期 黑三棱花粉在上午
10∶ 00 左右集中散粉，萌发率达到最高(62. 6%) ，明
显高于下午花粉萌发率，这可能是因为花粉经历了
中午的高温，其含水量会发生变化，而温度和花粉含
水量对花粉的萌发有很大影响。在其贮藏方法研究
中，－ 70 ℃真空干燥处理可明显延长黑三棱花粉活
力，这与低温、干燥处理可降低花粉呼吸作用及其他
生理功能有关。
柱头可授期是花朵成熟过程中的一个重要时
期，它能在很大程度上影响自花传粉率及开花不同
阶段的传粉率。花粉保持活力的时间长短与柱头可
授期长短结合在一起，影响着植物的传粉成功率、自
花传粉率等，保证受精过程的顺利进行。黑三棱的
柱头可授性在开花第 3 天达到最强。因此，在育种
实践中，为了提高授粉的效率，应选取上午 10∶ 00 左
·3221·Journal of Chinese Medicinal Materials 第 36 卷第 8 期 2013 年 8 月
右采集的花粉，对开花第 2 ～ 3 天的雌花柱头进行授
粉。如条件允许可选择将花粉超低温干燥储藏来延
长花粉活力。
参 考 文 献
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·动物药研究·
燕窝中残留羽毛成分的胶原酶法基因组 DNA提取
王羚郦1，陈 念1，2，张威威1，吴国洪1，赖小平1*
(1. 广州中医药大学中药学院，广东 广州 510006;2. 中山火炬职业技术学院生物医药系，广东 中山
528436)
摘要 目的:建立一种从燕窝药材残留的羽毛中快速高效提取基因组 DNA的方法。方法:在对洞燕样品进行
体视镜显微观察的同时，对比加入胶原酶前后对常规基因组提取方法得率的影响，同时对提取的样品进行 PCＲ 扩
增和测序分析。结果:该方法在常规仅使用蛋白酶 K的基础上增加胶原酶处理使得裂解效率明显提高，从而能够
提取得到更多更完整的基因组 DNA分子，采用该方法提取的基因组 DNA可用于后续的 PCＲ扩增及其他分子生物
学操作和分析。结论:该项技术可辅助用于燕窝类生物制品来源物种身份的快速鉴别，对于富含胶原蛋白的各种
动物来源的组织材料具有普遍的适用性。
关键词 金丝燕;燕窝;羽毛;胶原酶;基因组 DNA提取
中图分类号:Ｒ284. 2 文献标识码:A 文章编号:1001-4454(2013)08-1224-03
Study on A Collagenase Protocol to Extract DNA from Ｒemnant Feathers in Edlible Birds Nest
WANG Ling-li1，CHEN Nian1，2，ZHANG Wei-wei1，WU Guo-hong1，LAI Xiao-ping1
(1. School of Chinese Materia Medica，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510006，China;2. Department of Bio-
medicine，Zhongshan Torch Polytechnic，Zhongshan 528436，China)
Abstract Objective:To establish a method for extracting genomic DNA from rudimental bird feather from the precious edible
birds nest(EBN)harvested from the swiftlet cave． Methods:Observed the EBN using endoscopic and studied the influence of adding
collagenase on the extracting yield of DNA． PCＲ amplification and sequencing for the extraction was also conducted． Ｒesults:Collage-
nase was used in addition to protease K which could substantively increase the DNA yield． The DNA extracted by this method could be
used for PCＲ and other molecular biology analyses． Conclusion:This method can be applied to identify the species types in biological
products，especially for animal tissue materials that rich in collagen.
Key words Swiftlet;Edible birds nest;Feather;Collagenase;Genomic DNA extraction
收稿日期:2012-09-20
基金项目:国家十二五科技支撑计划(2011BA101B02) ;国家自然科学基金(81173498，30672624) ;广东省自然科学基金博士启动项目
(10451040701006101)
作者简介:王羚郦(1981-) ，女，博士，副研究员，研究方向:中药新药开发。
* 通讯作者:赖小平，Tel:15521118819，E-mail:mitogenome@ 126. com。
燕窝为一类昂贵的高档药用滋补品，利用无损
取样技术对其中含有的各种“蛛丝马迹”进行分析，
从而确定或推测来源物种的身份，以判断是否存在
造假等制伪因素，对于燕窝类产品的质量控制及重
建消费者信心具有重要的经济价值和社会意义。
Lin等〔1〕已尝试利用 PCＲ方法对提取自燕窝干品或
·4221· Journal of Chinese Medicinal Materials 第 36 卷第 8 期 2013 年 8 月