全 文 ：收稿日期:2015-07-14
基金项目:国家自然科学基金(81573517);福建省自然科学基金(2011J01074)
作者简介:林文津(1979-)，男，博士，副研究员，主要从事中药资源开发利用研究;Tel:0591-87514999，E-mail:lwj680@ 139. com。
* 通讯作者:魏道智，Tel:0591-83788305，E-mail:weidz888@ sohu. com。
马蓝根、叶矿质营养元素含量及差异表达基因相关分析
林文津1，2，宁书菊3，王小华1，魏道智1*
(1. 福建农林大学生命科学学院，福建 福州 350002;2. 福建省医学科学研究院 /福建省医学测试重点实验
室，福建 福州 350001;3. 福建农林大学作物科学院，福建 福州 350002)
摘要 目的:分析马蓝根与叶营养元素含量差异与相关差异表达基因，为马蓝植物栽培及矿质元素作用的分
子机理研究提供参考。方法:采用电感耦合等离子体原子发射光谱法测定马蓝根与叶中矿质元素，高通量测序方
法测定马蓝叶与根的转录组。结果:马蓝叶 Ca、Mg、Mn、Fe含量高于根，K、Zn、Na、Cu、Ni元素含量低于根。马蓝叶
与根转录组测序差异表达基因分析结果显示，根中丙酮酸激酶与漆酶相关的基因表达量高于叶;而淀粉合成酶、琥
珀酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶、核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶 /加氧酶、光合放氧复合物相关基因表达低于叶。结论:马蓝
根与叶矿质营养元素含量的差异较大，根中与光合作用有关的基因表达一般都是下调，差异表达基因分析结果与
Mg、Mn、Fe、Cu等元素含量测定结果一致。
关键词 马蓝;矿质元素;电感耦合等离子体原子发射光谱法;差异表达基因
中图分类号:Ｒ282. 2 文献标识码:A 文章编号:1001-4454(2016)06-1217-04
DOI:10. 13863 / j. issn1001-4454. 2016. 06. 004
马蓝 Baphicacanthus cusia (Nees)Bremek． 为爵
床科板蓝属植物，主要分布在福建、广东、广西等华
南地区。其叶或茎叶经加工入药为青黛，根茎及根
入药为南板蓝根〔1〕。有清热解毒、凉血消肿等功
效。植物生长发育需要矿质营养元素的参与，根据
其含量的多少又有大量元素与微量元素之分。必需
大量元素有氮、磷、硫、钾、钙、镁、硅，必需微量元素
有铁、锰、锌、铜、硼、钼、氯、钠、镍。此外，药材中的
大量、微量元素也是其药效成分组的一部分〔2-6〕，所
以药用植物中矿质元素的测定对分析植物的营养状
况、生长环境及对人类健康的影响具有重要的意义。
基于下一代测序技术的基因组学与转录组学等
组学技术的发展，大大增强了人们对植物营养及植
物对矿质营养胁迫分子基础的理解。到目前为止，
已有一些可能与提高矿质营养利用率相关的蛋白如
基因编码传感器、转录因子、转运蛋白、代谢酶被鉴
定〔7-9〕，但矿质元素作用的分子机理研究报道较少。
本文采用 ICP-AES检测了福建马蓝根、叶及其土壤
中 K、Ca、Mg、Fe、Cu、Zn、Mn、Ni、Na 9 种元素，探讨
各元素在马蓝植物根、叶中的分布特征，并采用高通
量转录组测序技术测定了马蓝叶与根的转录组，对
马蓝叶与根中矿质元素相关的表达基因进行了比较
分析，为马蓝叶与根矿质元素累积的分子基础提供
参考。
1 材料与方法
1. 1 材料 马蓝根、叶及土壤样本采于福建省莆
田市仙游县书峰乡。剪取马蓝的嫩叶和根尖适量，
用灭菌超纯水冲洗多次，去除叶面的灰尘和根尖上
的泥土，然后用灭菌纱布吸去水分，立即用锡纸包裹
后，在液氮中速冻 15 min 以上，移至液氮罐带回实
验室，保存于 － 85 ℃超低温冰箱备用。
1. 2 仪器 IMA8000 型 ICP-AES 电感藕合等离子
体发射光谱仪(美国 PE 公司)，KQ2200E 型超声波
清洗机(中国昆山市超声仪器有限公司)，AL204 型
电子分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)，5L /H50w
型超纯水机(中国重庆市颐洋企业发展有限公司)，
Allegra 64Ｒ 高速冷冻离心机(美国 Beckman公司)，
T100 PCＲ 仪(美国 Biorad公司)，Nanodrop 2000(美
国 Thermo公司)，Agilent 2100 Bioanalyzer(美国 Agi-
lent 公司)，Illumina HiSeq 2500(美国 Illumina 公
司)。
1. 3 试剂 浓硝酸(优级纯)、质谱调谐液、10 ng /
mL的标准储备液、500 mg /L 的锑、标准中间液、内
标储备液(购自国家钢铁材料测试中心钢铁研究总
院)。ＲN40-EASYspin 植物 microＲNA 快速提取试
剂盒(北京艾德莱生物有限公司)。
1. 4 方法
1. 4. 1 元素测定样品处理:取马蓝叶或根样品适
量，烘箱干燥后取 1. 0 g，精密称定，移至消解罐中，
加入浓硝酸 5 mL，旋紧消解罐盖，摇匀，静置过夜，
第 2 天置 160 ℃烘箱高温消解 4 h，取出，冷却至室
温，移至 50 mL 量瓶中，再用适量超纯水洗涤消解罐
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数次，洗涤液并入同一量瓶中，加入适量超纯水稀释
至刻度，摇匀，作为供试品溶液备用。
1. 4. 2 元素标准品的制备:将 K 元素标准溶液配
制成 100 mg /L的标准储备溶液，Ca、Mg、Fe、Cu、Zn、
Mn、Ni、Na 8 个元素标准溶液一起配制成 100 mg /L
混合标准储备溶液备用。
1. 4. 3 ICP-AES仪器条件:载气流量:15 L /min，辅
助气流量:0. 2 L /min，雾化气流量:0. 55 L /min，射
频功率:1 300 w，蠕动泵速:1. 5 L /min。
1. 4. 4 总 ＲNA 的提取及转录组的测定:按照
ＲN40-EASYspin 植物 microＲNA 快速提取试剂盒说
明书进行。用 Nanodrop 2000 与 Agilent 2100 Bioan-
alyzer检测所提取叶与根 ＲNA 的浓度与纯度，符合
转录组测序样本要求。叶与根转录组测定由北京百
迈客生物科技有限公司完成。
1. 4. 5 差异表达基因分析:对转录组测序得到的
Ｒaw Data 进行数据过滤，去除其中的接头序列及低
质量 Ｒeads 获得高质的 Clean Data。应用 Trinity 软
件将 Clean Data 进行序列组装，获得该物种的 Uni-
gene 库。经随机性检验、饱和度检验等测序文库质
量评估合格后，进行表达量分析，并根据基因在叶与
根中的表达量进行差异表达分析，使用 BLAST 软件
将 Unigene 序列与 NＲ、COG、GO、KEGG、Swiss-Prot
数据库比对，获得矿质元素相关的差异表达基因功
能注释。
2 结果与分析
2. 1 标准曲线的测定 分别准确移取各混合标准
储备溶液 0、0. 2、0. 4、1. 0、2. 0、5. 0 mL于 100 mL容
量瓶中，用 1%硝酸定容，配成相应的系列标准溶
液，在“1. 4. 3”项仪器条件下进行含量测定，绘制校
准曲线，得到相应的回归方程和相关系数，结果见表
1。
表 1 9 种矿质元素标准曲线及相关系数
编号 元素 线性方程 相关系数
线性范围
/(μg /L)
1 K Y = 44. 93X － 3418. 1 0. 99866 200 ～ 5000
2 Ca Y = 99. 35X － 394. 7 0. 99962 200 ～ 5000
3 Mg Y = 232. 8X + 1975. 5 0. 99998 200 ～ 5000
4 Fe Y = 169. 3X － 5028 0. 99972 200 ～ 5000
5 Cu Y = 113. 1X － 482. 6 0. 99994 200 ～ 5000
6 Zn Y = 125. 3X + 104. 8 0. 99990 200 ～ 5000
7 Mn Y = 1247. 1X + 1367. 2 0. 99992 200 ～ 5000
8 Ni Y = 11864. 7X － 11017 0. 99946 200 ～ 5000
9 Na Y = 105248X － 92687 0. 99958 200 ～ 5000
2. 2 加样回收率试验 对马蓝中的 9 种元素进行
了加样回收试验，以验证试验方法的可靠性，各被测
元素平行测定 3 次，取平均值计算回收率，结果各被
测元素的加样回收率均在 94% ～ 105%之间，表明
该分析方法准确度较好。
2. 3 元素的测定 运用 ICP-AES 按照“1. 4. 3”项
仪器条件测定马蓝根、叶及土壤中所含 K、Ca、Mg、
Fe、Cu、Zn、Mn、Ni、Na 9 种矿物元素的含量，并用
SPSS 18. 0 软件进行统计分析，结果见表 2。
表 2 马蓝根、叶及其土壤中 9 种矿质元素含量测定结果(mg/kg)
元素
土壤 根 叶
均值 SD 均值 SD 均值 SD
根与叶比较
K 14704. 00 590. 55 12103. 00 662. 00 10596. 00* 184. 03 ↑
Ca 6628. 33 105. 19 4584. 33 50. 60 4826. 00* 164. 04 ↓
Mg 3171. 67 82. 58 2691. 33 60. 80 3686. 33* 147. 22 ↓
Mn 437. 37 8. 06 218. 93 3. 37 232. 43* 3. 34 ↓
Fe 313. 93 10. 00 144. 03 0. 21 214. 87* 6. 13 ↓
Zn 108. 33 1. 00 64. 04 2. 52 54. 31* 2. 55 ↑
Na 67. 31 1. 35 52. 57 1. 16 38. 48* 0. 66 ↑
Cu 22. 21 0. 79 15. 03 0. 44 4. 86* 0. 13 ↑
Ni 2. 27 0. 04 1. 99 0. 04 1. 15* 0. 01 ↑
注:* 表示与根比较，差异有统计学意义;↑表示根中含量高于叶，↓表示根中含量低于叶
2. 4 元素相关差异表达分析 通过检索马蓝叶与
根差异表达基因注释，发现与元素累积相关的上调
表达基因 11 个，其中与丙酮酸激酶(pyruvate ki-
nase)相关的 2 个，与漆酶(Laccase)相关的 9 个，见
表 3;下调表达基因 27 个，其中与淀粉合成酶
(Starch synthase)相关的 4 个，与琥珀酸脱氢酶
(SDH)相关的 2 个，与核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶 /
加氧酶(rubisco)相关的 2 个，与光合放氧复合物
(oxygen evolving complex)相关的 16 个，与苹果酸脱
氢酶(malate dehydrogenase)相关的 3 个，见表 4。
3 讨论
马蓝根与叶中主要元素分布与土壤一致，属于
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表 3 马蓝叶与根中矿质元素累积相关
的上调表达基因
序号 基因 ID 注释 叶 根 相关元素
1 c52259. graph_c1 pyruvate kinase 4. 44 18. 46 K
2 c52259. graph_c0 pyruvate kinase 4. 51 25. 15 K
3 c60531. graph_c0 Laccase 1. 06 6. 74 Cu
4 c60531. graph_c1 Laccase 1. 15 8. 24 Cu
5 c51402. graph_c0 Laccase 0. 10 1. 35 Cu
6 c35760. graph_c0 Laccase 0. 59 8. 71 Cu
7 c33656. graph_c0 Laccase 0. 08 2. 56 Cu
8 c78720. graph_c0 Laccase 0 1. 67 Cu
9 c73067. graph_c0 laccase 1. 02 56. 66 Cu
10 c72777. graph_c0 laccase 0. 13 69. 57 Cu
11 c81118. graph_c0 laccase 0. 11 1. 94 Cu
K ＞ Ca ＞ Mg型植物。马蓝根、叶与土壤比较，K、Ca、
Mg 这 3 种大量元素含量差异均有统计学意义，K主
要集中在生命活动最旺盛的生长点、形成层、幼叶等
部位。根中 K含量显著高于叶，这可能与马蓝地上
部分物质向根部转运需要较多的 K 有关;Mg 是叶
绿素的成分，叶中 Mg 含量高于根，且有显著性差
异，这可能与叶片叶绿素含量、光合作用需要较多的
Mg有关。
马蓝叶中 Mn、Fe 含量均高于根，Mn 是光合放
氧复合物的组分，是叶绿素形成与维持叶绿体正常
结构必需的元素，在光合作用中有重要的功能。差
异表达基因分析结果亦显示出叶中光合放氧复合物
表达量高于根;Fe能与卟啉结合参与光合作用，它
表 4 马蓝叶与根中矿质元素累积相关的下调表达基因
序号 基因 ID 注释 叶 根 相关元素
1 c67938. graph_c0 Starch synthase 28. 05 6. 49 K
2 c50583. graph_c0 Starch synthase 229. 73 71. 43 K
3 c35495. graph_c0 Starch synthase 91. 83 23. 59 K
4 c61028. graph_c0 Starch synthase 84. 55 18. 02 K
5 c61674. graph_c2 SDH 9. 93 0 K
6 c61674. graph_c0 SDH 16. 52 0 K
7 c35032. graph_c0 rubisco 203. 24 64. 77 Mg
8 c64209. graph_c0 rubisco 332. 59 93. 69 Mg
9 c66543. graph_c1 oxygen evolving complex 59. 09 8. 22 Mn
10 c52392. graph_c0 oxygen evolving complex 32. 31 0. 26 Mn
11 c57070. graph_c0 oxygen evolving complex 22. 25 0. 73 Mn
12 c36132. graph_c0 oxygen evolving complex 45. 43 2. 63 Mn
13 c57905. graph_c0 oxygen evolving complex 41. 70 0. 35 Mn
14 c71641. graph_c0 oxygen evolving complex 1608. 28 13. 73 Mn
15 c71670. graph_c0 oxygen evolving complex 883. 35 4. 73 Mn
16 c35018. graph_c0 oxygen evolving complex 894. 55 6. 06 Mn
17 c71677. graph_c0 oxygen evolving complex 701. 61 4. 99 Mn
18 c58129. graph_c1 oxygen evolving complex 4. 98 0. 41 Mn
19 c73449. graph_c0 oxygen evolving complex 29. 35 2. 84 Mn
20 c35372. graph_c0 oxygen evolving complex 22. 30 4. 86 Mn
21 c50640. graph_c0 oxygen evolving complex 335. 52 4. 68 Mn
22 c71854. graph_c0 oxygen evolving complex 73. 09 3. 40 Mn
23 c56184. graph_c0 oxygen evolving complex 45. 20 1. 57 Mn
24 c70832. graph_c0 oxygen evolving complex 39. 98 0. 13 Mn
25 c64637. graph_c0 malate dehydrogenase 167. 13 9. 27 Mn
26 c71906. graph_c0 malate dehydrogenase 280. 49 0. 27 Mn
27 c35385. graph_c0 malate dehydrogenase 22. 70 3. 47 Mn
还参与叶绿素生物合成形成原叶绿素酸酯，所以叶
中与光合作用相关的核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶 /加
氧酶相关基因表达量也明显高于根。差异表达基因
分析结果与元素含量测定结果基本一致。漆酶是一
种结合多个铜离子的蛋白质，属于铜蓝氧化酶，存在
菇、菌及植物中，马蓝根中 Cu 含量高于叶，与 Cu 元
素相关的漆酶表达量亦高于叶，差异表达基因分析
结果与元素含量测定结果基本一致。
K在碳水化合物代谢、呼吸作用及蛋白质代谢
中起重要作用。在细胞内可作为几十种酶的活化
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剂，如丙酮酸激酶、果糖激酶、苹果酸脱氢酶、琥珀酸
脱氢酶、淀粉合成酶等。丙酮酸激酶使磷酸烯醇式
丙酮酸和 ADP变为 ATP和丙酮酸，是糖酵解过程中
的主要限速酶之一，苹果酸脱氢酶、琥珀酸脱氢酶是
三羧酸循环的关键酶，本实验结果显示根尖中丙酮
酸激酶表达量高于叶，说明根系中的呼吸代谢和碳
水化合物转化高于叶片，差异表达基因分析结果与
元素含量测定结果基本一致;但叶中苹果酸脱氢酶、
琥珀酸脱氢酶、淀粉合成酶表达量高于根，同时淀粉
酶增加，说明碳水化合物的转化和贮藏紧密结合，有
别于根系的呼吸产能代谢，其原因有待于下一步深
入研究。根中 Zn、Ni、Na 元素高于叶，但未见明显
上调或下调的差异表达基因。
参 考 文 献
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