全 文 ：１５２６－１５３５
８／２０１６
草　业　科　学
ＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＬ　ＳＣＩＥＮＣＥ
第３３卷第８期
Ｖｏｌ．３３，Ｎｏ．８
ｈｔｔｐ：??ｃｙｋｘ．ｌｚｕ．ｅｄｕ．ｃｍ
ＤＯＩ：１０．１１８２９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００１－０６２９．２０１５－０５７１
王瑞晶，李培英，张延辉．偃麦草ＥＳＴ－ＳＳＲ标记开发及应用．草业科学，２０１６，３３（８）：１５２６－１５３５．
Ｗａｎｇ　Ｒ　Ｊ，Ｌｉ　Ｐ　Ｙ，Ｚｈａｎｇ　Ｙ　Ｈ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｅｌｙｔｒｉｇｉａ　ｒｅｐｅｎｓ　ＥＳＴ－ＳＳＲ　ｍａｒｋｅｒｓ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ．Ｐｒａｔａｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１６，
３３（８）：１５２６－１５３５．
偃麦草ＥＳＴ－ＳＳＲ标记开发及应用
王瑞晶，李培英，张延辉
（新疆农业大学草业与环境科学学院，新疆草地资源与生态自治区重点实验室，新疆 乌鲁木齐８３００５２）
摘要：利用ＮＣＢＩ数据库中偃麦草（Ｅｌｙｔｒｉｇｉａ　ｒｅｐｅｎｓ）ＥＳＴ序列开发偃麦草ＥＳＴ－ＳＳＲ引物，并对４７份偃麦草资源进行
遗传多样性分析，验证所开发ＥＳＴ－ＳＳＲ引物在偃麦草上的可应用性。结果显示，在２７　８９１条偃麦草ＥＳＴ序列中可以
搜索到ＳＳＲ位点１　０６８个；其中六核苷酸重复序列最多，占总ＳＳＲ的５３．８３％；二、三、四、五、六核苷酸优势重复基元及
出现 频 率 分 别 为 ＡＣ／ＴＧ（２．７２％）、ＣＧＣ／ＧＣＧ（１．８７％）、ＣＧＡＣ／ＧＣＴＧ（５．２４％）、ＣＣＧＣＣ／ＧＧＣＧＧ（０．３７％）、
ＣＡＧＣＴＣ／ＧＴＣＧＡＧ（３．３７％）。开发的１０５对偃麦草ＥＳＴ－ＳＳＲ引物中有６４对引物（６０．９５％）可以有效扩增；随机选
取１８对多态性引物对４７份偃麦草进行遗传多样性分析，其多态性百分率为７８．６４％，多态性指数（ＰＩＣ）为０．２２～０．
８３。以上结果表明，开发的偃麦草ＥＳＴ－ＳＳＲ标记是有效的，有较高的应用价值，为偃麦草遗传多样性、重要性状关联分
析研究奠定了基础。
关键词：偃麦草；ＥＳＴ－ＳＳＲ；标记开发；遗传多样性
中图分类号：Ｓ５４０．１；Ｑ９４３　　　文献标志码：Ａ　　　文章编号：１００１－０６２９（２０１６）８－１５２６－１０＊
Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｅｌｙｔｒｉｇｉａ　ｒｅｐｅｎｓ　ＥＳＴ－ＳＳＲ　ｍａｒｋｅｒｓ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ
Ｗａｎｇ　Ｒｕｉ－ｊｉｎｇ，Ｌｉ　Ｐｅｉ－ｙｉｎｇ，Ｚｈａｎｇ　Ｙａｎ－ｈｕｉ
（Ｃｏｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｐｒａｔａｃｕｌｔｕｒａｌ　ａｎｄ　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｘｉｎｊｉａｎｇ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，
Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｇｒａｓｓｌａｎｄ　Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ　ａｎｄ　Ｅｃｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ｘｉｎｊｉａｎｇ，Ｕｒｕｍｑｉ　８３００５２，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｏ　ｄｅｖｅｌｏｐ　ｎｅｗ　ｓｉｍｐｌｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｒｅｐｅａｔ（ＳＳＲ）ｍａｒｋｅｒｓ　ｆｏｒ　Ｅｌｙｔｒｉｇｉａ　ｒｅｐｅｎｓ，ＥＳＴ－ＳＳＲ　ｐｒｉｍｅｒｓ　ｏｆ　Ｅ．
ｒｅｐｅｎｓ　ｗｅｒｅ　ｄｅｓｉｇｎｅｄ　ｕｓｉｎｇ　ｔｈｅ　ＥＳＴ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　Ｅ．ｒｅｐｅｎｓ　ｉｎ　ＮＣＢＩ　ｄａｔａｂａｓｅ．Ｔｈｅ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　４７
Ｅｌｙｔｒｉｇｉａｓａｍｐｌｅｓ　ｗｅｒｅ　ａｎａｌｙｚｅｄ　ｕｓｉｎｇ　ＥＳＴ－ＳＳＲ　ｍａｒｋｅｒｓ　ｔｏ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ　ｔｈｅ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ＥＳＴ－ＳＳＲ　ｉｎ　Ｅ．ｒｅｐｅｎｓ．
Ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ：Ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　２７８９１　ＥｌｙｔｒｉｇｉａＥＳＴ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｒｅｌｅａｓｅｄ　ｉｎ　ＮＣＢＩ，１　０６８ＳＳＲｓ　ｗｅｒｅ　ｓｅａｒｃｈｅｄ．
Ａｍｏｎｇ　ｔｈｏｓｅ　ＥＳＴ－ＳＳＲｓ，ｔｈｅ　ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ　ｏｆ　ｈｅｘａｍｅｒ　ｍｏｔｉｆｓ　ｗａｓ　ｔｈｅ　ｈｉｇｈｅｓｔ，ｗｈｉｃｈ　ｉｓ　５３．８３％ｏｆ　ｔｈｅ　ｔｏｔａｌ　ｎｕｍ－
ｂｅｒ　ｏｆ　ＳＳＲｓ，ｗｈｅｒｅａｓ　ｔｈｅ　ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ　ｏｆ　ｄｉｍｅｒ，ｔｒｉｍｅｒ　ｔｅｔｒａｍｅｒ，ｐｅｎｔａｍｅｒ，ｈｅｘａｍｅｒ　ｗｅｒｅ　ＡＣ／ＴＧ（２．７２％），
ＣＧＣ／ＧＣＧ（１．８７％），ＣＧＡＣ／ＧＣＴＧ（５．２４％），ＣＣＧＣＣ／ＧＧＣＧＧ（０．３７％），ＣＡＧＣＴＣ／ＧＴＣＧＡＧ（３．３７％），ｒｅ－
ｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．１０５ｐａｉｒｓ　ｏｆ　ＥＳＴ－ＳＳＲ　ｐｒｉｍｅｒｓ　ｗｅｒｅ　ｄｅｓｉｇｎｅｄ　ａｎｄ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ，ａｎｄ　６４ｐａｉｒｓ（６０．９５％）ｏｆ　ＥＳＴ－ＳＳＲ
ｐｒｉｍｅｒｓ　ｌｅｄ　ｔｏ　ＰＣＲ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ．１８ＥＳＴ－ＳＳＲ　ｐｒｉｍｅｒｓ　ｗｅｒｅ　ｒａｎｄｏｍｌｙ　ｓｅｌｅｃｔｅｄ　ａｎｄ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ａｎａｌｙｚｅ　ｔｈｅ
ｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　４７　Ｅｌｙｔｒｉｇｉａｓａｍｐｌｅｓ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ　ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ　ｗａｓ　７８．６４％，
ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ　ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｃｏｎｔｅｎｔ（ＰＩＣ）ｗａｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｒａｎｇｅ　ｏｆ　０．２２～０．８３．Ｔａｋｅｎ　ｔｏｇｅｔｈｅｒ，ａｌ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｉｎｄｉｃａｔｅ
ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ＥＳＴ－ＳＳＲ　ｍａｒｋｅｒｓ　ｏｆ　Ｅ．ｒｅｐｅｎｓ　ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ　ｉｎ　ｔｈｉｓ　ｓｔｕｄｙ　ｉｓ　ｈｉｇｈｌｙ　ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　ａｎｄ　ｖａｌｕａｂｌｅ，ａｎｄ　ｔｈｅｙ　ｃａｎ　ｂｅ
ｕｓｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｏｆ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ａｎｄ　ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｆｏｒ　ｉｍｐｏｒｔａｎｔ　ｔｒａｉｔ　ｉｎ　Ｅ．ｒｅｐｅｎｓ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｅｌｙｔｒｉｇｉａ　ｒｅｐｅｎｓ；ＥＳＴ－ＳＳＲ；ｍａｒｋｅｒ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ；ｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ
＊ 收稿日期：２０１５－１０－１９　　接受日期：２０１６－０６－０１
基金项目：国家自然科学基金（３１３６０５８０）；新疆农业大学研究生科研创新项目（ＸＪＡＵＧＲＩ２０１５００２）
第一作者：王瑞晶（１９９１－），女，山西运城人，在读硕士生，主要从事草种质的选育与遗传多样性研究。Ｅ－ｍａｉｌ：ｗｒｊ９２７５＠１６３．ｃｏｍ
通信作者：李培英（１９７５－），女，内蒙古察右前旗人，教授，博士，主要从事草种资源评价、草新品种选育及草坪学的教学与科研工作。
Ｅ－ｍａｉｌ：ｎｍｌｐｙ＿１２３４＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ
第８期 王瑞晶　等：偃麦草ＥＳＴ－ＳＳＲ标记开发及应用
ｈｔｔｐ：／／ｃｙｋｘ．ｌｚｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ　ａｕｔｈｏｒ：Ｌｉ　ｐｅｉ－ｙｉｎｇ　Ｅ－ｍａｉｌ：ｎｍｌｐｙ＿１２３４＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ
　　偃麦草（Ｅｌｙｔｒｉｇｉａ　ｒｅｐｅｎｓ）系禾本科小麦族偃麦
草属多年生草本植物，是我国偃麦草属的重要代表种，
在新疆、青海、甘肃、东北、内蒙古、西藏等地均有分
布［１－２］。由于其具有根茎发达，抗旱、耐盐、耐寒，生态
适应性强等优良特性，被认为是一种具有潜在开发价
值的草种资源。偃麦草为异花授粉植物，异源六倍体，
染色体组成为（Ｓ１Ｓ２Ｘ）２，遗传结构复杂［３］。但是，目前
应用于偃麦草资源遗传多样性、抗性种质资源鉴定的
有效标记数量有限［４－５］。ＥＳＴ－ＳＳＲ是近年来开发的新
型分子标记，具有多态性高，共显性、重复性好，数量丰
富等优点，能反映基因的编码部分，在物种间通用性
高，被用于许多作物的抗性遗传分析、图谱构建及辅助
育种工作，如玉米（Ｚｅａ　ｍａｙｓ）、水稻（Ｏｒｙｚａ　ｓａｔｉｖａ）、
小麦（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ　ａｅｓｔｉｖｕｍ）等［６－７］；在牧草和草坪方面，
ＥＳＴ－ＳＳＲ分子标记的开发及应用已在苜蓿（Ｍｅｄｉｃａ－
ｇｏ　ｓａｔｉｖａ）、苏丹草（Ｓｏｒｇｈｕｍ　ｓｕｄａｎｅｎｓｅ）等草种资源
上开展［８－９］。
目前，在ＮＣＢＩ中登陆的偃麦草相关ＥＳＴ序列已
达２７　８９１条，但还未被开发利用，通过偃麦草ＥＳＴ开
发新的ＥＳＴ－ＳＳＲ标记，是增加偃麦草有效分子标记
的一条重要途径。因此，本研究拟在分析偃麦草ＥＳＴ
序列中 ＳＳＲ 发生频率和特点的基础上，设计开发
ＥＳＴ－ＳＳＲ引物，并在４７份偃麦草上进行引物功效评
价，为未来开展偃麦草遗传多样性分析、遗传图谱构
建、重要性状分子标记等研究工作奠定基础。
１　材料与方法
１．１　材料
本研究所用的４７份偃麦草材料中，５份材料引自
北京农林科学院（国外引进），其余４２份引自新疆各地
区，包括３４份北疆（乌鲁木齐、阿勒泰、伊犁等地）材
料，５份南疆（库尔勒、和田）材料和３份东疆（哈密）材
料。其具体来源见表１。
１．２　方法
１．２．１　源于偃麦草ＥＳＴ的ＳＳＲ查找　从ＮＣＢＩ下载
由Ｂｕｓｈｍａｎ等［１０］提供的偃麦草ＥＳＴ序列２７　８９１条，
并以Ｆａｓｔａ格式保存；利用在线微卫星位点扫描工具
ＳＳＲＩＴ（ｓｉｍｐｌｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｒｅｐｅａｔ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｔｏｏｌ）
（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｒａｍｅｎｅ．ｏｒｇ／ｄｂ／ｓｅａｒｃｈｅｓ／ｓｓｒｔｏｏｌ）搜
索ＳＳＲ，搜索标准为重复序列不少于１８～２０ｂｐ，即
二、三、四、五、六核苷酸的最少重复次数分别为１０、７、
５、４、３次。
１．２．２　ＥＳＴ－ＳＳＲ引物设计　利用ＤＮＡｓｔａｒ软件包
中的Ｅｄｉｔｓｅｑ将搜索到的ＳＳＲ及侧翼序列保存成Ｓｅｑ
格式，保证整个序列长度小于３００ｂｐ。利用Ｐｒｉｍｅｒ　５．
０软件设计引物，设计原则为：引物长度范围１８～２２
ｂｐ；退火温度５３～６２℃，上下引物间退火温度相差不
超过５℃；ＧＣ含量在４０％～６０％，最佳为５０％；扩增
片段长度１５０～３００ｂｐ，尽量避免形成稳定的引物二
聚体（ｄｉｍｅｒ　ａｎｄ　ｃｒｏｓｓ　ｄｉｍｅｒ）和发夹结构（ｈａｉｒｐｉｎ）。
遵循以上原则共设计１０５对偃麦草ＥＳＴ－ＳＳＲ引物，送
至上海鼎国昌盛生物技术有限公司合成，并将引物按
照“Ｅ＋序号”形式重新命名，如Ｅ１。
１．２．３　ＥＳＴ－ＳＳＲ引物筛选
（１）ＤＮＡ提取
从每份材料中选取健壮、无病虫害的２０个单株嫩
叶混合，采用改良的ＣＴＡＢ法［１１］对供试偃麦草基因组
ＤＮＡ进行提取。分别用０．８％琼脂糖凝胶电泳和核
酸蛋白测定仪检测 ＤＮＡ 纯度和浓度。纯化后的
ＤＮＡ用１×ＴＥ溶解，４℃保存备用。
（２）ＰＣＲ扩增与电泳检测
ＰＣＲ反应体系为１５μＬ：ＤＮＡ总量为５０ｎｇ，１．５
μＬ　１０×ＰＣＲ　ｂｕｆｅｒ，１．２μＬ　ｄＮＴＰｓ（０．２ｍｍｏｌ·Ｌ
－１），
正反引物（０．１μｍｏｌ·Ｌ
－１）各１μＬ，Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶
（０．５Ｕ）０．１μＬ，ｄｄＨ２Ｏ补充至１５μＬ。扩增反应在
ＴＣ５０００（Ｔｅｃｈｎｅ，Ｂｒｉｔａｉｎ）ＰＣＲ仪上进行。扩增程序：
９４℃预变性５ｍｉｎ；９４℃变性５０ｓ，５８℃（部分引物退
火温度使用６２℃）退火４５ｓ，７２℃延伸１ｍｉｎ，进行３０
个循环；７２℃保持１０ｍｉｎ；４℃保存。扩增产物用６％
的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，所用的电泳缓冲
液为１×ＴＢＥ，在１６０Ｖ恒压下电泳１ｈ，采用银染法
对凝胶进行银染显色，拍照。
１．２．４　数据分析　根据ＥＳＴ－ＳＳＲ引物在供试材料
上的扩增情况，建立０、１矩阵，有带记为１，无带记为
０。利用 Ａｎｄｅｒｓｏｎ等［１２］的方法计算多态信息含量
（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ　ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｃｏｎｔｅｎｅ，ＰＩＣ），计算公式
如下：
ＰＩＣ＝１－∑
ｊ＝１
Ｐｉｊ２．
式中：Ｐｉｊ表示标记ｉ的第ｊ个带型出现的频率，标记ｉ
的总带型从１到ｎ。
采用ＮＴＳＹＳｐｃ　２．１１统计分析软件，分析４７份材
料间的Ｄｉｃｅ遗传相似系数，基于Ｄｉｃｅ遗传相似系数进
行ＵＰＧＭＡ系统聚类［１３］，分析群体间的遗传分化关系。
７２５１
草　业　科　学 第３３卷
ｈｔｔｐ：／／ｃｙｋｘ．ｌｚｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
表１　供试材料的编号及来源
Ｔａｂｌｅ　１　Ｔｈｅ　ｃｏｄｅ　ａｎｄ　ｓｏｕｒｃｅｓ　ｏｆ　ｔｅｓｔｅｄ　Ｅｌｙｔｒｉｇｉａ　ｒｅｐｅｎｓ　ｇｅｒｍｐｌａｓｍ
材料编号
Ｇｅｒｍｐｌａｓｍ　ｃｏｄｅ
采集地点或引种地　　
Ｃｏｌｅｃｔｉｎｇ　ｏｒ　ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ　ｓｉｔｅ　　
经度（Ｅ）
Ｌｏｎｇｉｔｕｄｅ
纬度（Ｎ）
Ｌａｔｉｔｕｄｅ
海拔
Ｅｌｅｖａｔｉｏｎ／ｍ
０１ 乌鲁木齐市永丰乡 Ｙｏｎｇｆｅｎｇ　Ｔｏｗｎｓｈｉｐ，Ｕｒｕｍｑｉ　 ８７°１８′ ４３°３０′ １　６２０
１２ 乌鲁木齐后峡乡 Ｈｏｕｘｉａ　Ｔｏｗｎｓｈｉｐ，Ｕｒｕｍｑｉ　 ８７°１２′ ４３°１９′ １　９５０
１３ 乌鲁木齐永丰乡Ｙｏｎｇｆｅｎｇ　Ｔｏｗｎｓｈｉｐ，Ｕｒｕｍｑｉ　 ８７°２９′ ４３°４３′ １　１２０
１６＊＊ 乌鲁木齐南山Ｎａｎｓｈａｎ　Ｍｏｕｎｔａｉｎ，Ｕｒｕｍｑｉ － － －
１９ 乌鲁木齐三坪农场Ｓａｎｐｉｎｇ　ｆａｒｍ，Ｕｒｕｍｑｉ － － －
２３ 乌鲁木齐后峡乡 Ｈｏｕｘｉａ　Ｔｏｗｎｓｈｉｐ，Ｕｒｕｍｑｉ　 ８７°１１′ ４３°１６′ ２　０８０
３４＊＊ 乌鲁木齐市南山Ｎａｎｓｈａｎ　Ｍｏｕｎｔａｉｎ，Ｕｒｕｍｑｉ － － －
４０ 乌鲁木齐东山区Ｄｏｎｇｓｈａｎ　Ｄｉｓｔｒｉｃｔ，Ｕｒｕｍｑｉ　 ８７°４７′ ４３°４９′ １　０００
４４ 乌鲁木齐市雅玛里克山Ｙａｍａｌｉｋｅ　Ｍｏｕｎｔａｉｎ，Ｕｒｕｍｑｉ － － －
０２ 阿勒泰北屯镇Ｂｅｉｔｕｎ　Ｔｏｗｎｓｈｉｐ，Ａｌｔａｉ　 ８８°０３′ ４７°１８′ ５４０
０３ 阿勒泰北屯镇Ｂｅｉｔｕｎ　Ｔｏｗｎｓｈｉｐ，Ａｌｔａｉ　 ８７°４８′ ４７°２２′ ５５２
０４ 阿勒泰布尔津县Ｂｕｅｒｊｉｎ　Ｃｏｕｎｔｙ，Ａｌｔａｉ　 ８６°５３′ ４７°４２′ ４５６
０６ 阿勒泰福海县Ｆｕｈａｉ　Ｃｏｕｎｔｙ，Ａｌｔａｉ　 ８７°２７′ ４７°１３′ ４８９
０７ 阿勒泰哈巴河县 Ｈａｂａｈｅ　Ｃｏｕｎｔｙ，Ａｌｔａｉ　 ８６°２６′ ４８°０４′ ５４４
０８ 阿勒泰红敦乡 Ｈｏｎｇｄｕｎ　Ｔｏｗｎｓｈｉｐ，Ａｌｔａｉ　 ８８°１４′ ４７°４３′ ７４１
０９ 阿勒泰喇玛昭乡Ｌａｍａｚｈａｏ　Ｔｏｗｎｓｈｉｐ，Ａｌｔａｉ　 ８８°２３′ ４７°４５′ ８８８
１０ 阿勒泰喇玛昭乡Ｌａｍａｚｈａｏ　Ｔｏｗｎｓｈｉｐ，Ａｌｔａｉ　 ８８°１１′ ４７°１７′ ５５６
１１ 阿勒泰市桦林公园 Ｈｕａｌｉｎ　Ｐａｒｋ，Ａｌｔａｉ　 ８８°０７′ ４７°５２′ ９３６
２２ 阿勒泰市桦林公园 Ｈｕａｌｉｎ　Ｐａｒｋ，Ａｌｔａｉ　 ８８°０７′ ４７°５２′ ９４０
２５ 阿勒泰福海县Ｆｕｈａｉ　Ｃｏｕｎｔｙ，Ａｌｔａｉ　 ８７°３０′ ４７°０７′ ４９４
２６ 阿勒泰喇玛昭乡Ｌａｍａｚｈａｏ　Ｔｏｗｎｓｈｉｐ，Ａｌｔａｉ　 ８８°２３′ ４７°４５′ ８６５
２８ 阿勒泰北屯镇Ｂｅｉｔｕｎ　Ｔｏｗｎｓｈｉｐ，Ａｌｔａｉ　 ８７°４８′ ４７°２２′ ５５２
２９ 阿勒泰哈巴河县 Ｈａｂａｈｅ　Ｃｏｕｎｔｙ，Ａｌｔａｉ　 ８６°２０′ ４８°０６′ ５１５
３０ 阿勒泰布尔津县Ｂｕｅｒｊｉｎ　Ｃｏｕｎｔｙ，Ａｌｔａｉ　 ８６°５２′ ４７°４３′ ４８０
４３ 阿勒泰市桦林公园 Ｈｕａｌｉｎ　Ｐａｒｋ，Ａｌｔａｉ　 ８０°０７′ ４７°５２′ ９２２
１８＊＊ 昌吉呼图壁县 Ｈｕｔｕｂｉ　Ｃｏｕｎｔｙ，Ｕｒｕｍｑｉ － － －
３３＊＊ 昌吉呼图壁县 Ｈｕｔｕｂｉ　Ｃｏｕｎｔｙ，Ｕｒｕｍｑｉ － － －
４１ 伊犁昭苏马场Ｚｈａｏｓｕ　ｈｏｒｓｅ　Ｆａｒｍ，Ｙｉｌｉ　 ８４°４３′ ４３°０６′ １　８３０
４２ 伊犁昭苏马场Ｚｈａｏｓｕ　ｈｏｒｓｅ　Ｆａｒｍ，Ｙｉｌｉ　 ８１°００′ ４３°０７′ １　８７０
４５ 伊宁市开发区Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　Ｄｉｓｔｒｉｃｔ，Ｙｉｎｉｎｇ　 ８１°１６′ ４３°５６′ ６２２
４６ 伊宁市Ｙｉｎｉｎｇ ８１°１８′ ４３°５７′ ６５８
４９ 乌苏市城东八十四户Ｅｉｇｈｔｙ－ｆｏｕｒ　ｈｏｕｓｅｈｏｌｄｓ，Ｗｕｓｕ　 ８４°４３′ ４４°２８′ ４３２
５０ 沙湾县安集海Ａｎｊｉ　ｓｅａ，Ｓｈａｗａｎ　Ｃｏｕｎｔｙ ８５°２２′ ４４°２４′ ４５４
４８ 博乐市五一水库 Ｗｕｙｉ　ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ，Ｂｏｌｅ　 ８２°０２′ ４４°５３′ ５１８
２７ 焉耆县四十里城Ｓｉｓｈｉｌｉｃｈｅｎｇ　Ｖｉｌａｇｅ，Ｙａｎｊｉ　Ｃｏｕｎｔｙ － － －
３１ 焉耆县四十里城Ｓｉｓｈｉｌｉｃｈｅｎｇ　Ｖｉｌａｇｅ，Ｙａｎｊｉ　Ｃｏｕｎｔｙ － － －
３９ 焉耆县霍拉山沟Ａｌａｓｈａｎｇｏｕ，Ｙａｎｊｉ － － －
３７ 库尔勒阿瓦提乡Ａｗａｔｉ　Ｔｏｗｎｓｈｉｐ，Ｋｕｅｒｌｅ － － －
３８ 和田民丰县 Ｍｉｎｆｅｎｇ　Ｃｏｕｎｔｙ，Ｈｅｔｉａｎ － － －
２４ 哈密伊吾乡Ｙｉｗｕ　Ｔｏｗｎｓｈｉｐ，Ｈａｍｉ － － －
３５ 哈密市 Ｈａｍｉ － － －
８２５１
第８期 王瑞晶　等：偃麦草ＥＳＴ－ＳＳＲ标记开发及应用
ｈｔｔｐ：／／ｃｙｋｘ．ｌｚｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
续表１
材料名称
Ｇｅｒｍｐｌａｓｍ　ｃｏｄｅ
采集地点或引种地
Ｃｏｌｅｃｔｉｎｇ　ｏｒ　ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ　ｓｉｔｅ
经度（Ｅ）
Ｌｏｎｇｉｔｕｄｅ
纬度（Ｎ）
Ｌａｔｉｔｕｄｅ
海拔
Ｅｌｅｖａｔｉｏｎ／ｍ
３６ 哈密市 Ｈａｍｉ － － －
１４＊ 北京市农林科学院Ｂｅｉｊｉｎｇ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｓｃｉｅｎｃｅ － － －
１５＊ 北京市农林科学院Ｂｅｉｊｉｎｇ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｓｃｉｅｎｃｅ － － －
１７＊ 北京市农林科学院Ｂｅｉｊｉｎｇ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｓｃｉｅｎｃｅ － － －
２１＊ 北京市农林科学院Ｂｅｉｊｉｎｇ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｓｃｉｅｎｃｅ － － －
３２＊ 北京市农林科学院Ｂｅｉｊｉｎｇ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｓｃｉｅｎｃｅ － － －
注：＊为引种，＊＊为多年驯化。
Ｎｏｔｅ：＊ ｍｅａｎ　ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，＊＊ ｍｅａｎ　ｄｏｍｅｓｔｉｃａｔｉｏｎ．
２　结果与分析
２．１　偃麦草ＥＳＴ序列中的ＳＳＲ频率
从２７　８９１条偃麦草ＥＳＴ序列中共搜索到１　０６８
条ＳＳＲ，ＳＳＲ出现频率为３．８３％，平均距离为１９．０５
ｋｂ。其中，主要重复类型是六核苷酸，共５７５个，占
ＳＳＲ总数的５３．８３％；其次为四核苷酸（１６．０１％）、三
核苷酸（１５．８２％）、二核苷酸（９．５５％）、五核苷酸（４．
７８％）（表２）。
偃麦草ＳＳＲ重复单元的重复次数分布在３～４３
（表２），其中３次重复的 ＳＳＲ 最多，有５３６个，占
５０．１９％；其次为５次重复和７次重复的ＳＳＲ，分别占
１５．０７％和１１．６１％；重复次数≥１１次的ＳＳＲ共８０
个，占７．４９％。二、三、四、五、六核苷酸基序的最大重
复次数分别为４３、１２、８、６、８次。检索到的ＳＳＲ序列
中，９８．３２％的ＳＳＲ长度为２０～３０ｂｐ，仅有少部分
ＳＳＲ（１．６８％）长度在３０ｂｐ以上。
２．２　不同类型基序ＳＳＲ的分布特征
在搜索出的１　０６９个偃麦草ＳＳＲ中，共检测到
３２２种重复基元，其中二、三、四、五、六核苷酸重复基
元分别有 ５、２２、４１、４０、２１４种（表 ３）。四核苷酸
ＣＧＡＣ／ＧＣＴＧ出现频率最高，为５．２４％，其它重复基
元中的优势重复基元及出现频率分别为 ＡＣ／ＴＧ
（２．７２％）、ＣＧＣ／ＧＣＧ（１．８７％）、ＣＣＧＣＣ／ＧＧＣＧＧ
（０．３７％）、ＣＡＧＣＴＣ／ＧＴＣＧＡＧ（３．３７％）；优势重复基
元ＳＳＲ数量总和占总ＳＳＲ的１３．５８％。
在所有重复基元中，重复次数跨度最大的为二核
苷酸重复基元ＣＡ／ＧＴ，跨度为１１～４３，ＡＧ／ＴＣ、ＡＣ／
ＴＧ、ＡＴ／ＴＡ跨度也相对较大，其它重复基元跨度相
对较小（表４）。三核苷酸基元重复次数多以７～１１次
为主；四核甘酸、五核苷酸、六核苷酸基元的重复次数
跨度分别为５～８、４～６、３～５。
表２　偃麦草ＥＳＴ序列中不同核苷酸基序的ＳＳＲ频率分布
Ｔａｂｌｅ　２　Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ　ａｎｄ　ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ　ｏｆ　ＳＳＲ　ｉｎ　Ｅｌｙｔｒｉｇｉａ　ｒｅｐｅｎｓ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｔａｇｓ（ＥＳＴ）
重复次数
Ｒｅｐｅａｔ　ｎｕｍｂｅｒ
二核苷酸
Ｄｉｍｅｒ
三核苷酸
Ｔｒｉｍｅｒ
四核苷酸
Ｔｅｔｒａｍｅｒ
五核苷酸
Ｐｅｎｔａｍｅｒ
六核苷酸
Ｈｅｘａｍｅｒ
总计
Ｔｏｔａｌ
３　 ０　 ０　 ０　 ０　 ５３６　 ５３６
４　 ０　 ０　 ０　 ３８　 ３５　 ７３
５　 ０　 ０　 １４７　 １１　 ３　 １６１
６　 ０　 ０　 ４　 ２　 ０　 ６
７　 ０　 １０８　 １６　 ０　 ０　 １２４
８　 ０　 ４０　 ４　 ０　 １　 ４５
９　 ０　 １５　 ０　 ０　 ０　 １５
１０　 ２５　 ３　 ０　 ０　 ０　 ２８
≥１１　 ７７　 ３　 ０　 ０　 ０　 ８０
最大重复次数 Ｍａｘｉｍｕｍ　ｎｕｍｂｅｒ　 ４３　 １２　 ８　 ６　 ８
总计Ｔｏｔａｌ　 １０２　 １６９　 １７１　 ５１　 ５７５
百分比Ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ／％ ９．５５　 １５．８２　 １６．０１　 ４．７８　 ５３．８３
９２５１
草　业　科　学 第３３卷
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２．３　ＥＳＴ－ＳＳＲ引物多态性评价
随机挑选８份偃麦草材料对合成的１０５对偃麦草
ＥＳＴ－ＳＳＲ引物进行初步筛选，有２２对引物没有扩增
产物，１９对引物没能产生预期的扩增片段或条带较
弱，认为其无效，６４对引物可以有效扩增，占６０．９５％。
６４对引物在偃麦草中共扩增出１５８条清晰带，平均每
对引物扩增２．４７条，单个引物对最高扩增条带数为８
条，最低扩增条带数为２条，扩增片段大小范围为７０～
６００ｂｐ。其中以三核苷酸重复的ＥＳＴ－ＳＳＲ引物扩增
率最高，为７２．４１％，五核苷酸重复的引物扩增率最
低，为４０．００％，相差３２．４１个百分点（表５）。
从扩增产物来看，基于四核苷酸序列，且重复基元
重复次数在５～８次的引物，其主带信息清晰，杂带较
少（图１）；其次是基于三核苷酸重复次数为７～８的引
物（图２）。同时发现，基于四核苷酸和三核苷酸所设
计的引物在４７份偃麦草中平均多态位点百分率较高，
分别为７９．８６％和７７．７８％。
２．４　基于ＥＳＴ－ＳＳＲ的聚类分析
从６４对有效引物中随机选取１８对ＥＳＴ－ＳＳＲ引
物对４７份供试偃麦草材料进行遗传多样性分析（表６）。
表３　重复基元类型的优势重复基元的比较分析
Ｔａｂｌｅ　３　Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｔ　ｍｏｔｉｆｓ　ｉｎ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｍｏｔｉｆ　ｔｙｐｅｓ
重复类型
Ｔｙｐｅ　ｏｆ　ｒｅｐｅａｔ
基元种数
Ｎｕｍｂｅｒ　ｏｆ　ｍｏｔｉｆ　ｔｙｐｅ
优势重复基元　
Ｍａｉｎ　ｒｅｐｅａｔ　ｍｏｔｉｆ
ＳＳＲ数量
Ｎｕｍｂｅｒ　ｏｆ　ＳＳＲ
出现频率
Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ／％
二核苷酸Ｄｉｍｅｒ　 ５ ＡＣ／ＴＧ　 ２９　 ２．７２
三核苷酸Ｔｒｉｍｅｒ　 ２２ ＣＧＣ／ＧＣＧ　 ２０　 １．８７
四核苷酸Ｔｅｔｒａｍｅｒ　 ４１ ＣＧＡＣ／ＧＣＴＧ　 ５６　 ５．２４
五核苷酸Ｐｅｎｔａｍｅｒ　 ４０ ＣＣＧＣＣ／ＧＧＣＧＧ　 ４　 ０．３７
六核苷酸 Ｈｅｘａｍｅｒ　 ２１４ ＣＡＧＣＴＣ／ＧＴＣＧＡＧ　 ３６　 ３．３７
总计Ｔｏｔａｌ　 ３２２　 １０　 １４５　 １３．５８
表４　基元类型的重复次数分布
Ｔａｂｌｅ　４　Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ　ｏｆ　ｒｅｐｅａｔ　ｍｏｔｉｆ　ａｃｃｏｒｄｉｎｇ　ｔｏ　ｒｅｐｅａｔ　ｎｕｍｂｅｒ
重复基元　
Ｒｅｐｅａｔ　ｍｏｔｉｆ　
跨度
Ｒａｎｇｅ
总数
Ｔｏｔａｌ
重复基元　　
Ｒｅｐｅａｔ　ｍｏｔｉｆ　　
跨度
Ｒａｎｇｅ
总数
Ｔｏｔａｌ
ＡＣ／ＴＧ　 １０～２７　 ２９ ＡＣＡ／ＴＧＴ　 ７～１２　 ５
ＡＧ／ＴＣ　 １０～３１　 ２５ ＣＡＧＧ／ＧＴＣＣ　 ５～８　 １２
ＡＴ／ＴＡ　 １０～２３　 １４ ＣＣＴＧ／ＧＧＡＣ　 ５～８　 ９
ＣＡ／ＧＴ　 １１～４３　 １８ ＡＡＡＡＧ／ＴＴＴＴＣ　 ４～５　 ３
ＣＴ／ＧＡ　 １０～１８　 １６ ＣＡＴＡＣ／ＧＴＡＴＧ　 ５～６　 ２
ＡＧＣ／ＴＣＧ　 ７～１１　 ８ ＣＣＧＡＣＧ／ＧＧＣＴＧＣ　 ３～５　 ４
ＣＧＡ／ＧＣＴ　 ７～１１　 １１ ＣＡＧＣＴＣ／ＧＴＣＧＡＧ　 ３～４　 ３６
表５　不同核苷酸重复ＥＳＴ－ＳＳＲ的ＰＣＲ扩增结果
Ｔａｂｌｅ　５　ＰＣＲ　ａｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　ＥＳＴ－ＳＳＲ　ｍａｒｋｅｒｓ　ｗｉｔｈ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｍｏｔｉｆ
核苷酸重复类型
Ｍｏｔｉｆｓ　ｏｆ　ＥＳＴ－ＳＳＲ　ｍａｒｋｅｒｓ
引物数Ｎｕｍｂｅｒ　ｏｆ
ｐｒｉｍｅｒ　ｐａｉｒｓ
有效引物数
Ｎｕｍｂｅｒ　ｏｆ　ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　ｐｒｉｍｅｒ　ｐａｉｒｓ
百分数
Ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ／％
平均带数
Ａｖｅｒａｇｅ
二核苷酸 Ｄｉｍｅｒ　 １８　 １０　 ５５．５６　 ２．３０
三核苷酸 Ｔｒｉｍｅｒ　 ２９　 ２１　 ７２．４１　 ２．２９
四核苷酸 Ｔｅｔｒａｍｅｒ　 ４２　 ２５　 ５９．５２　 ２．６８
五核苷酸Ｐｅｎｔａｍｅｒ　 １０　 ４　 ４０．００　 ２．７５
六核苷酸 Ｈｅｘａｍｅｒ　 ６　 ４　 ６６．６７　 ２．５０
总计 Ｔｏｔａｌ／平均 Ｍｅａｎ　 １０５　 ６４　 ５８．８３　 ２．４９
０３５１
第８期 王瑞晶　等：偃麦草ＥＳＴ－ＳＳＲ标记开发及应用
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图１　引物Ｅ９８对０１－３４种质的扩增结果
Ｆｉｇ．１　Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｂｙ　ｐｒｉｍｅｒ　Ｅ９８ｏｎ　ｇｅｒｍｐｌａｓｍ　０１－３４
图２　引物Ｅ５７对０１－３４种质的扩增结果
Ｆｉｇ．２　Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｂｙ　ｐｒｉｍｅｒ　５７ｏｎ　ｇｅｒｍｐｌａｓｍ　０１－３４
１８对引物共产生８２个条带，其中有６３条显示多态
性，多态性百分率为７８．６４％。同时发现，有５对引物
的多态位点百分率达到了１００．０％。多态信息含量
（ＰＩＣ）是表示微卫星位点变异程度高低的一个指标，
当ＰＩＣ＞０．５时该位点为高度多态性；当０．２５＜ＰＩＣ＜
０．５时，为中度多态性位点，标记可以提供较合理的信
息；当ＰＩＣ＜０．２５时，为低度多态性位点，标记提供信
息的能力较差［１４］。１８对ＥＳＴ－ＳＳＲ引物的多态信息
指数（ＰＩＣ）范围在０．２２～０．８３，平均为０．６２。Ｅ７２、
Ｅ７７标记的ＰＩＣ分别为０．２６、０．２２，为中度多态性位
点，其余１６个标记的ＰＩＣ均大于０．５，具有高度多态
性（表６）。表明ＥＳＴ－ＳＳＲ能检测较多的遗传位点，获
得多态性较好的ＰＣＲ结果。
以ＮＳＴＹＳｐｃ２．１１软件计算的遗传相似系数为依
据，利用 ＵＰＧＭＡ法对４７份偃麦草材料进行聚类分
析，构建系统聚类图（图３），各材料间遗传相似性系数
介于０．６９～０．９５，平均相似系数为０．８２。４７份材料
聚类结果与地理来源没有绝对相关性。在相似系数为
０．７４处，将４７份供试偃麦草材料分为三大类群：第一
大类包括采自北疆的１４份材料，采自南疆的全部材
料、采自东疆的 ＥＲ３６以及引自北京农林科学院的
（ＥＲ１４、ＥＲ１５、ＥＲ１７），在相似系数为０．７５处，第一大
类又被划分成两个亚类，而采自南疆的５份材料也被
划分到两个亚类中；第二大类包括采自北疆的ＥＲ１２，
采自东疆的 ＥＲ２４、ＥＲ３５及引自北京农林科学院的
ＥＲ２１、ＥＲ３２，而在相似系数为０．７５７处，ＥＲ１６被单独
聚为一类；第三大类仅包括采自北疆的ＥＲ４１，表明其
与其它材料有较远的亲缘关系。另外，有１６份材料的
相似系数为０．９０６，具有较近的亲缘关系；ＥＲ４１、
ＥＲ２２、ＥＲ４８、ＥＲ１６与其它材料的遗传距离较远，亲缘
关系相对较远，遗传背景丰富，可用于新品系选育。
３　讨论
３．１　ＳＳＲ的分布特征
ＥＳＴ－ＳＳＲ引物源于表达序列，不同植物开发的
ＥＳＴ序列中ＳＳＲ分布的频率差异很大。本研究对目
前为止ＮＣＢＩ所公布的２７　８９１条偃麦草ＥＳＴ序列中
的ＳＳＲ的分布特征进行分析，共发现１　０６８个ＳＳＲ，占
偃麦草 ＥＳＴ数据库的３．８３％，与刘林等［１５］对小麦
ＳＳＲ序列分析中的结果基本一致，但高于陈海梅等［１６］
而略低于陈军方等［１７］对小麦ＳＳＲ序列的分析结果。
这样的区别一方面可能是由于所使用的数据库不同所
导致，陈海梅等［１６］和陈军方等［１７］分别使用的是Ｇｅｎ－
Ｂａｎｋ和ＥＳＴ协作网上的ＥＳＴ数据库，而本研究使用
的是 ＮＣＢＩ上的偃麦草ＥＳＴ数据库；另一方面搜索
ＳＳＲ时所选用的参数不同也会导致结果有所差异。
陈海梅等［１６］仅对二、三、四、五核苷酸重复序列进行搜
索，所以其ＳＳＲ出现频率低于本研究；而陈军方等［１７］
设置的三核苷酸最少重复次数低于本研究的，故其
ＳＳＲ出现频率低于本研究０．２７％。
就ＥＳＴ中不同类型ＳＳＲ的出现频率看，多数研
究表明，二核苷酸和三核苷酸重复ＳＳＲ的出现频率
高［１８］，而本研究发现六核苷酸重复ＳＳＲ出现频率最高，
占所有ＳＳＲ的５３．８３％。除刘林等［１５］对小麦ＥＳＴ－
１３５１
草　业　科　学 第３３卷
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表６　１８对偃麦草ＥＳＴ－ＳＳＲ引物信息
Ｔａｂｌｅ　６　Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｏｆ　１８Ｅｌｙｔｒｉｇｉａ　ｒｅｐｅｎｓ　ＥＳＴ－ＳＳＲ　ｐｒｉｍｅｒ　ｐａｉｒｓ
引物
Ｐｒｉｍｅｒ
上游引物
Ｆｏｒｗａｒｄ　ｐｒｉｍｅｒ
下游引物
Ｒｅｖｅｒｓｅ　ｐｒｉｍｅｒ
退火温度
Ｔｍ／℃
Ｅ９ ＡＴＴＴＣＴＴＴＴＧＴＴＴＣＴＧＴＴＧＧＣＴ　 ＣＧＴＧＧＣＴＴＴＧＡＣＴＣＴＧＧＧ　 ５４
Ｅ２４ ＡＡＴＧＡＡＣＡＡＧＴＡＡＧＴＣＧＧＴＡＧＡ　 ＡＧＡＴＡＧＡＴＡＴＧＡＴＣＣＣＡＣＡＡＣ　 ５４
Ｅ２５ ＡＣＡＣＧＧＴＴＴＴＡＴＴＴＧＧＡＣＡ　 ＣＡＧＧＡＧＡＡＣＴＧＣＴＧＣＡＴＴ　 ５５
Ｅ３１ ＡＧＧＡＡＡＧＧＡＧＣＧＡＴＧＧＴＧ　 ＡＡＴＧＧＣＣＴＡＣＡＡＣＴＡＣＡＧＧＧ　 ５５
Ｅ３５ ＡＴＴＴＣＴＴＴＴＧＴＴＴＣＴＧＴＴＧＧＣＴ　 ＣＴＡＣＣＧＧＣＴＴＣＣＣＴＧＧＴＡ　 ５６
Ｅ３６ ＣＡＡＣＧＣＣＡＣＣＡＡＣＡＧＣＣＴ　 ＴＣＧＧＡＣＣＴＡＧＡＧＣＡＴＣＣＡＧＴＣ　 ５５
Ｅ３９ ＣＣＡＡＣＣＧＡＡＧＡＣＴＡＣＡＡＴＡＣ　 ＴＴＣＣＴＣＡＴＣＧＣＣＡＴＣＣＴＧ　 ５６
Ｅ４４ ＣＣＴＣＡＡＧＴＧＣＴＣＴＴＣＴＴＴ　 ＡＴＴＴＴＧＴＡＴＴＣＴＡＴＣＧＣＴＡＡＣ　 ５５
Ｅ５７ ＧＡＣＧＧＡＡＧＧＡＧＡＡＧＡＴＧＧ　 ＴＴＧＧＣＣＴＡＡＧＴＡＡＣＡＡＡＣＧ　 ５４
Ｅ５９ ＧＣＡＣＴＴＧＡＴＧＡＡＣＣＧＡＧＡＡ　 ＣＴＧＧＣＴＴＧＧＴＡＧＣＴＧＧＡＧ　 ５６
Ｅ６０ ＧＣＡＧＧＴＴＴＣＣＴＴＴＧＧＴＣＣ　 ＡＡＡＴＣＴＧＴＴＴＡＴＣＴＴＣＧＣＴＴＣＴ　 ５４
Ｅ６３ ＧＧＡＣＴＧＴＣＣＣＡＣＣＡＧＣＡＧＣ　 ＧＧＧＣＧＡＴＣＣＣＣＴＣＡＣＴＴＧ　 ５６
Ｅ７２ ＡＴＣＣＣＡＣＡＡＣＡＣＣＡＴＣＡＡ　 ＧＣＣＡＧＴＡＧＡＡＴＧＡＡＣＡＡＧＴＡＡ　 ５２
Ｅ７６ ＧＧＡＣＣＴＧＴＡＴＴＡＧＧＧＣＴＣ　 ＣＴＧＴＴＣＡＣＴＴＡＴＴＴＣＴＣＣＴＴＣＴ　 ５２
Ｅ７７ ＧＴＴＡＧＧＴＴＧＡＧＣＡＡＡＧＣＡ　 ＡＣＧＡＴＴＧＡＴＣＣＡＡＧＡＣＡＧ　 ５０
Ｅ７８ ＧＧＡＣＣＴＧＴＡＴＴＡＧＧＧＣＴＣ　 ＡＴＧＴＴＣＡＣＴＴＡＴＴＴＣＴＣＣＴＴＣＴ　 ５２
Ｅ９７ ＣＴＧＴＴＣＡＣＴＴＡＴＴＴＣＴＣＣＴＴＣＴ　 ＧＧＡＣＣＴＧＴＡＴＴＡＧＧＧＣＴＣ　 ５３
Ｅ９８ ＧＧＡＣＣＴＧＴＡＴＴＡＧＧＧＣＴＣ　 ＴＴＣＴＣＣＴＴＣＴＣＣＴＣＣＡＴＣ　 ５２
引物
Ｐｒｉｍｅｒ
重复基元
Ｒｅｐｅａｔ
ｍｏｔｉｆ
总条带
Ｎｕｍｂｅｒ
ｏｆ　ｂａｎｄｓ
多态性条带数
Ｎｕｍｂｅｒ　ｏｆ
ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ　ｂａｎｄｓ
多态位点百分率
Ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ　ｏｆ
ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ　ｌｏｃｉ／％
多态信
息含量
ＰＩＣ
Ｅ９ （ＡＣＡＴ）５ ３　 ２　 ６６．６７　 ０．６２
Ｅ２４ （ＧＧＴＴ）５ ４　 ３　 ７５．００　 ０．６６
Ｅ２５ （ＧＡＣＧ）５ ４　 ２　 ５０．００　 ０．６４
Ｅ３１ （ＧＧＴＧＴ）５ ６　 ３　 ５０．００　 ０．７４
Ｅ３５ （ＡＣＡＴ）５ ８　 ７　 ８７．５０　 ０．８３
Ｅ３６ （ＧＧＡ）７ ４　 ４　 １００．００　 ０．６２
Ｅ３９ （ＴＣＡ）７ ６　 ５　 ８３．３３　 ０．７８
Ｅ４４ （ＧＣＡＣＡ）４ ７　 ５　 ７１．４３　 ０．７９
Ｅ５７ （ＧＣＴ）７ ４　 ３　 ７５．００　 ０．７３
Ｅ５９ （ＧＡＧ）８ ３　 ２　 ６６．６７　 ０．５０
Ｅ６０ （ＧＴ）１１ ５　 ３　 ６０．００　 ０．５８
Ｅ６３ （ＣＧＣ）７ ３　 ３　 １００．００　 ０．５２
Ｅ７２ （ＡＡＣＣ）５ ３　 ３　 １００．００　 ０．２６
Ｅ７６ （ＣＡＧＧ）８ ４　 ４　 １００．００　 ０．７１
Ｅ７７ （ＡＧ）１１ ３　 ３　 １００．００　 ０．２２
Ｅ７８ （ＣＡＧＧ）７ ５　 ３　 ６０．００　 ０．６１
Ｅ９７ （ＣＡＧＧ）５ ５　 ４　 ８０．００　 ０．６３
Ｅ９８ （ＣＡＧＧ）７ ５　 ４　 ８０．００　 ０．６５
总计Ｔｏｔａｌ／
平均 Ｍｅａｎ
８２　 ６３　 ７８．６４　 ０．６２
２３５１
第８期 王瑞晶　等：偃麦草ＥＳＴ－ＳＳＲ标记开发及应用
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图３　４７份供试偃麦草材料的ＥＳＴ－ＳＳＲ聚类图
Ｆｉｇ．３　Ｔｈｅ　ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ　ｄｅｎｄｒｏｇｒａｍ　ｏｆ　４７ｔｅｓｔｅｄ　ｍａｔｅｒｉａｌｓ　ｏｆ　Ｅｌｙｔｒｉｇｉａ　ｒｅｐｅｎｓ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ＥＳＴ－ＳＳＲ
ＳＳＲ引物进行开发时发现六核苷酸出现频率较高之
外，其它研究中未见报道，主要是因为多数研究者在搜
索ＳＳＲ时没有把六核苷酸列入搜索对象中。但是六
核苷酸重复序列也存在丰富的多态性，对基因功能的
影响也很大，应该列入ＳＳＲ搜索对象。本研究搜索到
的ＳＳＲ中，五核苷酸出现频率最低，与孙清明等［１９］的
研究结果一致。
３．２　ＥＳＴ－ＳＳＲ引物的有效性分析
目前对于ＳＳＲ长度与引物多态性的关系，有３种
研究结果［１９］：１）ＳＳＲ越长，多态性频率越高；２）ＳＳＲ越
短，多态性频率越高；３）ＳＳＲ重复次数与多态性间不
存在相关性。本研究并未发现ＳＳＲ长度与多态性存
在相关性。但是从扩增效果来看，基于四核苷酸序列
和三核苷酸所设计的引物，扩增结果主带信息清晰，杂
带较少。利用高粱（Ｓ．ｂｉｃｏｌｏｒ）ＥＳＴ－ＳＳＲ标记对苏丹
草的通用性研究中得到了同样的结果［９］。
基因型不同的品种，基因组内核苷酸序列也存在
差异，当用相同的ＳＳＲ引物对不同基因组进行体外扩
增时，由于基因组上与引物互补ＤＮＡ片段的数目、位
点不同，扩增产物的大小、数目也不同，因此，扩增产物
的多态性能反映材料的遗传多样性。用６对 ＥＳＴ－
ＳＳＲ引物在９个抗蚜苜蓿品种（系）中检测到了６３条
多态性扩增带，每对引物平均扩增１０．５０条，多态位点
百分率为９１．３０％［２０］。用２３对来自高粱、玉米、水稻
的ＥＳＴ－ＳＳＲ引物在４３份西南扁穗牛鞭草（Ｈｅｍａｒ－
ｔｈｒｉａ　ｃｏｍｐｒｅｓｓａ）中检测到２６１条多态性条带，多态位
点百分率为８０．４％［２１］。本研究利用１８对偃麦草
ＥＳＴ－ＳＳＲ引物在４７份供试偃麦草材料中共产生６３
条多态性条带，且多态性百分率为７８．６４％。而在偃
麦草分子标记研究方面，已经报道的仅有李培英［２２］从
１００对ＲＡＰＤ引物中筛选出１８对多态性 ＲＡＰＤ引
物，在３２份偃麦草材料中检测到２５７条多态性条带，
多态位点百分率为９３．７０％，明显高于ＥＳＴ－ＳＳＲ。究
其原因认为，一方面ＲＡＰＤ受条件影响较大，其稳定
性和重复性较差，导致有效引物数量稍低；另一方面
ＥＳＴ－ＳＳＲ是来源于序列相对保守的基因组编码区，多
态性主要基于微卫星重复序列数目的变化而有所差
异，其多态性可能与功能基因有关，其多态性标记具有
更高的应用价值。
３．３　偃麦草遗传相似性分析
一般来说，位点的平均ＰＩＣ可被用来估算群体的
遗传多样性水平，ＰＩＣ平均值越高，表明群体的变异程
度越高，遗传多样性越丰富［８］。本研究选取的１８对
ＥＳＴ－ＳＳＲ引物，多态信息指数范围在０．２２～０．８３，平
３３５１
草　业　科　学 第３３卷
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均为０．６２，具有较为丰富的遗传多样性。表明开发的
ＥＳＴ－ＳＳＲ标记有较高的应用价值，可用于偃麦草资源
遗传多样性分析。
通过分析４７份供试材料的遗传相似性，得到ＵＰ－
ＧＭＡ亲缘关系树状图（图２）。其聚类结果和材料来
源地并非完全吻合，表现为材料ＥＲ１２和ＥＲ２７，分别
来自北疆和南疆，但其遗传相似系数大于０．９２；部分
来源地相同的材料虽然被聚在同一大类，但不属于同
一亚类（采自南疆的５份材料），说明虽然来源于同一
地理区域的材料间遗传上具有一定的相似性，但也可
能由于分布地域微环境的影响，导致材料间存在一定
的遗传分化。也有研究表明，野生偃麦草的群体之间
的亲缘关系与地理距离没有绝对的相关性［３］。其原因
可能为：１）虽然野生偃麦草具有较高的遗传多样性，但
是等位基因处于不平衡状态，易受环境影响而改变，境
内地型复杂，自然环境多样都会对其遗传多样性造成
影响；２）偃麦草具有很强的无性繁殖能力，可能在材料
交流过程中使其转入异地扩展繁殖；３）材料在进化过
程中，个别基因发生了变异，且该突变体能较好地适应
当地的环境并得到保存；４）在取样过程中，每份材料采
集的单株数量也会影响到等位基因的检测，使得野生
偃麦草的遗传相似性和地理来源关系复杂化。
４　结论
偃麦草ＥＳＴ含有丰富的、多种类型的ＳＳＲ位点，
通过ＥＳＴ序列开发偃麦草ＳＳＲ标记是一种简单、快
速、经济和有效的途径。本研究明确了偃麦草ＥＳＴ序
列中ＳＳＲ的总体特征，开发了６４个具有多态性的偃
麦草ＥＳＴ－ＳＳＲ标记，这些标记为偃麦草遗传多样性、
重要性状关联分析研究奠定了基础。
参考文献Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ：
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Ｓｕｎ　Ｚ　Ｊ，Ｌｉ　Ｐ　Ｙ，Ａｂｕｌａｉｔｉ，Ｌｉ　Ｘ，Ｄｕ　Ｓ　Ｓ．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ｏｎ　ｓａｌｔ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｏｆ　２６　Ｅｌｙｔｒｉｇｉａ　ｒｅｐｅｎｓ　ｇｅｒｍｐｌａｓｍ　ｉｎ　ｓｅｅｄｉｎｇ　ｓｔａｇｅ．Ｇｒａｓｓ－
ｌａｎｄ　ａｎｄ　Ｔｕｒｆ，２０１３，３３（３）：４３－４９，５６．（ｉｎ　Ｃｈｉｎｅｓｅ）
［２］　李培英，孙宗玖．３３份偃麦草种质芽期耐盐性评价．草业科学，２０１５，３２（４）：５９３－６００．
Ｌｉ　Ｐ　Ｙ，Ｓｕｎ　Ｚ　Ｊ．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ｏｎ　ｓａｌｔ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｏｆ　ｇｅｒｍｐｌａｓｍ　ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ　ｏｆ　３３　Ｅｌｙｔｒｉｇｉａ　ｒｅｐｅｎｓ　ｄｕｒｉｎｇ　ｓｅｅｄｉｎｇ　ｐｅｒｉｏｄ．Ｐｒａｔａｃｕｌｔｕｒ－
ａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１５，３２（４）：５９３－６００．（ｉｎ　Ｃｈｉｎｅｓｅ）
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Ｊ　Ｔ，Ｇｏｎｇ　Ｇ，Ｌｉｕ　Ｌ，Ｍｉｋｅｌ　Ｍ　Ａ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ａｎｄ　ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｅｒｅｎｎｉａｌ　Ｔｒｉｔｉｃｅａｅ　ＥＳＴｓ　ａｎｄ　ＳＳＲ　ｍａｒｋｅｒｓ．Ｃｙｂｅｒ　Ｃｅｎｔｅｒ　Ｐｕｂ－
４３５１
第８期 王瑞晶　等：偃麦草ＥＳＴ－ＳＳＲ标记开发及应用
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［１８］　Ｌｉｕ　Ｙ　Ｌ，Ｌｉ　Ｙ　Ｈ，Ｚｈｏｕ　Ｇ　Ａ，Ｕｚｏｋｗｅ　Ｎ，Ｃｈａｎｇ　Ｒ　Ｚ，Ｃｈｅｎ　Ｓ　Ｙ，Ｑｉｕ　Ｌ　Ｊ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　ｓｏｙｂｅａｎ　ＥＳＴ－ＳＳＲ　ｍａｒｋｅｒｓ　ａｎｄ　ｔｈｅｉｒ
ｕｓｅ　ｔｏ　ａｓｓｅｓｓ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｓｕｂｇｅｎｕｓ　Ｓｏｊａ．Ａｇｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｅｓ　ｉｎ　Ｃｈｉｎａ，２０１０，９（１０）：１４２３－１４２９．
［１９］　孙清明，马文朝，马帅鹏，赵俊生，白丽军，陈洁珍，蔡长河，向旭，欧良喜．荔枝ＥＳＴ资源的ＳＳＲ信息分析及ＥＳＴ－ＳＳＲ标记开
发．中国农业科学，２０１１，４４（１９）：４０３７－４０４９．
Ｓｕｎ　Ｑ　Ｍ，Ｍａ　Ｗ　Ｃ，Ｍａ　Ｓ　Ｐ，Ｚｈａｏ　Ｊ　Ｓ，Ｂａｉ　Ｌ　Ｊ，Ｃｈｅｎ　Ｊ　Ｚ，Ｃａｉ　Ｃ　Ｈ，Ｘｉａｎｇ　Ｘ，Ｏｕ　Ｌ　Ｘ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ　ｏｆ　ＳＳＲｓ　ｄｅｒｉｖｅｄ　ｆｒｏｍ　ＥＳＴｓ
ａｎｄ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　ＥＳＴ－ＳＳＲ　ｍａｒｋｅｒｓ　ｉｎ　Ｌｉｔｃｈｉ（Ｌｉｔｃｈｉ　ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ　Ｓｏｎｎ．）．Ｓｃｉｅｎｔｉａ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ　Ｓｉｎｉｃａ，２０１１，４４（１９）：４０３７－４０４９．
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［２０］　王森山，唐守嵘，朱亚灵，贺春贵．抗蚜苜蓿品种（系）ＳＳＲ标记的遗传多样性分析．草业科学，２０１０，２７（７）：７８－８３．
Ｗａｎｇ　Ｓ　Ｓ，Ｔａｎｇ　Ｓ　Ｒ，Ｚｈｕ　Ｙ　Ｌ，Ｈｅ　Ｃ　Ｇ．Ｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　ａｐｈｉｄ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　ａｌｆａｌｆａ　ｖａｒｉｅｔｉｅｓ／ｌｉｎｅｓ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ＳＳＲ　ｍａｒｋｅｒｓ．Ｐｒａｔ－
ａｃｕｌｔｕｒａｃ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１０，２７（７）：７８－８３．（ｉｎ　Ｃｈｉｎｅｓｅ）
［２１］　陈永霞，张新全，谢文刚，马啸，刘影．利用ＥＳＴ－ＳＳＲ标记分析西南扁穗牛鞭草种质的遗传多样性．草业学报，２０１１，２０（６）：
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Ｃｈｅｎ　Ｙ　Ｘ，Ｚｈａｎｇ　Ｘ　Ｑ，Ｘｉｅ　Ｗ　Ｇ，Ｍａ　Ｘ，Ｌｉｕ　Ｙ．Ｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｈｅｍａｒｔｈｒｉａ　ｃｏｍｐｒｅｓｓａ　ｇｅｒｍｐｌａｓｍｓ　ｆｒｏｍ　ｓｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎ
Ｃｈｉｎａ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ＥＳＴ－ＳＳＲ　ｍａｒｋｅｒｓ．Ａｃｔａ　Ｐｒａｔａｃｕｌｔｕｒａｅ　Ｓｉｎｃｅ，２０１１，２０（６）：４０－４４．（ｉｎ　Ｃｈｉｎｅｓｅ）
［２２］　李培英．新疆草坪用野生偃麦草种质资源评价．乌鲁木齐：新疆农业大学博士学位论文，２０１０．
Ｌｉ　Ｐ　Ｙ．Ｔｕｒｆ－ｕｓｉｎｇ　ｇｅｒｍｐｌａｓｍ　ｒｅｓｏｕｒｃｅ　ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ｏｎ　ｎａｔｉｖｅ　Ｅｌｙｔｒｉｇｉａ　ｒｅｐｅｎｓ（Ｌ．）Ｎｅｖｓｋｉ　ｉｎ　Ｘｉｎｊｉａｎｇ．ＰｈＤ　Ｔｈｅｓｉｓ．Ｕｒｕｍｑｉ：
Ｘｉｎｊｉａｎｇ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，２０１０．（ｉｎ　Ｃｈｉｎｅｓｅ）
（责任编辑　武艳培）
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