全 文 ：收稿日期:2014-2-28 接受日期:2014-07-02
基金项目:上海高校选拔培养优秀青年教师科研专项基金资助项
目(shu09064)
* 通讯作者 Tel:86-21-66137535;E-mail:h． swallow@ 163． com
天然产物研究与开发 Nat Prod Ｒes Dev 2014，26:1380-1384
文章编号:1001-6880(2014)9-1380-05
长裂苦苣菜水提取物对肺癌细胞 A549 增殖和凋亡的影响
贺燕云* ，刘小敏，张彩艳，华子义
上海大学生命科学学院实验教学中心，上海 200444
摘 要:为了探讨长裂苦苣菜水提取物对肺癌细胞 A549 的影响，本研究用不同浓度的长裂苦苣菜水提取物作
用于体外培养的 A549 细胞，从细胞形态(显微镜观察)、细胞增殖活力(CCK-8 法)、细胞凋亡(Annexin V-FITC /
PI染色)、线粒体膜电位(JC-1 染色)和细胞内活性氧水平(荧光探针 DCFH-DA染色)几个方面检测长裂苦苣菜
水提取物对体外培养的 A549 细胞的影响。当处理浓度达到 1 mg /mL作用细胞 48 h后，细胞出现明显皱缩的凋
亡形态学特征，与对照组相比处理组细胞增殖活力明显下降(P ＜ 0． 05)。进一步用流式细胞仪检测发现≥1
mg /mL的处理浓度作用细胞 48 h后细胞凋亡率显著提高(P ＜ 0． 05)，同时检测到处理组细胞的膜电位都明显
下降，细胞内活性氧水平明显上升，都呈剂量依赖关系。这些结果表明长裂苦苣菜水提取物可以诱导 A549 细
胞凋亡，并抑制其生长和增殖，是一种潜在的预防和抑制肿瘤生长的药食两用植物。
关键词:长裂苦苣菜;肺癌细胞;增殖;凋亡
中图分类号:Q28 文献标识码:A
Apoptosis of Lung Cancer Line A549 Induced by
Sonchus branchyotus DC Aqueous Extracts
HE Yan-yun* ，LIU Xiao-ming，ZHANG Cai-yan，HUA Zi-yi
Experimental Center for Life Sciences，School of Life Sciences，Shanghai University，Shanghai 200444，China
Abstract:To illustrate the effects of Sonchus branchyotus DC (SBDC)aqueous extracts on human lung cancer A549
cells，assays，including morphologic changes observed by microscope，cell proliferation vitality tested by cell growth assay
using cck8 kit，the apoptosis detected by Flow Cytometry，mitochondrial membrane potential assessed with the fluorescent
probe JC-1 and reactive oxygen species formation measured by DCFH-DA staining，were performed． Observed with micro-
scope，cells treated with high dose (≥1 mg /mL)of SBDC were shrunken and the morphological characteristics of apop-
tosis was obvious compared with the control group． Also，cell proliferation was significantly inhibited compared with the
control group (P ＜ 0． 05)． Furthermore，flow cytometry analysis revealed the apoptosis cells treated with high dose of SB-
DC (≥1mg /mL)for 48 hours were significantly increased compared with the control group． Finally，it was found in all
treatment groups that the significant decrease of cell mitochondrial membrane potential and the increase of reactive oxy-
gen species level． These results demonstrated that SBDC may induce human lung cancer A549 cells apoptosis and inhibit
the cells growth and proliferation． SBDC is a potential edible herb for cancer prevention and treatment．
Key words:Sonchus branchyotus DC;lung cancer cell;apoptosis;proliferation
长裂苦苣菜(Sonchus brachyotus DC．)是菊科植
物苦苣菜属的全草。我国长裂苦苣菜资源丰富，在
西北、华北、东北、华中地区都有分布，民间人们有多
种食用方法，普遍认为这种野菜无论怎样食用，如生
吃，或煮熟后生水拌食或发酵后食用，食后人体都不
会有异样反应，而且吃后生津止渴，清热解毒，消暑
保健作用较为明显。文献报道苦苣菜具有消炎、抗
氧化、抗菌、抗肿瘤和降胆固醇活性［1，2］。Thomson
等［3］研究表明，在新西兰，多吃苦苣菜的毛利人比
不吃苦苣菜的非毛利人患结肠直肠癌的比例低一
半。长裂苦苣菜抑癌作用的研究报道较少，本研究
在细胞水平上首先探索长裂苦苣菜对肺癌细胞
A549 表型的影响，由于长裂苦苣菜是可食用植物，
所以以长裂苦苣菜水提取物作为原料，作用 A549
后，探讨长裂苦苣菜的水提取物对肿瘤细胞的生长
抑制及诱导细胞凋亡的作用，为保健品和新药的研
DOI:10.16333/j.1001-6880.2014.09.010
究开发提供线索。
1 材料与方法
1． 1 实验材料
1． 1． 1 细胞株
人肺癌细胞株 A549，购自中国科学院上海细胞
生物学研究院。
1． 1． 2 主要试剂
长裂苦苣菜(Sonchus branchyotus DC．)为菊科
苦苣属一年生或两年生草本植物，本材料采于晋西
北农田，经上海大学生命学院王伟博士鉴定。ＲP-
MI-1640 培养基(COＲNING);胎牛血清(Hyclone);
胰蛋白酶(Hyclone);CCK-8 试剂盒(上海七海复泰
生物公司);Annexin V-FITC /PI 双染法细胞凋亡检
测试剂盒(上海七海复泰生物公司);线粒体膜电位
检测试剂盒(Jc-1，碧云天生物公司);活性氧检测试
剂盒(碧云天生物公司)。
1． 1． 3 主要仪器
流式细胞仪为 Moflow XDP;CO2 培养箱;倒置
相差荧光显微镜为 LEICA公司产品;酶标仪为美国
BioＲad产品;冷冻干燥机为美国 LABCONCO 公司
产品。
1． 2 实验方法
1． 2． 1 长裂苦苣菜水提取物制备
采全草，阴干，-80 ℃保存。将 8 g 的干长裂苦
苣菜，粉碎，浸泡到 100 mL沸水中，超声 1 h，沸水浴
30 min，过滤两次，分装原液经 24 h冷冻干燥后制成
冻干粉，-80 ℃保存，备用。使用时，用培养基重新
溶解冻干粉，0． 22 μm滤膜过滤后使用。
1． 2． 2 细胞培养
以含 10%新生牛血清、100 μg /mL 青霉素、100
μg /mL链霉素的 ＲPMI-1640 培养基培养 A549，37
℃、5% CO2，恒温培养箱中常规消化传代。
1． 2． 3 细胞形态观察
细胞均匀铺在 24 孔板中，待细胞贴壁生长至覆
盖培养板底部 50% ～60%时，用不同浓度长裂苦苣
菜水提取物处理细胞 48 h，另设不加药的空白对照，
每个剂量设三个重复，在光学显微镜下观察细胞形
态。
1． 2． 4 细胞增殖活力检测(CCK-8 法)
将细胞均匀铺于 96 孔板中，待细胞贴壁生长至
覆盖培养板底部 50% ～ 60%时，用不同浓度长裂苦
苣菜水提取物处理细胞 48 h，检测前 4 h 先换无血
清培养基培养，每孔加 5 μL CCK-8 溶液，避光温育
1 ～ 2 h，用酶标仪测 450 nm 下的吸光值，每个剂量
重复 4 次，实验重复 3 次。
1． 2． 5 Annexin V-FITC /PI法检测细胞凋亡
不同浓度长裂苦苣菜水提取物处理细胞 48 h
后收集到的细胞，200 μL loading buffer 悬浮细胞，
2. 5 μL FITC染色，室温避光处理 15 min，再用 5 μL
PI染色，冰浴避光处理 5 min后上流式细胞仪检测，
用 Summit 5． 2 获取数据并分析。
1． 2． 6 细胞膜电位的检测
不同浓度长裂苦苣菜水提取物处理细胞 48 h
后收集到的细胞，加入 Jc-1 染色工作液后，避光温
育 20 min。染色完成后，用 1 mL Jc-1(5X)与 4 mL
超纯水比例配制的 Jc-1(1X)洗涤缓冲液(冰浴)洗
涤两遍后流式细胞仪检测，用试剂盒提供的 CCCP
作为诱导线粒体膜电位下降的阳性对照。用 FL1
(FITC)和 FL2(ＲPE-TＲ)通道接收信号。
1． 2． 7 活性氧水平检测
不同浓度长裂苦苣菜水提取物处理细胞 48 h
后收集到的细胞，用活性氧检测试剂盒染色，DCFH-
DA与无血清培养基 1∶ 1000 的比例稀释 DCFH-DH
(10 mM)为 10 μM作为工作液进行探针装载，避光
温育 20 min。处理完成后，用无血清培养基洗涤三
遍，洗去未进入细胞的探针，荧光显微镜下观察细
胞。
1． 2． 8 统计学处理
所得数据采用 GraphPad Prism5 软件进行统计
学分析，以 P ＜ 0． 05 为差异具有统计学意义。
2 实验结论
2． 1 细胞形态观察
如图 1 所示，长裂苦苣菜水提取物作用 A549
48 h后，光镜下直接可见未给药对照组细胞贴壁状
况良好，细胞透明，状态佳，细胞折光性好;而实验组
细胞的密度明显降低，细胞贴壁能力减弱、细胞间连
接松散、折光性差，悬浮细胞和颗粒增加，浓度越高，
细胞状态越差，最高浓度时细胞稀疏已接近死亡。
但用 1． 25 mg /mL的青菜处理 A549 48 h后，细胞并
未出现凋亡特征，反而比对照组细胞生长更好。
1831Vol. 26 贺燕云等:长裂苦苣菜水提取物对肺癌细胞 A549 增殖和凋亡的影响
图 1 不同浓度长裂苦苣菜水提取物对 A549 细胞生长的影响
Fig. 1 Morphologic changes of A549 cells after the treatment with different concentrations of SBDC
2． 2 细胞增殖活力检测
如图 2 所示，长裂苦苣菜水提取物能抑制 A549
细胞的增殖，处理浓度大于 1 mg /mL 的处理组与其
剂量、作用时间呈正相关，且与空白对照组比较，均
有显著性差异(P ＜ 0． 05)。而本实验中同时做了另
外一种十字花科芸薹属蔬菜青菜对这两株细胞生长
的影响，用同样方法处理材料，高浓度(1． 25 mg /
mL)的青菜水提取物处理肺癌细胞 A549 48 h 后却
能很明显地促进细胞的生长。
1.5
1.0
0.5
0
OD
45
0
0 0.5 1 1.25 1.25(青菜)
(mg/mL)
24%h
48%h
图 2 不同浓度长裂苦苣菜的水提取物对 A549 细胞增殖
的影响
Fig. 2 Proliferative activity changes of A549 after the treat-
ment with different concentrations of SBDC
* 表示与对照组相比达到显著水平 P ＜ 0． 05
Compared with control group，* P ＜ 0． 05
2． 3 细胞凋亡检测
在细胞凋亡的早期阶段，胞浆膜磷脂的不对称
性丧失，导致膜内侧磷脂酰丝氨酸(PS)从细胞膜内
层暴露于外层，从而可被 PS 特异的 Annexin-V探针
所标记，PI不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚
期的细胞和死细胞，PI 能够透过细胞膜而使细胞核
红染。因此将 Annexin-V 与 PI 匹配使用，就可以将
凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。流式 An-
nexinV-FITC /PI双参数图(图 3)可见，右下象限
(FITC + /PI-)和右上象限(FITC + /PI +)分别代表
细胞的早期凋亡和晚期凋亡，左下象限为活细胞
(FITC-/PI-)，左上象限为坏死细胞(FITC-/PI +)。
不同剂量的长裂苦苣菜作用 A549 细胞的平均凋亡
率分别为 8． 1%、11． 4%、43． 7%、69． 8%，当处理浓
度达到 1 mg /mL，作用 48h后，处理组凋亡率与对照
组相比均有显著性意义(P ＜ 0． 05)。
2． 4 细胞膜电位的检测
线粒体膜电位的下降是细胞凋亡的一个标志性
事件［4，5］。在线粒体膜电位较高时，探针 JC-1 聚集
在线粒体的基质中，形成聚合物，产生红色荧光;在
线粒体膜电位较低时，JC-1 不能聚集在线粒体的基
质中，此时 JC-1 为单体，产生绿色荧光。因此可通
过荧光颜色的转变来检测线粒体膜电位的变化。如
图 4 所示活细胞线粒体膜电位高，线粒体内 JC-1 聚
合物的浓度高，红色荧光很强，在流式图上表现为双
阳性，而凋亡细胞则大多为 FITC单阳性。用带红色
荧光信号的细胞比例的下降来表示线粒体去极化程
度，长裂苦苣菜水提取物处理 A549 48 h 后，经 JC-1
染色，双阳性细胞随着药物浓度的增加逐渐减少，表
明长裂苦苣菜水提取物处理细胞后，细胞的膜电位
明显下降，结合前期的实验结果表明长裂苦苣菜确
2831 天然产物研究与开发 Vol. 26
实能诱导肺癌细胞 A549 凋亡。
80
60
40
20
0
0 0.5 1 1.25
(mg/mL)
死
亡
率（
%
）
图 3 不同浓度长裂苦苣菜水提取物作用 A549 细胞凋亡的检测
Fig. 3 Apoptosis of A549 cells by FCM after treatment with different concentrations of SBDC
* 表示与对照组相比达到显著水平 P ＜ 0． 05
Compared with control group，* P ＜ 0． 05
100
80
60
40
20
0
0 0.5 1 1.25
(mg/mL)
红
色
荧
光
细
胞
比
例（
%
）
图 4 流式细胞仪检测不同浓度长裂苦苣菜水提取物作用 A549 细胞膜电位的变化
Fig. 4 Mitochondrial membrane potential changes of A549 cells after treatment with different concentrations of SBDC
* 表示与对照组相比达到显著水平 P ＜ 0． 05
Compared with control group，* P ＜ 0． 05
2． 5 细胞内活性氧水平检测
活性氧是线粒体介导的细胞凋亡和 DNA 损伤
的重要的效应分子。很多的证据表明活性氧影响细
胞敏感性，激活细胞凋亡途径［6，7］。同时活性氧的
产生在一些抗肿瘤新药诱导凋亡中发挥了重要作
用［8-10］。用荧光探针 DCFH-DA 染色检测经长裂苦
苣菜水提取物处理后细胞活性氧水平的变化，如图
5 所示胞内活性氧的荧光强度(绿色荧光)随着药物
浓度的增加而加强，表明长裂苦苣菜水提取物诱导
肿瘤细胞 A549 细胞的凋亡途径中，活性氧可能是
3831Vol. 26 贺燕云等:长裂苦苣菜水提取物对肺癌细胞 A549 增殖和凋亡的影响
图 5 不同浓度长裂苦苣菜水提取物作用 A549 细胞，细
胞内活性氧水平检测
Fig. 5 Ｒeactive oxygen species level changes of A549 cells
after treatment with different concentrations of SBDC
个重要的介导因子。
3 讨论
近年我国各类癌症发病率日益上升，迫切需要
找出既能抑制癌细胞增殖又对人体危害较少的药
物，因此开发天然抗癌药物成为研究热点。本研究
中的菊科苦苣属植物长裂苦苣菜(Sonchus branchyo-
tus DC)为药食两用野生植物，我国晋西北人长期采
食，以其特有的苦寒属性及所含成份，煮熟放置后长
期不馊、食后具有泄热宁神，清心明目，消炎解毒作
用。由于苦菜的食用方法多为沸水煮食或阴干后泡
食，所以实验材料用阴干的长裂苦苣菜全草的水浸
泡提取物作用于癌细胞，以此探索长裂苦苣菜水溶
状态下对癌细胞的作用。这样的研究为开发长裂苦
苣菜这种食用野菜，寻找预防和治疗癌症的新药物
提供理论基础。
本实验观察了长裂苦苣菜水提取物对体外培养
的肺癌细胞 A549 生长、增殖、凋亡的影响。低浓度
剂量组(0． 5 mg /mL)不能抑制细胞生长，当处理浓
度达到 1 mg /mL时，长裂苦苣菜水提取物作用 A549
48h后对细胞有显著的抑制作用。本实验中同时做
了另外一种十字花科芸薹属蔬菜青菜对细胞生长的
影响，用同样方法处理材料，高浓度(1． 25 mg /mL)
的青菜水提取物处理肺癌细胞 A549 48 h 后却能很
明显地促进细胞的生长(结果如图 2 所示)。因此
长裂苦苣菜与常食用的蔬菜青菜不同，含有能抑制
癌细胞生长和增殖的活性物质，对长裂苦苣菜所含
抑癌成分的分析需进一步探索。
本实验所有数据表明长裂苦苣菜水提取物可以
明显地抑制体外培养的肺癌细胞 A549 的增殖，而
这种抑制作用可能是通过诱导细胞凋亡实现的，药
物处理后细胞膜电位的下降说明这种凋亡可能是线
粒体凋亡途径介导的。而胞内活性氧水平的上升说
明细胞在凋亡过程中活性氧起了很重要的作用，这
些只是初步结果，还需进一步验证。后期作者将对
长裂苦苣菜水提取物诱导肺癌细胞 A549 凋亡的机
制和对体内生长的细胞的影响做进一步研究，这对
临床应用将有十分重要的指导意义。
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