全 文 ：收稿日期:2006-12-20;　修订日期:2007-01-24
基金项目:河北省科技厅资助项目(052761687)
作者简介:邢立强(1965-),男(汉族),河北安新县人, 现任河北北方学院
实验中心电镜室副教授 ,硕士学位 ,主要从事肿瘤的耐药机制研究工作.
瑞香狼毒提取物和肿瘤坏死因子
对肺癌基因蛋白表达的影响
邢立强1 , 赵建清 2 ,李　旺 1 ,孙　黎1
(1.河北北方学院 ,河北 张家口　075000;　2.河北北方学院附属第一医院 ,河北 张家口　075000)
摘要:目的 探讨瑞香狼毒和肿瘤坏死因子(TNF)对肺癌细胞基因蛋白表达的影响。方法 用瑞香狼毒水提取物和 TNF
分别及联合处理肺癌细胞株 NCI-H157和 NCI-H446,用免疫组织化学 SP法分别检测用药前后肺癌细胞中多药耐药相
关蛋白(MDM2)、肺耐药蛋白(LRP)和热休克蛋白 27(HSP27)的表达状况。通过形态学图像分析 ,比较瑞香狼毒和 TNF
用药前后三种基因蛋白表达的差异。结果 用药前后两种肺癌细胞株 3种基因蛋白表达情况如下:①瑞香狼毒组 NCI-
H446细胞株用药后 LRP和 MDM2阳性细胞灰度值均高于用药前(P<0.05);HSP27的表达用药前后差异无显著性(P>
0.05)。 NCI-H157细胞株用药后LRP和 HSP27阳性细胞灰度值均高于用药前 (P<0.05);MDM2的表达用药前后差异
无显著性(P>0.05)。 ②TNF组 NCI-H446细胞株用药后 LRP阳性细胞灰度值高于用药前 (P<0.05);HSP27和
MDM2的表达用药前后差异均无显著性(P>0.05)。 NCI-H157细胞株用药后 LRP, MDM2和 HSP27阳性细胞灰度值均
高于用药前(P<0.05), 其中 LRP具有高度显著性(P<0.01)。 ③联合用药组 NCI-H446细胞株用药后 LRP和 MDM2
阳性细胞灰度值均高于用药前(P<0.05), HSP27的表达用药前后差异无显著性(P>0.05)。 NCI-H157细胞株用药后
LRP、MDM2和 HSP27阳性细胞灰度值均高于用药前 (P<0.05),且 LRP和 HSP27差异具有高度显著性(P<0.01)。结
论 瑞香狼毒提取物和肿瘤坏死因子对两种肺癌细胞株的某些基因蛋白的表达具有抑制作用;两种药物联合应用对基因
蛋白的表达有明显的抑制作用。
关键词:瑞香狼毒;　肿瘤坏死因子;　肺癌细胞株;　基因蛋白
中图分类号:R285.5　　文献标识码:A　　文章编号:1008-0805(2007)06-1323-02
TheEffectsofExtractsfromRuixianglangduandTumourNecrosisFactorofExpression
ofGeneProteininTwoLungCarcinomaCel
XINGLi-qiang1 , ZHAOJian-qing2 ,LIWang1 , SUNLi1
(1.HebeiNorthColege, Zhangjiakou075000, China;2.CharityHospitalofZhangjiakouCity, Zhangjiakou
075000, China)
Abstract:ObjectiveToresearchtheeffectofextractsfromRuixianglangduandtumournecrosisfactor(TNF)onexpressionof
geneprotein.MethodsTwolungcarcinomacellstrainsweretreatedwithextractsfromRuixianglangduandTNF, theexpressions
ofMDM2, LRPandHSP27inlungcancercelstrainsweredetectedwithimmunohistochemistrySPassaybeforeandafterbeing
treatedrespectively.Tocomparethediferenceofexpressionofthreekindsofgeneproteinwithmorphologicalimageassay.Re-
sultsThedifferenceofexpressiveintensityofMDM2, LRPandHSP27 betweenbeforeandafterbeingtreatedwithextractsfrom
RuixianglangduandTNFintwolungcarcinomacellstrainsasfollows.①InRuixianglangdugroup:inlungcarcinomacellstrain
NCI-H446 theexpressiveintensityofLRPandMDM2 werehigherthanthatbeforetreated(P<0.05), exceptHSP27(P>0.
05).②InNCI-H157 theexpressiveintensityofLRPandHSP27werehigherthanthataftertreated(P<0.05), exceptMDM2
(P>0.05).③InTNFgroup:theexpressiveintensityofLRPwashigherthanthatbeforetreatedwithTNF(P<0.05).The
diferenceofexpressiveintensityofHSP27, MDM2wereinapparentbeforeandaftertreatedwithTNF(P>0.05).④Incombina-
tiongroup:therestrainingeffectofexpressionofgeneprotein(MDM2, LRPandHSP27)wereconsuminginNCI-H446 andNCI
-H157 strains(P<0.01).ConclusionTheextractsofRuixianglangduandTNFrestraintheexpressionofcertainkindsofgene
proteinintwolungcarcinomacelstrains.Therestrainingefectofexpressionofgeneproteinareconsumingincombinationgroup.
Keywords:Ruixianglangdu;　Tumournecrosisfactor(TNF);　Lungcarcinomacelstrains;　Geneprotein
　　受人口老龄化 、环境污染 、吸烟 、职业等因素的影响 , 肺癌已
成为我国癌症死亡病因的首位 ,其发病率及病死率均呈显著上升
趋势。由于肺癌患者早期诊断比较困难 ,多数患者确诊时已属晚
期 , 失去手术机会。 因此化疗仍是多数肺癌患者的主要治疗方
法。本文通过探讨瑞香狼毒和 TNF对肺癌相关基因蛋白表达的
影响 , 探寻提高肺癌患者化疗效果的新方法和新途径。现将研究
结果报告如下。
1　材料与方法
1.1　中药提取 瑞香狼毒采自河北北部 , 提取前经专家鉴定确
认。将瑞香狼毒自然晾干取其根部粉碎 ,装入容器中加入适量蒸
馏水浸泡 30 min,加热提取。瑞香狼毒水提药物终浓度为 5 g/ml
生药。
1.2　细胞培养 两个肺癌细胞株 , 即人小细胞肺癌 NCI-H446
和人非小细胞肺腺癌 NCI-H157,购自中国协和医科大学基础医
学院细胞中心。
1.3　组化染色
1.3.1　免疫组化试剂 肺癌耐药蛋白 (LRP)、多药耐药相关蛋
白 2(MDM2)、热休克蛋白 27(HSP27)均为鼠抗人单克隆抗体 ,
购自北京中杉金桥生物技术有限公司。
1.3.2　药物实验 两种肺癌细胞株复苏后在培养瓶中培养至对
数生长期 ,消化计数后移至六孔培养板中继续培养 24 h(预先在
六孔培养板中置洁净盖玻片)。分 3组给药:即瑞香狼毒组 、TNF
组 、(瑞香狼毒和 TNF)联合用药组。瑞香狼毒组每孔加入经抽
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LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH 2007VOL.18NO.6 时珍国医国药 2007年第 18卷第 6期
滤的瑞香狼毒水提物 20 μl;TNF组每孔加入用培养基稀释的浓
度为 2.5万 U/ml的 TNF17 μl;联合用药组为以上两组药物之
和;24h后检测三种耐药基因蛋白的表达情况 , 并进行图像分析。
1.3.3　免疫组化 SP(两步)法 经 10%甲醛固定后水洗。 3%
H2O2室温孵育 10 min。蒸馏水冲洗 , PBS浸泡 5 min, 0.05%胰
蛋白酶 37℃消化 30min。 PBS浸泡 5 min, 10%正常山羊血清封
闭 , 室温孵育 10 min。倾去血清 , 滴加 MDM2、LRP、HSP27一抗
工作液 , 4℃孵育过夜。 PBS冲洗 , 5 min×3次。滴加试剂 1(pol-
ymerhelper), 37℃孵育 20min;PBS冲洗 , 5min×3次。滴加试剂
2(polyperoxidase-anti-mouse/ rabbitIgG), 37℃孵育 20 min;
PBS冲洗 , 5 min×3次。 DAB显色剂显色。 自来水洗 , 复染 , 封
片 , 镜检。阳性结果的判定:经 DAB显色后阳性目标为棕黄色。
1.4　观察分析
1.4.1　计算方法 各组中每种条件 3张玻片 , 每张玻片计数 10
个视野 , 再统计每种条件阳性细胞灰度值的均值 x±s。
1.4.2　彩色形态学图像分析系统 应用北京航空航天大学图像
中心分析软件。
1.5　统计学方法 用药前后组间样本比较采用 t检验。
2　结果
结果见表 1 ～ 3。
表 1　瑞香狼毒组两肺癌细胞株中 3种基因蛋白
表达(辉度)的比较( x±s)
耐药基因
蛋白
NCI-H446
用药前 用药后
NCI-H157
用药前 用药后
LRP　 151.33±3.07 179.61±2.94＊ 136.41±2.63 169.83±2.29＊＊MDM2 146.26±2.81 164.70±2.31＊ 175.72±2.79 172.19±3.09△
HSP27 153.51±2.72 166.15±2.83△ 152.16±2.44 173.47±3.17＊
表 2　TNF组两肺癌细胞株中 3种基因蛋白
表达(辉度)的比较( x±s)
耐药基因
蛋白
NCI-H446
用药前 用药后
NCI-H157
用药前 用药后
LRP　 151.33±3.07 168.03±2.13＊ 136.41±2.63 174.07±2.33＊＊
MDM2 146.26±2.81 150.28±2.71△ 175.72±2.79 184.62±2.17＊HSP27 153.51±2.72 160.97±3.04△ 152.16±2.44 169.82±2.57＊
表 3　联合用药组两肺癌细胞株中 3种基因蛋白
表达(辉度)的比较( x±s)
耐药基因
蛋白
NCI-H446
用药前 用药后
NCI-H157
用药前 用药后
LRP　 151.33±3.07 174.11±2.73＊ 136.41±2.63 171.61±2.38＊＊MDM2 146.26±2.8 157.62±2.64＊ 175.72±2.79 186.30±2.81＊HSP27 1153.51±2.72 163.21±3.14△ 152.16±2.44 176.22±2.31＊＊
　　用药前后比较 , ＊＊P<0.01;＊P<0.05;△P>0.05
3　讨论
祖国医学典籍中记载瑞香狼毒盛产于河北 、山西 、四川等地 ,
其性味苦 、平 、辛 、有毒 , 入肝 、肺 、脾三经 , 有逐水 、祛痰 、破积 、杀
虫之功效 [ 1] 。近年来 , 国内外学者对瑞香狼毒抗肿瘤方面的功
效进行了深入研究 , 取得了突破性的进展。
TNF是由激活的单核巨噬细胞产生的一种可溶性多功能细
胞因子 ,具有很强的抗肿瘤活性 [ 2] 。其抗肿瘤机制为:特异性地
直接杀伤肿瘤细胞;诱导肿瘤细胞凋亡 [ 3];逆转肿瘤细胞多耐
药 , 增加化疗敏感性 [ 3];抗肿瘤血管生成 [ 4];增加免疫效应细胞
对肿瘤细胞的杀伤作用 [ 3]。
本研究结果显示瑞香狼毒和 TNF对两种肺癌细胞株的 3种
基因蛋白的表达有明显抑制作用 ,并且联合用药组其抑制蛋白表
达的作用明显增强。 提示瑞香狼毒和 TNF阻断 /降低了耐药基
因产物的表达 ,即抑制了基因的活性。
本研究选用的 3种基因蛋白(MDM2、LRP和 HSP27)是目前
公认的存在于对多种化疗药物耐受的恶性肿瘤中 ,与多种恶性肿
瘤的耐药有关 [ 5 ～ 8] 。
国外有研究显示 , LRP在非小细胞肺癌中的表达明显高于小
细胞肺癌 , 这与本研究结果相吻合 。 MDM2, LRP和 HSP27基因
及其表达的蛋白质在多药耐药中各自的作用机制及其相互关系
十分复杂 ,目前尚不明确。本研究表明 , 联合用药组两种肺癌细
胞株中 3种基因蛋白的表达明显减弱 ,与用药前相比有显著差异
(P<0.05), 提示在临床上如果联合这两种药物治疗肺癌可能会
提高化疗效果。结果还显示两种肺癌细胞株对瑞香狼毒组和
TNF组的反应表现出轻微的差异 ,个别耐药基因的表达用药前后
差异无显著性(P>0.05), 提示尽管在不同病理类型的肺癌细胞
中瑞香狼毒提取物和 TNF均表现出降低肺癌细胞基因蛋白表达
的作用 , 但其作用机制可能存在着差异 , 为深入揭示瑞香狼毒和
TNF降低肺癌细胞基因蛋白表达的作用机制 ,还需从基因和蛋白
水平进一步研究证实。
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