全 文 ：第 21 卷第 4期
2 (X) 5 年 12 月
齐 齐 哈 尔 大 学 学 报
J o u rn a l o f Q iq 一h a r U n 扮e rs ity
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齐墩果酸的苦卖菜细胞培养制备与分离纯化研究
唐万侠 1, 2 安东政羲 ’ 苏立强 ’ 张维冰 `
(1
.齐齐哈尔大学化学与化学工程学院 , 齐齐哈尔 16 1以拓; 2旧本新渴大学工学部 , 日本新渴 95 压 2 181 ;
3
.中国科学院大连化学物理研究所 , 国家色谱分析研究中心 , 大连 1 60 11)
摘 要 : 以苦英菜地上部分的培养细胞为原料 , 生物制备具有特殊药用价值的齐墩果酸 ; 也利用有机溶剂萃取及
硅胶柱层析分离进行分离纯化研究 。 通过改变细胞培养基的组成和培养条件 , 可以有效提高齐墩果酸的产出率。
进一步利用红外光谱 、 ’ H一N M R 、 ’ 3 C一N M R等方法对提取物的化学结构进行了结构表征 。 结果表明所得化合物为齐
墩果酸 , 其最佳组织细胞培养条件 : 温度为 21 “ C , 时间为 24d 。
关 健 词 : 苦英菜 ; 细胞培养 ; 齐墩果酸 ; 提取和分离
中图分类号 : Q94 9 . 7 83 .5 文献标识码 : A 文章编号 : 10 7一9 84X (20 5)04 一以犯卜03
苦英菜 ( 及劝动“ 山乞阴 `哪 L . ) , 系菊科被子植物 , 卜 2 年生草本 , 我国大部分地区均有分布 , 该植物
含有大量人体必须的维生素 A[’ , , 生长在路边的苦英菜能吸收汽车尾气排放中的 Pb , 起到净化空气的作用12 。
苦英菜还具有清热解毒 、 消肿止痛等功效 , 毒性低 、 副作用少 3`1 , 是治疗急慢性黄胆型肝炎冈 、 和慢性病毒
性肝炎阎 、 肺结核6l[ 等疾病的理想药物 。 已有研究表明 : 苦英菜中所含有的齐墩果酸是一种五环三掂类化合
物 , 是其重要的药用组成 , 具有消炎 、 增强免疫 、 抑制血小板降集 、 降糖等功效 。 天然苦英菜中该类化合
物的含量很低 , 植物细胞培养法是大量获取该类化合物的有效途径 。
利用植物细胞培养技术生产有用的次生代谢产物是近年来国内外学者竞相研究的热点方向之一。 增加
植物细胞培养物中次生代谢物产量的方法可通过改变培养基成分及其浓度 、 生长调节剂的选择等手段来实
现呵 。 本文以苦荚菜地上部分的细胞为培养原料 , 探讨改变培养基组成 、 培养条件与目标产物齐墩果酸获
取率之间的关系 , 也对产物的分离纯化方法和产物结构表征加以系统研究
1 实验
,
.
, 主要仪器 、 药品
美国 v而 an U in yt p lu s s o (5 o M )ZH 核磁共振仪 , Y AN AC O熔点仪 , H iact hi 高速 自动旋光仪 。 M eO H,
tE o cA
,
H ex an e
, 茉莉酸甲酷 ( M e卿1 Jas m on aet ) ( 日本和光化学公司分析纯试剂 )。 苦英菜组织细胞 (本实
验室培养制备 )o
1
.
2 实验方法
1
.
2
.
1 提取和分 离
取干燥的苦英菜组织细胞 38 9 , 加 20 倍甲醇室温萃取 3 次 , 分次滤出残渣后将甲醇萃取液合并蒸发浓
缩至 30 汕。 将滤出液用乙酸乙醋萃取 3 次 , 合并萃取液并浓缩蒸干 。
将上述乙酸乙醋萃取物 560 .3 m g 加人 54 9硅胶柱 ( 。 28 ~ 只 50 ~ )
, 以乙酸乙酷一环己烷 ( 1 : 9 ,
2 : 8
,
l : 0 )
, 甲醇 ( 10 % ) 溶剂洗脱 , 每种馏分收集 50 mL , 乙酸乙酷一环己烷 ( 1 : 9 ) 部分收集馏份 40
份 。 将每份样品分别浓缩 , 并以硅胶薄层板定性检查 。 薄层色谱展开溶剂为乙酸乙酷一环己烷 ( 2 : 8) , 显
色剂为固体碘 。 薄层检查结果表明 : 第 3 0一38 馏份具有单一相同斑点凡 = .0 4 , 合并其 , 浓缩 、 蒸干 。 进一
收稿日期 : 2加 5一心斤州的
苍金项目 : 国家自然科学基金与日本科学技术振兴机构双边合作项目资助 ( 20 3 7 703 8)
作者简介 : 唐万侠 , 女 , 197 2 年生 , 在读硕士研究生 , 讲师 . 主要从事天然植物化学成分分析方面的研究 。
齐 齐 哈 尔 大 学 学 报 2以)5 年
步用乙酸乙酷溶解样品 , 滤掉不溶物 , 再将上层清液浓缩蒸干后用甲醇重结晶 , 可得白色针晶 .5 2 mg 。 进
一步通过高效液相色谱鉴定为单一组分 。
1
.
.2 2 改变组织细胞培养条件
对于苦英菜组织的细胞培养 , 国内外尚未见报导 。 本实验室对于紫杉细胞培养作过大量研究 l8] , 苦英
菜组织的细胞培养借鉴于紫杉细胞的培养条件 , 对培养液组成 、 培养温度 、 培养时间等条件加以探索 。 发
展了适合苦英菜组织细胞的培养方法。 向细胞培养基中加人适量的茉莉酸甲醋 ( Mhet 刃 Jas m o n a t e ) 作为引
发剂 ( iel ic ot r ) , 可以有效增加目标产物的产率 。
2 结果与讨论
2
.
1 培养基组成与产出率的关系
增加植物细胞培养物中有用目标产物提取率的方法可通过改变培养基成分及浓度 、 生长调节剂的选择
等手段来实犁· ’ “ 。 实验得到的优化苦英菜组织细胞的优化培养条件为 :
培养基组成 : 1 L MS 中加入植物生长促进剂 N从 .2o gm ;
培养温度 : 恒温 lZ oC ;
培养时间 : 24 d 。
利用引发剂也可以大幅度提高培养物中目标产物的提取率 。 为了提高本实验中目标产物的产率 , 在细
胞培养基中引人适量的引发剂 : 茉莉酸甲醋 。 表 1 中给出了加人不同浓度引发剂的组织细胞培养 K 、 L 、 M ,
不加引发剂的组织细胞培养 B 和天然苦荚菜中齐墩果酸的提取率的比较结果 。
表 l 齐墩果酸提取率比较
序号 原料 (干燥 ) 引发剂 ( M J ) 齐墩果酸 ( m目 齐墩果酸 %( )
天然苦英菜 38 . 0 9
组织细胞培养 B 38 邓 g
组织细胞培养 K 23 一30 9
组织细胞培养 L 23 . 73 9
组织细胞培养 M 28 . 07 9
3
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, 不填加 .5 2
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由表 1的结果可以看出 : 添加引发剂比不添加引发剂的苦英菜组织细胞培养物中齐墩果酸的提取率均
有所提高 , 但引发剂的添加量与目标产物的提取率并非简单的正比例关系 。 综合表中的结果 , 试验选择引
发剂的添加量为 20 “ m o巩为最佳。 这种情况下 , 与不加弓!发剂相比 , 齐墩果酸的提取率可提高近 3倍 。
2 2 萃取及分离纯化方法
苦英菜及一些天然药物中齐墩果酸的分离分析方法已有报导lqI 。 由于组织细胞培养环境下的样品组成
与其原植物有很大差别 , 因此发展的分离纯化方法也有所不同 。 本文分别采用乙酸乙醋 、 环己烷 、 甲醇等
溶剂 , 选择不同的配比进行有机溶剂萃取试验和层析分离条件探讨 , 采用硅胶薄层及 HP LC 监测试验 、 结
果 。 得到的较佳方案为 :
萃取 : 20 倍甲醇 ( 10 % ) 室温萃取 3 次 , 蒸发浓缩 , 进一步用乙酸乙醋萃取 。
层析分离 : 硅胶柱 , 以乙酸乙酷一环己烷 ( 1 : 9 , 2 : 8 , l : 0 ) , 甲醇 ( 10 % ) 溶剂洗脱 。
2
.
3 产物的结构表征
齐墩果酸为齐墩果酸烷型五环三菇类化合物 (图 1) , 化学名为 :
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图 l 齐墩果酸结构式
竿 4 期 齐墩果酸的苦荚菜细胞培养制备与分离纯化研究
献中介绍的一致 , 证明分离所得产物为齐墩果酸 (创 e an iol c a c记)。
3 结束语
利用苦英菜的组织细胞培养首次成功地制备分离出具有重要药用价值的化合物一齐墩果酸 。 通过改变
细胞培养基的成分 , 使齐墩果酸的含量提高到原植物的 3倍 。 采用层析等方法发展了生物制备齐墩果酸的
分离纯化方法 , 也通过熔点 、 旋光度 、 红外光谱 、 ` H一N M R 、 ’ 3C一N M R 等方法对产物结构加以表征 。
参 考 文 献
[11I
v e t e T
.
Gar e b n e r ; E妙e M . A . S i卿 e i ar ; S a n dr a F ` Amr d a : e t al , N u t ir t io n R e s e acr h , 24 (20( 科 ), 67 1 一 67 9 .
【2 ] Zh i一 n g X io n g , E n v i o nm e n tal P o l u it o n , 19 97 , 97 (3 ) , 27 5 一 279 .
【31Wan g B . ; Ji an g 2 . , J . Ch i n Pharm
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199 2
,
27 (7 )
,
3 93 一 3 97
.
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,
17 (2)
,
15 2
一
156
.
181 Sak ia
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23 1一 238
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[9 ] H
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D ie itr e h K
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F o od B ioc h
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s卿 , 19 94 , 8 (1) , 57 一 65 ,
[10 l P
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.
P l a n t P hy s io l
,
19眨 , 20 , 1 1 9 .
【1 1」N a i d u , S , R . A n n u al R e p o rt o f th e C h e m ie 日 E x a m i n e r t o t h e G o v e rn ’ t Of M a d r a s , 193 7 , 64 . 12 1 (1 939 ) .
「j Z ] Sh ioj im a , K . ; e 之 a l , N a t u ar l M de ie in e s . , 1 99 7 , 5 1 (2 ) , 125 一 130 .
T h e S e P a r a t io n o f C o m P o u n d O le a n o lie A e id
b y t h e C a llu s C u lt u r e o f s劝n hC us O触ar ce us L
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( 1
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Ch e m is t巧 a n d Ch e m i e al E n ig ne e ir n g C o l e ge of Qi q ih ar Uin v e sr it y , Qiq i har 16 1X() 6 ;
2
.
G ar d u at e S e h o o l o f s e ie n e e an d T
e e h n o lo盯 , Nii g at a U n i v e r s i ty , N ii g a t a , Ja p a n , 9 50一 2 18 1 ;
3
.
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o n al C hr o m a t o 歹 a p h i e R . & A . C e n t e r , D al ia n I n s t it u t e Of C h e m ie al Phy s ie s , T h e C h i n e s e A e a d e m y o f s e i e n e e s , Dal ia n I 16() I 1)
A b s tar e t
: Th e e o m p o u n d o f O l e an o l i e A e id w h ie h h a d s p e e i a l me d i
e a l u s鳍 e w as p r o d u e e d b io l o ig e a l ly b y ht e e a ll u s
e u ltu re o f ht e l e a v e s o f 及 , n动 su o je 扭 ce 邵 L . hT e s tu dy o f i s o l a t i o n an d P u ir if e a t i o n w a s b a s e d o n th e m e ht od of
o飞 an i e s o l v en t e x tar e ti o n a n d s i l i e a g e l fl as h e o lu nr e h or m at o笋p h y . hT e e x加 e ti n g am o u n t o f ht e e o呷 o u n d w a s
im pm v e d b y o h a n g i n g ht e c o m p o s i t io n of ht e e u lut er m e d iu m an d e u l t u ir n g e o n d i t io n s
.
Th e s tur
e ut er o f t h e s e p a ar t e d
e o哪 o u n d w as d e et mr i n e d b y m e l t i n g p o i n t , o p t i e al or at io n , IR , ’ H一N M R , an d ” e 一N M R . I t w a s s h o wn in 山 e er s u l t
t h at ht e s e p ar at e d e o m训 u n d w as o l e an o li e A e id an d ht e b e s t e al l u s e u lut er e o n d i ti o n w a s a t 2 1“ C fo r 2 4 d a y s .
Ke y w o rd s
: 肠刀动us o龙ar 况us L . , e a l u s e u l t u er , O l e an o il e A e id , e x t r a e t io n an d s e p ar it o n