全 文 ：麦类作物学报　２０１２，３２（１）：３６－４３
Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｔｒｉｔｉｃｅａｅ　Ｃｒｏｐｓ
长穗偃麦草ＥｅＳｎＲＫ２．６基因克隆及生物信息学分析
＊
徐　蓓１，郭丽香１，赵昌平２，高世庆２，唐益苗２
（１．首都师范大学生命科学学院，北京１０００４８；２．北京杂交小麦工程技术研究中心，北京１０００９７）
摘　要：蔗糖非发酵相关蛋白激酶家族２（ＳｎＲＫ２）基因家族受各种逆境胁迫诱导表达，在提高植物的抗
逆性中发挥着至关重要的作用。为继续深入挖掘有效的抗逆相关基因资源并为转基因小麦提供重要候选基
因，基于同源克隆方法从抗旱、耐盐性极强的长穗偃麦草中克隆了ＥｅＳｎＲＫ２．６基因的ｃＤＮＡ序列，该基因全
长１　０９６ｂｐ，编码３６４个氨基酸，推测分子量为４１．７３ｋＤ，等电点为５．９８，是亲水性氨基酸，共有１８处磷酸化
位点和１处跨膜域。氨基酸序列同源性分析发现，长穗偃麦草ＥｅＳｎＲＫ２．６基因与其他目前已报道的抗逆效果
显著的ＳｎＲＫ２家族基因有较高同源性，同大豆ＳｎＲＫ２．６基因同源性达到９５％，且具有典型的丝氨酸／苏氨酸
类蛋白激酶保守域。系统进化树分析表明，ＥｅＳｎＲＫ２．６与ＳｂＳｎＲＫ２．６属于同一进化分枝上。因此，推测该基
因属于ＳｎＲＫ２基因家族成员，可能在参与逆境胁迫反应、增强植物的抗逆性中起着重要作用。
关键词：长穗偃麦草；ＳｎＲＫ；基因克隆；序列分析；系统进化树
中图分类号：Ｓ５１２．９；Ｓ３３０　　　　文献标识码：Ａ　　　　文章编号：１００９－１０４１（２０１２）０１－００３６－０８
Ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｔｈｅ
ＳｎＲＫ２．６　Ｇｅｎｅ　ｆｒｏｍＥｌｙｔｒｉｇｉａ　ｅｌｏｎｇａｔｅ
ＸＵ　Ｂｅｉ　１，ＧＵＯ　Ｌｉ－ｘｉａｎｇ１，ＺＨＡＯ　Ｃｈａｎｇ－ｐｉｎｇ２，ＧＡＯ　Ｓｈｉ－ｑｉｎｇ２，ＴＡＮＧ　Ｙｉ－ｍｉａｏ２
（１．Ｃｏｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃａｐｉｔａｌ　Ｎｏｒｍａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ　１０００４８，Ｃｈｉｎａ；２．Ｂｅｉｊｉｎｇ　Ｈｙｂｒｉｄ　Ｗｈｅａｔ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ａｎｄ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｅｎｔｅｒ，Ｂｅｉｊｉｎｇ　１０００９７，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｄｒｏｕｇｈｔ，ｓａｌｉｎｉｔｙ　ａｎｄ　ｌｏｗ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ａｒｅ　ｔｈｅ　ｍａｊｏｒ　ｆａｃｔｏｒｓ　ｌｉｍｉｔｉｎｇ　ｃｒｏｐ′ｓ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ　ａｎｄ
ｑｕａｌｉｔｙ．Ａｔ　ｐｒｅｓｅｎｔ，ｔｈｅｒｅ　ｗｅｒｅ　ａ　ｆｅｗ　ｏｆ　ｅｘｃｅｌｅｎｔ　ｇｅｎｅｓ　ｕｓｅｄ　ｉｎ　ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｏｆ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｃｒｏｐｓ　ｗｉｔｈ
ｓｔｒｅｓｓ　ｔｏｌｅｒａｎｃｅ，ｗｈｉｃｈ　ｈｅａｖｉｌｙ　ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ　ｔｈｅ　ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｐｒｏｇｒｅｓｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｎｅｗ　ｍａｔｅｒｉａｌｓ　ａｎｄ　ｎｅｗ　ｇｅｒｍ－
ｐｌａｓｍ　ｏｆ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｃｒｏｐｓ．Ｓｕｃｒｏｓｅ　ｎｏｎ－ｆｅｒｍｅｎｔｉｎｇ　１－ｒｅｌａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｋｉｎａｓｅ　２（ＳｎＲＫ２）ｗａｓ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｔｏ
ｅｘｐｒｅｓｓ　ｂｙ　ｋｉｎｄｓ　ｏｆ　ｈｙｐｅｒｏｓｍｏｔｉｃ　ｓｔｒｅｓｓｅｓ，ｐｌａｙｅｄ　ａ　ｋｅｙ　ｒｏｌｅ　ｉｎ　ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ　ｓｔｒｅｓｓ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｏｆ　ｐｌａｎｔｓ．
Ｈｅｎｃｅ，ｉｎ　ｏｒｄｅｒ　ｔｏ　ｍｉｎｅ　ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｓｔｒｅｓｓ－ｒｅｌａｔｅｄ　ｇｅｎｅｓ　ａｎｄ　ｓｕｐｐｌｙ　ｉｍｐｏｒｔａｎｔ　ｃａｎｄｉｄａｔｅ　ｇｅｎｅｓ　ｆｏｒ
ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｗｈｅａｔ，ＥｅＳｎＲＫ２．６　ｗａｓ　ｃｌｏｎｅｄ　ｆｒｏｍ　Ｅｌｙｔｒｉｇｉａ　ｅｌｏｎｇａｔｅ，ｗｈｉｃｈ　ｗｉｔｈ　ｇｏｏｄ　ｄｒｏｕｇｈｔ　ａｎｄ
ｓａｌｔ－ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｓ，ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　ｔｈｉｓ　ｓｔｕｄｙ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｃＤ－
ＮＡ　ｏｆ　ＥｅＳｎＲＫ２．６　ｗａｓ　１０９６ｂｐ　ｉｎ　ｓｉｚｅ　ａｎｄ　ｅｎｃｏｄｅｄ　３６４ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ，ｅｎｃｏｄｉｎｇ　ａ　ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ　ａｍｉｎｏ
ａｃｉｄ　ｗｉｔｈ　１８ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ　ｓｉｔｅｓ　ａｎｄ　ｏｎｅ　ｍｅｍｂｒａｎｅ－ｓｐａｎｎｉｎｇ　ｄｏｍａｉｎ．Ｔｈｅ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｗｅｉｇｈｔ　ａｎｄ　ｔｈｅ
ｉｓｏ－ｅｌｅｃｔｒｉｃ　ｐｏｉｎｔ　ｗａｓ　４１．７３ｋＤ　ａｎｄ　５．９８，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ　ｄｅｄｕｃｅｄ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ　ｏｆ　ＥｅＳｎＲＫ２．６
ｓｈａｒｅｄ　ｈｉｇｈ　ｈｏｍｏｌｏｇｙ　ｔｏ　ｏｔｈｅｒ　ｇｅｎｅｓ　ｏｆ　ＳｎＲＫ２，ｗｈｉｃｈ　ｄｉｓｐｌａｙｅｄ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ　ｅｆｆｅｃｔ　ｉｎ　ｓｔｒｅｓｓ　ｔｏｌｅｒａｎｃｅ，
ｅｓｐｅｃｉａｌｙ　ｔｈｅ　ｄｅｄｕｃｅｄ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈｅ　ｍａｘｉｍｕｍ　ｈｏｍｏｌｏｇｙ　ｗｉｔｈ　ＳｂＳｎＲＫ２．６（９５％ｉｄｅｎｔｉｔｙ），
ａｎｄ　ｉｔ　ｈａｄ　ｔｙｐｉｃａｌｙ　ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ　ｄｏｍａｉｎ　ｏｆ　ｓｅｒｉｎｅ／ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ　ｋｉｎａｓｅ．Ｔｈｅ　ｐｈｙｌｏｇｅｎｉｃ　ｔｒｅｅ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　Ｅｅ－
＊收稿日期：２０１１－０７－０１　　　修回日期：２０１１－０８－２５
基金项目：国家抗逆转基因重大专项（２００８ＺＸ０８００２－００２）；北京市科技新星项目（２００７Ｂ０５６、２００８Ｂ０３５）；北京市自然基金项目
（５１０２０１６）；北京农林科学院院青年基金项目。
作者简介：徐 蓓（１９８６－），女，硕士研究生，主要从事小麦抗逆分子生物学研究。Ｅ－ｍａｉｌ：ｘｂｅｉ１９８６＠１６３．ｃｏｍ
通讯作者：赵昌平（１９６２－），男，博士，研究员，主要从事小麦遗传育种研究。Ｅ－ｍａｉｌ：ｂｊｈｗｃ２００３＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ
高世庆（１９７７－），男，博士，副研究员，主要从事小麦抗逆、高产转基因育种研究。Ｅ－ｍａｉｌ：ｇｓｈｉｑ＠１２６．ｃｏｍ
唐益庙（１９７３－），男，博士，副研究员，主要从事小麦抗逆、高产转基因育种研究。Ｅ－ｍａｉｌ：ｔａｎｇｙｉｍｉａｏ＠１２６．ｃｏｍ
ＳｎＲＫ２．６　ａｎｄ　ＳｂＳｎＲＫ２．６ｂｅｌｏｎｇｅｄ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｓａｍｅ　ｇｒｏｕｐ．Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ，ｗｅ　ｄｅｄｕｃｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ＥｅＳｎＲＫ２．６
ｇｅｎｅ　ｗａｓ　ａ　ｍｅｍｂｅｒ　ｏｆ　ＳｎＲＫ２ｆａｍｉｌｙ　ａｎｄ　ｍｉｇｈｔ　ｐａｒｔｉｃｉｐａｔｅｄ　ｉｎ　ａｂｉｏｔｉｃ　ｓｔｒｅｓｓ　ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ，ｗｈｉｃｈ　ｐｌａｙｅｄ
ｉｍｐｏｒｔａｎｔ　ｒｏｌｅｓ　ｉｎ　ｅｎｈａｎｃｉｎｇ　ｔｈｅ　ｓｔｒｅｓｓ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｓ　ｏｆ　ｐｌａｎｔ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｅｌｙｔｒｉｇｉａ　ｅｌｏｎｇａｔｅ；ＳｎＲＫ；Ｇｅｎｅ　ｃｌｏｎｉｎｇ；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ；Ｐｏｌｙｇｅｎｅｔｉｃ　ｔｒｅｅ
　　蔗糖非发酵相关蛋白激酶家族（ＳｎＲＫｓ）在植
物许多生理过程中起着重要的作用，如激素信号
传导、非生物胁迫和植物的生长发育等［１－４］。
ＳｎＲＫ蛋白激酶属于丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶超
级家族，由于基因序列的相似性和基因结构的不
同，被分为三个亚家族，分别是：ＳｎＲＫ１，ＳｎＲＫ２
和ＳｎＲＫ３［５］。
ＳｎＲＫ１是糖信号传导过程中的关键因子，在
植物 中 控 制 糖 和 淀 粉 的 代 谢［６］，ＳｎＲＫ２ 和
ＳｎＲＫ３亚家族由于调节区在Ｃ－末端的高度分散，
推测它们的功能是蛋白间的相互作用或是调节激
酶的活性［５］。ＳｎＲＫ２主要受渗透胁迫和ＡＢＡ信
号诱导。ＳｎＲＫ３又被称为类钙调磷酸酶Ｂ亚基
互作蛋白激酶（Ｃａｌｃｉｎｅｕｒｉｎ　Ｂ－ｌｉｋｅ　Ｃａｌｃｉｕｍ　Ｓｅｎ－
ｓｏｒ－Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｋｉｎａｓｅｓ，ＣＩＰＫ）［７－８］，它们
与类钙调磷酸酶Ｂ亚基相互作用，形成网络介导
Ｃａ２＋信号的传导和一系列复杂的外界刺激［９－１０］。
近年来，对高等植物ＳｎＲＫ２基因家族的研究
报道较多。蚕豆ＡＡＰＫ 和拟南芥ＯＳＴ１／ＳＲＫ２Ｅ
都是ＳｎＲＫ２家族的基因，已经证实被ＡＢＡ激活，
在ＡＢＡ控制气孔关闭过程及相关基因表达过程
中起着一定的作用［１１－１３］。研究认为，小麦ＳｎＲＫ２
家族基因ＴａＳｎＲＫ２．７ 在糖代谢、降低渗透势、增
强光系统ＩＩ的活性以及促进植物生根等生理生
化过程中起着重要作用［１５］。还有研究认为，水稻
ＳｎＲＫ２家族基因ＯｓＳＡＰＫ４的诱导表达可以提高
水稻在盐胁迫下种子的萌发率［１６］。Ｃａｌｉｓｔｅ研究
认为，拟南芥ＳｎＲＫ２．６基因通过参与调控主要的
逆境胁迫代谢过程和ＡＢＡ信号途径来控制气孔
的开度［１６］。上述研究表明，ＳｎＲＫ２家族基因受
胁迫诱导表达，在抵抗逆境胁迫过程中起着重要
作用［１７］。
长穗偃麦草（Ｅｌｙｔｒｉｇｉａ　ｅｌｏｎｇａｔａ）是小麦的
近缘属植物，具有普通小麦所没有的优异抗逆基
因。本研究采用同源克隆策略从长穗偃麦草中克
隆获得一个ＳｎＲＫ２家族基因ＥｅＳｎＲＫ２．６，通过
对该基因的氨基酸序列及蛋白质结构等进行生物
信息学分析，进一步推测该基因的分子生物学功
能，从而为该基因在小麦抗逆转基因分子育种中
的应用奠定理论基础。
１　材料与方法
１．１　试验材料
本研究所采用的试验材料为长穗偃麦草，由
北京农林科学院草业中心孟林研究员提供。
１．２　主要试剂
ＴＲＩＺＯＬ试剂盒、反转录酶购自北京全式金
公司。ＰＣＲ 试剂、Ｅｘ　Ｔａｑ　ＤＮＡ 聚合酶、载体
ｐＭＤ１８－Ｔ等购自ＴａＫａＲａ公司。ＤＮＡ凝胶回收
试剂盒购自天根生物技术有限公司。
１．３　总ＲＮＡ提取
将室温２５℃条件下光照培养４～５周左右的
长穗偃麦草植株进行干旱胁迫处理，－８０℃保存
备用。利用ＴＩＡＮＧＥＮ公司的总ＲＮＡ提取试剂
盒，并按照使用说明书的操作程序从处理后的长
穗偃麦草中提取总ＲＮＡ，利用紫外分光光度仪测
定ＲＮＡ浓度后置于－８０℃冰箱保存备用。
１．４　引物设计
根据Ｇｅｎｂａｎｋ数据库中的高粱ＳｎＲＫ２．６基
因序列（登录号：ＸＭ＿００２４５３９２２），利用引物设计
软件Ｐｒｉｍｅｒ　５．０设计特异引物（上游引物：Ｆ：５′－
ＡＴＧＧＡＣＡＡＧＴＡＣＧＡＧＣＴＧＣＴＣＡＡＧ－３′； 下
游引物：Ｒ：５′－ＴＣＡＴＴＴＴＡＴＣＡＧＧＴＧＴＴＧＡ－
ＡＡＡＴＣＣＣ－３′），于上海生物工程技术有限公司
合成。
１．５　ＰＣＲ扩增
提取长穗偃麦草的总ＲＮＡ经过逆转录合成
长穗偃麦草ｃＤＮＡ序列，经过ＰＣＲ克隆目的片
段。反应体系（２０μＬ）为２×ＧＣ　ＰＣＲ　ｂｕｆｆｅｒ　Ｉ　１０
μＬ，ｄＮＴＰ （１０μｍｏｌ·Ｌ
－１）１．８μＬ，引物（１０
μｍｏｌ·Ｌ
－１）１μＬ，Ｔａｑ　ｐｌｕｓ　ＤＮＡ 聚合酶（８１３４
×１０２５ｋａｔ·Ｌ－１）０．２μＬ，模板ｃＤＮＡ　２．０μＬ
（１００ｎｇ），ｄｄＨ２Ｏ　５μＬ。反应程序：９４℃预变性５
ｍｉｎ，９４℃变性３０ｓ，５５℃退火３０ｓ，７２℃延伸
３０ｓ，３４个循环，７２℃延伸１０ｍｉｎ，４℃保温。
１．６　目的片段回收及克隆
ＰＣＲ产物经１．２％ 琼脂糖电泳检测后，利用
ＴＩＡＮＧＥＮ公司的琼脂糖凝胶ＤＮＡ回收试剂盒
·７３·第１期　　　　　　　　　徐　蓓等：长穗偃麦草ＥｅＳｎＲＫ２．６基因克隆及生物信息学分析
进行目的片段回收，纯化产物与ｐＭＤ１８－Ｔ载体
１６℃连接４０ｍｉｎ，并转化感受态细胞ＴＯＰ１０，用
含Ｘ－Ｇａｌ、ＩＰＴＧ和氨苄青霉素（使用浓度１００μｇ
／ｍＬ）的ＬＢ平板于３７℃培养１２～１６ｈ。经蓝白
斑筛选，随机挑选白色菌斑３７℃摇荡过夜，进行
菌液ＰＣＲ，检测阳性克隆。
１．７　序列生物信息学分析
将含有目的片段的菌液送到宝瑞通生物技术
（北京）公司进行测序。通过 ＮＣＢＩ数据库中的
ｂｌａｓｔｐ（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．
ｃｇｉ？ＰＲＯＧＲＡＭ ＝ ｂｌａｓｔｐ＆ＢＬＡＳＴ ＿ＰＲＯ－
ＧＲＡＭＳ＝ｂｌａｓｔｐ）搜索引擎对测序结果进行同源
性分析；利用 Ｅｘｐａｓｙ 网站 （ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘ－
ｐａｓｙ．ｃｈ／）对ＥｅＳｎＲＫ２．６蛋白进行氨基酸组成、
等电点等理化性质及亲水性／疏水性进行分析；利
用 ＷｏＬＦ　ＰＳＯＲＴ（ｈｔｔｐ：／／ｗｏｌｆｐｓｏｒｔ．ｏｒｇ／）网站
对蛋白质进行亚细胞定位的预测；利用 ＴＭ－
ＨＭＭ网站进行跨膜域的分析；分子进化树的构
建使用软件 ＭＥＧＡ４软件中 ＮＪ法完成；多序列
比对是用ＢｉｏＥｄｉｔ软件完成；利用ＰｒｅｄｉｃｔＰｒｏｔｅｉｎ－
ＰＨＤ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｅｄｉｃｔｐｒｏｔｅｉｎ．ｏｒｇ／）信息库
对蛋白质序列进行二级结构预测；利用 Ｎｅｔ－
Ｐｈｏｓ２．０Ｓｅｒｖｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖ－
ｉｃｅｓ／ＮｅｔＰｈｏｓ／）进行蛋白磷酸化预测。
２　结果与分析
２．１　ＥｅＳｎＲＫ２．６基因克隆及测序分析
以长穗偃麦草干旱胁迫处理后ｃＤＮＡ为模
板进行ＲＴ－ＰＣＲ扩增，经琼脂糖凝胶电泳分析，
结果得到１．１ｋｂ左右的特异性ＰＣＲ条带（图１）。
将目的片段与ｐＭＤ１８－Ｔ载体连接并转化大肠杆
菌ＴＯＰ１０，通过蓝白斑筛选，随机挑选４个白色
菌落进行ＰＣＲ检测，其中３个克隆扩增到约１ｋｂ
左右的ＤＮＡ带，对其进一步测序分析。
测序结果表明，ＥｅＳｎＲＫ２．６基因含有一个完
整的开放阅读框，阅读框架全长１　０９６ｂｐ，编码
３６４个氨基酸残基，含有起始密码子ＡＴＧ和终止
密码子 ＴＡＧ。ＮＣＢＩ蛋白质ｂｌａｓｔｐ比对分析表
明，该基因编码的蛋白含有丝氨酸／苏氨酸结构
域，为蔗糖非发酵相关蛋白激酶家族ＳｎＲＫ２类蛋
白激酶。
２．２　ＥｅＳｎＲＫ２．６基因进化树及多序列比对分析
为进一步研究ＥｅＳｎＲＫ２．６基因与其他抗逆相
关ＳｎＲＫ２家族基因的关系，将ＥｅＳｎＲＫ２．６基因与
拟南芥 ＳｎＲＫ２家族的基因（ＡｔＳｎＲＫ２．１、Ａｔ－
ＳｎＲＫ２．２、ＡｔＳｎＲＫ２．３、ＡｔＳｎＲＫ２．４、ＡｔＳｎＲＫ２．７、
ＡｔＳｎＲＫ２．９、ＡｔＳｎＲＫ２．１０）、高粱ＳｎＲＫ２家族的基
因 （ＳｂＳｎＲＫ２．１、ＳｂＳｎＲＫ２．２、ＳｂＳｎＲＫ２．３、Ｓｂ－
ＳｎＲＫ２．４、ＳｂＳｎＲＫ２．６、ＳｂＳｎＲＫ２．８、ＳｂＳｎＲＫ２．９、
ＳｂＳｎＲＫ２．１０）、水稻 ＳｎＲＫ２ 家族的基因 （Ｏｓ－
ＳＡＰＫ１～ＯｓＳＡＰＫ１０）和玉米ＳｎＲＫ２家族的基因
（ＺｍＳｎＲＫ２．１～ＺｍＳｎＲＫ２．７）进行同源性比较，
发现ＥｅＳｎＲＫ２．６与单子叶ＳｎＲＫ２基因家族成员
有较高同源性，如：高粱、玉米、水稻。与双子叶植
物同源性较低，如拟南芥。ＥｅＳｎＲＫ２．６与这些抗
逆相关基因同源性在９５．０５％到５７．９１％之间，与
ＳｂＳｎＲＫ２．６同源性最高，达到９５．０５％，与Ｚｍ－
ＳｎＲＫ２．６同源性是９０．０５％，与ＯｓＳＡＰＫ６同源性
是８９．６５％，与拟南芥基因ＡｔＳｎＲＫ２．１同源性是
７１．９８％。在此基础上用 ＭＥＧＡ４软件中 ＮＪ法
建立种系发生树（图２），结果显示，ＥｅＳｎＲＫ２．６与
ＳｂＳｎＲＫ２．６、ＺｍＳｎＲＫ２．６、ＳｂＳｎＲＫ２．６、ＯｓＳＡＰ－
Ｋ６、ＺｍＳｎＲＫ２．７、ＯｓＳＡＰＫ７位于同一进化分枝，
具有较近的亲缘关系。应用 ＢｉｏＥｄｉｔ软件进行
ＥｅＳｎＲＫ２．６基因的多序列比对分析，发现该基因
与其它ＳｎＲＫ２家族基因在Ｃ－端和Ｎ－端有２个高
度保守域，包括一个 ＡＴＰ结合域和一个蛋白激
酶结合域（图３）。
　　Ａ：ＰＣＲ扩增电泳图；Ｂ：菌液ＰＣＲ检测结果。图 Ａ中，１为
目的基因扩增产物；２为水（对照），Ｍ 为 Ｍａｒｋｅｒ　ＤＬ５０００；图Ｂ
中，１、３、４为阳性克隆，２为水（对照），Ｍ为 Ｍａｒｋｅｒ　ＤＬ５０００。
图１　ＥｅＳｎＲＫ２．６基因克隆电泳检测结果
Ｆｉｇ．１　Ｔｈｅ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ
ＥｅＳｎＲＫ２．６　ｇｅｎｅ　ｃｌｏｎｅｄ
２．３　ＥｅＳｎＲＫ２．６基因的氨基酸组成及亲、疏水性
分析
由 Ｅｘｐａｓｙ网站（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／
ｔｏｏｌｓ／＃ｔｒａｎｓｌａｔｅ）提供的软件对ＥｅＳｎＲＫ２．６基因
编码氨基酸序列的基本特征进行分析。结果显
示，该基因所预测的蛋白质分子量为４１．７３ｋＤ，
等电点为５．７４，理论推导半衰期是３０ｈ，不稳定
参数是３８．８４，是稳定蛋白（参数大于４０是不稳
·８３· 麦　类　作　物　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　第３２卷
图２　ＥｅＳｎＲＫ２．６基因进化树分析
Ｆｉｇ．２　Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｔｒｅｅ　ｏｆ　ＥｅＳｎＲＫ２．６ｇｅｎｅ
定蛋白）。氨基酸组成中带正电荷氨基酸（Ａｒｇ、
Ｌｙｓ）５８个，占１５．９３％，带负电荷氨基酸（Ａｓｐ、
Ｇｌｕ）４９个，占１３．４６％，疏水性氨基酸１５５个，占
４２．５８％，亲水性氨基酸１５５个，占４２．５８％（表
１）。利用 Ｅｘｐａｓｙ网站（ｈｔｔｐ：／／ｃａ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／
ｔｏｏｌｓ／ｐｒｏｔｓｃａｌｅ．ｈｔｍｌ）对蛋白质亲水性、疏水性进
行分析，结果（图４）显示疏水性最高的氨基酸是
位于１９０位的亮氨酸（Ｌ），亲水性最高的氨基酸
是３２９位的谷氨酸（Ｅ），ＥｅＳｎＲＫ２．６蛋白属于亲
水性蛋白，与ＳｂＳｎＲＫ２．６蛋白相似。
２．４　ＥｅＳｎＲＫ２．６蛋白质结构预测分析
跨膜域的预测结果显示，在１８０～２００氨基酸
区存在跨膜域（图５Ａ），结合亲水性分析，跨膜域
处亲水性较强。ＥｅＳｎＲＫ２．６基因的亚细胞定位
预测显示该基因可能定位在细胞质内，与Ｓｂ－
ＳｎＲＫ２．６相似［１８］。ＥｅＳｎＲＫ２．６蛋白二级结构预
测分析（图５Ｂ）发现，该蛋白结构中螺旋结构占
３２．９７％，折叠结构占 １４．２９％，环状结构占
５２．７５％，结合跨膜域及疏水性／亲水性分析，跨膜
域处多为螺旋结构，且富含α－螺旋。
　　根据ＮｅｔＰｈｏｓ　２．０Ｓｅｒｖｅｒ推测，ＥｅＳｎＲＫ２．６
蛋白有７处丝氨酸磷酸化位点，５处苏氨酸磷酸化
位点和６处酪氨酸磷酸化位点（图５Ｃ），并对与
ＥｅＳｎＲＫ２．６同源性较高的ＳｂＳｎＲ２．６和ＡｔＳｎＲＫ－
２．１０ 进行磷酸化分析（如图５Ｄ、５Ｅ），ＳｂＳｎＲ２．６
有５处丝氨酸磷酸化位点，５处苏氨酸磷酸化位点
和６处酪氨酸磷酸化位点。ＡｔＳｎＲＫ２．１０有１０处
丝氨酸磷酸化位点，３处苏氨酸磷酸化位点和６
处酪氨酸磷酸化位点。蛋白质磷酸化过程是植物
在逆境胁迫条件下体内能量代谢和信号传递中的
重要生化反应，从而推测ＥｅＳｎＲＫ２．６经过磷酸化
修饰后参与逆境胁迫下的细胞内信号传导。综上
推测，ＥｅＳｎＲＫ２．６与抗逆基因具有类似功能。
·９３·第１期　　　　　　　　　徐　蓓等：长穗偃麦草ＥｅＳｎＲＫ２．６基因克隆及生物信息学分析
　　三角的方框代表ＡＴＰ结合域，五角的方框代表丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶结合域。相同氨基酸残基用黑色背景表示，用虚线表示的
空格代表最佳比对的结果。
图３　ＥｅＳｎＲＫ２．６基因与ＳｎＲＫ２家族其他物种基因的多序列比对
Ｆｉｇ．３　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　ｏｆ　ＥｅＳｎＲＫ２．６　ｗｉｔｈ　ｏｔｈｅｒ　ＳｎＲＫ２ｓｆｒｏｍ　ｐｌａｎｔ　ｓｐｅｃｉｅｓ．Ｔｈｅ　ｂｏｘ
ｉｎｄｉｃａｔｅｄ　ｂｙ　ａ　ｓｏｌｉｄ　ｔｒｉａｎｇｌｅ　ｉｓ　ＡＴＰ－ｂｉｎｄｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ　ｓｉｇｎａｔｕｒｅ
图４　ＥｅＳｎＲＫ２．６ 蛋白质亲水性分析
Ｆｉｇ．４　Ｔｈｅ　ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃｉｔｙ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ＥｅＳｎＲＫ２．６
３　讨 论
在生态环境的选择下，植物逐步形成了适应
环境的不同反应机制，尤其是对逆境的反应机制。
研究表明，ＳｎＲＫ２家族基因在逆境环境中起着重
要作用［１９－２０］。本研究利用同源克隆的方法，成功
从长穗偃麦草中克隆到了ＥｅＳｎＲＫ２．６基因。结
构预测分析表明，ＥｅＳｎＲＫ２．６有潜在的苏氨酸／
丝氨酸及酪氨酸激酶活性，与其他ＳｎＲＫ２家族基
因一样，其在Ｎ－和Ｃ－端有２个保守域，Ｎ－端的催
化域是高度保守的，包括一个 ＡＴＰ结合域和一
个蛋白激酶活化位点（图３）。在Ｃ－端区域，酸性
·０４· 麦　类　作　物　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　第３２卷
　　Ａ：ＥｅＳｎＲＫ２．６ 蛋白跨膜域分析；Ｂ：ＥｅＳｎＲＫ２．６ 蛋白二级结构预测图；Ｃ：ＥｅＳｎＲＫ２．６ 磷酸化位点分析；Ｄ：ＳｂＳｎＲＫ２．６ 磷酸化位
点分析；Ｅ：ＡｔＳｎＲＫ２．１０ 磷酸化位点分析。
Ｓｅｒｉｎｅ：丝氨酸磷酸化位点；Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ：丝氨酸磷酸化位点；Ｔｙｒｏｓｉｎｅ：酪氨酸磷酸化位点；Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ：临界点。
图５　ＥｅＳｎＲＫ２．６蛋白结构分析
Ｆｉｇ．５　Ｔｈｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ＥｅＳｎＲＫ２．６
·１４·第１期　　　　　　　　　徐　蓓等：长穗偃麦草ＥｅＳｎＲＫ２．６基因克隆及生物信息学分析
表１　ＥｅＳｎＲＫ２．６蛋白的氨基酸含量
Ｔａｂｌｅ　１　 Ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｃｏｎｔｅｎｔｓ　ｏｆ　ＥｅＳｎＲＫ２．６
氨基酸组成 数量 百分比／％ 氨基酸组成 数量 百分比／％
丙氨酸Ａｌａ（Ａ）＊ ２２　 ６．０４ 甲硫氨酸 Ｍｅｔ（Ｍ）＊ ８　 ２．２０
天冬氨酸Ａｓｐ（Ｄ）＃ ２６　 ７．１４ 天冬酰胺Ａｓｎ（Ｎ） １１　 ３．０２
半光氨酸Ｃｙｓ（Ｃ） ８　 ２．２０ 脯氨酸Ｐｒｏ（Ｐ）＊ １９　 ５．２２
谷氨酸Ｇｌｕ（Ｅ）＃ ３２　 ８．７９ 谷氨酰胺Ｇｌｎ（Ｑ）＃ １５　 ４．１２
苯丙氨酸Ｐｈｅ（Ｆ）＊ １５　 ４．１２ 精氨酸Ａｒｇ（Ｒ）＃ ２３　 ６．３２
甘氨酸Ｇｌｙ（Ｇ） ２１　 ５．７７ 丝氨酸Ｓｅｒ（Ｓ）＃ ２２　 ６．０４
组氨酸 Ｈｉｓ（Ｈ）＃ １１　 ３．０２ 苏氨酸Ｔｈｒ（Ｔ）＃ １４　 ３．８５
异亮氨酸Ｉｌｅ（Ｉ）＊ ２４　 ６．５９ 缬氨酸Ｖａｌ（Ｖ）＊ ２２　 ６．０４
赖氨酸Ｌｙｓ（Ｋ）＃ ２６　 ７．１４ 色氨酸Ｔｒｐ（Ｗ）＊ ３　 ０．８２
亮氨酸Ｌｅｕ（Ｌ）＊ ２７　 ７．４２ 酪氨酸Ｔｙｒ（Ｙ）＊ １５　 ４．１２
　　＊：疏水氨基酸；＃：亲水氨基酸。
氨基酸的延伸与谷氨酸盐形成负电结构，推测该
区域可能在蛋白与蛋白间相互作用过程中及与
ＡＢＡ有关的途径中起到了重要作用［２１］。从同源
进化树的角度看，ＥｅＳｎＲＫ２．６与ＳｂＳｎＲＫ２．６、Ｚｍ－
ＳｎＲＫ２．６、ＺｍＳｎＲＫ２．７位于同一进化分枝，其中
与ＳｂＳｎＲＫ２．６同源性最高。研究显示，高粱基因
ＳｂＳｎＲＫ２．６、ＺｍＳｎＲＫ２．６、ＺｍＳｎＲＫ２．７ 涉 及
ＡＢＡ信号通路和干旱胁迫［２２－２３］，从而推测Ｅｅ－
ＳｎＲＫ２．６基因对逆境胁迫可能具有一定的响应。
大量试验证明，蛋白磷酸化是植物抵抗逆境
胁迫的主要信号传导过程［２４］。在真核生物中，可
逆的蛋白磷酸化是对逆境胁迫环境感知和响应中
心，是控制细胞功能的主要代谢环节，例如植物对
环境刺激和病虫害的应答、新陈代谢内分泌的调
控等等［２５］。预测分析发现，与ＥｅＳｎＲＫ２．６基因位
于同一进化枝的拟南芥基因ＡｔＳｎＲＫ２．１０共有１９
处磷酸化位点，ＡｔＳｎＲＫ２．１０基因通过磷酸化脱
水蛋白或是与磷酸结合来调控植物对非生物胁迫
的反应［２６］。由此推测，ＥｅＳｎＲＫ２．６可能也是通过
可逆的磷酸化反应对逆境胁迫进行感知和应答的。
　　目前对ＳｎＲＫ２家族基因研究较多，但是对该
家族基因具体的调控机理研究尚不清楚，而且对
该家族基因进行作物抗逆性遗传改良的研究报道
较少。长穗偃麦草作为小麦的近缘属植物，可以
为转基因小麦提供优异的候选基因。本研究通过
对长穗偃麦草ＥｅＳｎＲＫ２．６基因结构和功能进行
系统的生物信息学预测分析，为今后进一步深入
研究ＳｎＲＫ２家族基因抗逆性奠定了理论基础，并
且在转基因分子育种应用中具有重要意义。
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［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ，２００８，２７：１８６１－１８６８．
［２４］Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｓｈｕｈｅｉ，Ｈｉｄｅｙｕｋｉ．Ｍｉｎａｍｉ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ
ｏｆ　ｔｈｅ　ｒｉｃｅ　ｓｕｃｒｏｓｅ　ｎｏｎｆｅｒｍｅｎｔｉｎｇ１－ｒｅｌａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｋｉｎａｓｅ２
ｆａｍｉｌｙ　ｂｙ　ｈｙｐｅｒｏｓｍｏｔｉｃ　ｓｔｒｅｓｓ　ａｎｄ　ａｂｓｃｉｓｉｃ　ａｃｉｄ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ
Ｃｅｌ，２００４，１６：１１６３－１１７７．
［２５］Ｃｏｈｅｎ　ｐ．Ｐｒｏｔｅｉｎ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｈｏｒｍｏｎｅ　ａｃｔｉｏｎ．Ｐｒｏ－
ｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｒｏｙａｌ　Ｓｏｃｉｅｔｙ　Ｂ［Ｊ］．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９８８，
２３４：１１５－１４４．
［２６］Ｖｌａｄ　Ｆ，Ｔｕｒｋ　Ｂ　Ｅ，Ｐｅｙｎｏｔ　Ｐ，ｅｔ　ａｌ．Ａ　ｖｅｒｓａｔｉｌｅ　ｓｔｒａｔｅｇｙ　ｔｏ　ｄｅ－
ｆｉｎｅ　ｔｈｅ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ　ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ｐｌａｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｋｉｎａｓｅｓ
ａｎｄ　ｓｃｒｅｅｎ　ｆｏｒ　ｐｕｔａｔｉｖｅ　ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｊｏｕｒｎａｌ，２００８，
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