全 文 ：环 境 科 学 学 报
Acta Scientiae Circumstantiae
1
DOI: 10.13671/j.hjkxxb.2016.0174
一株穗花狐尾藻内生菌的分离鉴定及其溶磷特征研究
郭莹 1,2, 秦玉莹 1,2，鞠天琛 3，冷粟 1,2，吴迪 1,2，李明堂 1,2,*1
1.吉林农业大学资源与环境学院，长春 130118
2．吉林省商品粮基地土壤资源可持续利用重点实验室， 长春 130118
3.华中科技大学环境科学与工程学院， 武汉 430074
摘要：通过组织表面消毒、切面培养和共生培养的方法从健康的穗花狐尾藻植株体内分离获得了一株具有
较强溶磷能力的内生菌，系统发育分析和 VITEK 2 系统鉴定结果表明内生菌与沙雷氏菌的亲缘关系最近，
因此命名为 Serratia sp. SP5。纯培养实验表明，菌株 SP5 通过产生酸性物质溶磷，在培养 96h 后溶磷能力
达到最大，溶解性磷酸根的浓度高达 269.60 mg/L，培养液的 pH 值下降至 4.32。氮源通过降低菌株 SP5 的
产酸能力而间接影响了其对磷的释放能力，菌株 SP5 溶磷的氮源优先利用顺序为铵根离子>硝酸根离子>
尿素。适宜菌株 SP5 生长的 pH 值范围为 5-9，酸性条件下菌株的溶磷能力大于碱性条件，而在 pH 值为 7
时与对照相比菌株对磷的相对释放量最大。p 值达到 9 时，菌株无明显溶磷能力。共存高浓度的金属离子
时菌株 SP5 的溶磷效果明显降低，影响程度的大小顺序为 Mn>Fe>Mg。菌株 SP5 溶磷的最佳碳氮比为 35:1，
在相同碳氮比下，不同的碳氮量会明显影响溶磷效果。底泥模拟培养条件下，菌株 SP5 可通过释放底泥中
的闭蓄态磷（O-P）和钙磷（Ca-P）而明显提高水相中的磷酸根离子浓度，与对照相比，底泥中这两种磷
形态分别下降了 15.21%和 34.87%，而水相中溶解性磷酸根离子是对照的 1.5-2 倍。研究结果为利用菌株
SP5 促进水生植物对富营养化水体的修复效果提供理论和实践依据。
关键词：穗花狐尾藻；溶磷菌；沙雷氏菌；内生菌
Isolation and characterization of a strain endophytic bacterium in
Myriophyllum spicatum and its solubilization of phosphate
GUO ying1,2, QIN Yuying1,2, JU Tianchen3 , LENG Su1,2, WU Di1,2, LI Mingtang1,2
1. College of Resource and Environmental Science, Jilin Agricultural University, Changchun 130118
2. Key Laboratory of Soil Resource Sustainable Utilization for Jilin Province Commodity Grain Bases, Changchun 130118
3. School of Environmental Science and Engineering , Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430074
Abstract: One strain of endophytic bacterium with strong ability to dissolve phosphate was isolated from healthy
Myriophyllumby spicatum by the methods of tissue surface disinfection, section culture and co-culture. According
to phylogenetic analysis and VITEK 2 identification system，the endophytic bacterium showed the highest

基金项目：国家自然科学基金(51109089); 吉林省科技发展计划项目(20130206031NY)
Supported by the National Natural Science Foundation of China （No. 51109089） and the Program of Science and Technology
Development Plan of Jilin Province (20130206031NY)
作者简介：郭莹(1991—)，女，在读硕士研究生, E-mail:656561727@qq.com；*通讯作者(责任作者)
Biography：GUO ying(1991—)，Female, postgraduate student, E-mail: 656561727@qq.com；*Corresponding author
网络出版时间：2016-05-13 08:25:52
网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1843.X.20160513.0825.006.html
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similarity with Serratia and was named Serratia sp. SP5．In pure culture system, strain SP5 dissolved phosphate
through producing acidic substance with the highest soluble phosphate anion concentration of 269.60 mg/L and
pH of 4.32 after cultivating 96 h. Types of nitrogen source indirectly affected the solubilization of phosphate
through decreasing the ability of strain SP5 to produce acidic substances. Results showed that strain SP5 dissolved
phosphate based on three types of nitrogen sources in the order of ammonium sulfate > sodium nitrate > urea. The
satisfactory growth of strain SP5 was observed at pH 7-9. Strain SP5 dissolved more phosphate in acidic condition
than in alkaline condition with the strongest relative phosphate dissolution ability at pH 7 and showed no
capability to dissolve phosphate at pH 9. Coexistence of metal ions decreased the solubilization of phosphate by
strain SP5 in the order of Mn > Fe > Mg. The best ratio of C to N for strain SP5 to dissolve phosphate was 35:1.
Under the same ratio of C to N, the amount of carbon and nitrogen significantly affected the phosphate
solubilization. Strain SP5 significantly increased the phosphate concentration in aqueous phase through release
O-P and Ca-P in sediment. Compared with the control, the concentration of O-P and Ca-P in sediment decreased
15.21% and 34.87% in the treatment and the soluble phosphate concentration in treatment was 1.5-2 times of that
in control. Results of the study may supply basic theoretical and practical support for the application of strain SP5
in promoting the bioremediation of eutrophic water body by aquatic plant.
Keywords: Myriophyllum spicatum; phosphate solubilizing bacteria; serratia sp.; endophytic bacteria
1 引言（Introduction）
随着全球气候变暖和农业面源污染的加剧，我国的水体富营养化问题呈现了明显的北移趋势，北方，
尤其是东北地区的一些大型水体的局部水域不仅氮磷等营养盐含量逐年增加，而且还会爆发水华（李永庆
等, 2007; 金志民等, 2009），对水生生态系统平衡和饮用水安全构成了严重的威胁，成为急需解决的水
环境问题之一。富营养化水体修复方法包括物理法、化学法、生物法和联合法（李明堂等, 2012; 吴睿等, 2014;
毛志刚等, 2014），与物理和化学法相比，生物法具有环境扰动小、无二次污染、有利于水生生态系统自
我维持平衡等优点，在富营养化水体治理方面具有广阔的应用前景（王敏等, 2013; 姜义帅等, 2013; 李明
堂等, 2013）。穗花狐尾藻由于具有耐寒、繁殖迅速、适应力强和快速吸收氮磷等优点，在富营养化水体
治理中得到了广泛的应用（袁桂香等, 2013; 潘静赟和李正魁, 2012）。但是由于我国寒区富营养化水体
低温期长，植物生长周期短，再加上水体中悬浮和沉积的磷酸盐大部分以不溶态形式存在（任万平等, 2012；
高湘等, 2015），因此狐尾藻在治理寒区富营养化水体方面存在作用周期短、效果差等缺点。为克服这一
缺点，急需开发一种既可促进水体中不溶态的“死磷”变成可被生物利用的“活”磷酸，又可提高狐尾藻
的适应能力及促进其快速生长的技术。植物内生菌是存在于寄主植物组织中的一类微生物，包括细菌和真
菌，这类微生物不会对寄主植物造成任何损害，相反，还会通过分泌代谢产物来促进植物的生长和提高植
物对不良环境的抵抗力（Andrés et al., 2008; Pereira et al., 2016; Xu et al., 2016）。同时研究还发现，自然界
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中存在许多能将固定态的磷酸盐中的磷酸根离子释放出来的溶磷微生物（或称解磷微生物），这些微生物
可明显提高环境中活性磷酸盐的浓度，促进植物的生长及其对磷的吸收量（卫星等, 2012; 白文娟等, 2014）。
Chen 等（2012）从北京官厅水库的水生植物芦苇、菹草、睡莲和茨藻中分离获得了 36 株具有溶磷作用的
细菌，表明水生植物内生菌中可能蕴藏着在富营养化水体治理方面可发挥多种作用的微生物资源。因此，
本文试图从北方水体中常见的耐低温水生植物穗花狐尾藻中分离出具有较强溶磷能力的内生菌，并通过研
究菌株的溶磷规律和对底泥中不溶性磷的释放特征，为利用该菌株来增强穗花狐尾藻对富营养化水体的修
复效果提供理论依据和技术支持。
2 材料与方法（Materials and methods）
2.1供试样品的采集、培养
从长春北湖国家湿地公园采集外表健康、长势一致的穗花狐尾藻、底泥和水样，当天运回实验室，并
完成预处理和培养。将水样用滤纸过滤后在 121ºC 下灭菌 30min，备用；利用自来水冲洗干净穗花狐尾藻，
然后再用无菌水冲洗 5 遍，最后将穗花狐尾藻放在处理过的水样中培养。选择生长速度快和外表健康的植
株用于内生菌的分离。
底泥样品去掉动植物残体和石块等杂物后在阴凉处自然风干，在风干过程中要经常敲打，防止出现大
的泥块，风干后混匀，取 1 kg 底泥样品研磨后过 20 目筛，一部分用于底泥基本理化性质的分析（鲁如坤,
1999），一部分用于模拟实验。底泥的基本理化性质为：总有机碳为 5. 13%，密度为 2. 21 g·cm-3， pＨ值
为 7.34，总氮和总磷分别为 6.14 和 0.95 g·kg-1。
2.2 培养基
研究中主要用到的培养基为牛肉膏蛋白胨培养基和溶磷培养基。其中溶磷培养基的基本配方如下：葡
萄糖 10 g，Ca3(PO4)2 5 g，(NH4)2SO4 0.5 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，FeSO4·7H2O 0.03 g，
MnSO4·7H2O 0.03 g，pH=7.1，蒸馏水定容至 1000 mL，121℃高压灭菌 20 min。加入 2%的琼脂粉制备成
固体培养基。
2.3 菌株 SP5 的分离和鉴定
2.3.1 植物表面消毒和内生菌分离
将挑选出的穗花狐尾藻放入无菌水中清洗数次，直到无菌水无明显变浑为止，用无菌滤纸将其吸干，
依次用 70%乙醇溶液侵泡 2.5 min、1%次氯酸钠溶液侵泡 1.5 min、0.1%升汞溶液中侵泡 60 s，最后用无菌
水再反复冲洗 5 次并吸干。将植株剪切成 1 cm 左右的小段，一部分纵向切开，将切面贴合在牛肉膏蛋白
胨固体培养基表面上放置，另外一部分直接横放在培养基上，同时取最后一次冲洗液 0.2 mL 涂布于牛肉膏
蛋白胨培养基平板上，将上述制备完的平板置于 25℃恒温培养箱中培养。当冲洗液中无菌，横放的植株小
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段除切面附近其他部位处未长菌，纵切后的小段周围长满菌落时认为分离成功，否则重新分离培养，将三
次重复操作都分离出的菌株认定为穗花狐尾藻内生菌。再将内生菌分别接种至穗花狐尾藻培养体系中培养
15 d，将对穗花狐尾藻无害且促进其生长的内生菌作用目标菌，用于溶磷菌的筛选。将目标菌分别接种至
溶磷培养基中培养 5 d，测定上清液中的溶解性正磷酸盐的含量，将溶磷能力最大的一株菌作为目标菌，
对其进行溶磷规律和释放底泥中磷酸盐的研究。
2.3.2 菌株 SP5 的鉴定
按照《常见细菌系统鉴定手册》进行菌落特征观察、革兰氏染色鉴定和生理生化指标测定（东秀珠等,
2001）。利用法国生物梅里埃公司 VITEK 2 COMPACT 鉴定系统进行快速鉴定。
16S rDNA 序列鉴定：按照陈庆丽等( 2015)的方法进行总 DNA 提取和 16S rRNA 基因扩增，反应体系
为： 10×Ex Taq Buffer 5 µL，dNTP Mixture 5 µL，上游引物 2 µL，下游引物 2 µL，模板 DNA 5 µL，Ex Taq
DNA 聚合酶 1 µL，灭菌 ddH2O 30 µL。PCR 反应程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s；55 ℃ 30 s；72 ℃ 90
s，35 个循环; 72 ℃ 10 min， 4℃保存。PCR 反应结束后，将所得产物全部点样于 1.2 % 的大孔琼脂糖凝
胶上，100 V 恒压下电泳 45 min，紫外凝胶成像系统观察电泳结果，并进行产物的纯化。采用北京百泰克
生物技术有限公司的 PCR 产物回收试剂盒（离心柱型）对琼脂糖凝胶中分离的 PCR 产物进行纯化。纯化
后的样品送至吉林省库美生物科技有限公司进行测序。对最终测得的菌株的 16S rDNA 基因构建系统发育
树以确定其种属在分类系统中的位置。系统发育树构建的具体步骤为：在 NCBI 数据库中通过 BLAST 选
取与测定的基因序列亲缘关系较近的模式菌株的 16S rDNA 基因序列，利用 ClustalX 2.1 multiple alignment
（多序列比对排列）功能将目的基因序列与亲缘序列进行比对（Gibson, 1994）。再用 MEGA 6.0 软件将比
对后的序列用 Neighbor-joining method（邻接法）进行发育树的构建，并通过 Boot-strap（自举分析）进行
置信度检测，自举数据集次数为 1000 (Tamura et al., 2013)。
2.4 纯培养下菌株 SP5 的溶磷特征研究
2.4.1 菌悬液的制备和培养条件
将在-4℃冰箱中保存时间不超过 1 周的菌体细胞接种至牛肉膏蛋白胨液体培养基中，在 25℃活化培养
48 h，在 8000 r·min-1 和 4℃下离心 5 min，去掉上清液后加入无菌水清洗 2 次后，再悬浮于无菌水中，制
备成 OD600 为 0.3 左右的菌悬液，再以 2%的比例接种至培养体系中。培养条件为 25℃和 120 r·min-1，除溶
磷动力学外，其它溶磷实验的采样时间均为培养后的第 4 d。
2.4.2 溶磷动力学
按照 2%的接种量将菌悬液加入到溶磷培养基中培养，在 120 r·min-1 和 25℃下培养，每隔 24 h 采样，
8000 r·min-1 离心 5 min 后，取上清液测定溶解性正磷酸盐和 pH 值。
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2.4.3 因子响应规律研究
根据氮含量相同的原则，分别利用硝酸钠和尿素代替溶磷培养基中的硫酸铵，进行溶磷实验，研究氮
源对菌株溶磷的影响。
利用盐酸和氢氧化钠溶液将牛肉膏蛋白胨液体培养基和溶磷培养基的 pH 值都调至 4-10，接种培养，
48 h 后测定培养液的 OD600；对于溶磷培养基，每种 pH 处理都同时做不接菌的对照，4 d 后测定溶磷培养
液体中的溶解性正磷酸盐浓度，研究 pH 值对菌株生长和溶磷的影响。
在原溶磷培养基的基础上通过只改变碳源或只改变氮源添加量的方式，调节溶磷培养基的碳氮比为
10:1-40:1，进行溶磷实验，分析碳氮比和碳氮量对溶磷的影响。
分别将溶磷培养基中镁、铁、锰离子的浓度提高至 10 倍，进行溶磷实验，研究共存高浓度金属离子
对菌株溶磷的影响。
2.5 菌株 SP5 释放底泥中磷酸盐的模拟研究
称取供试底泥样品 20 g 加入到三角瓶中，然后加入稀释 10 倍的菌悬液 20 mL，同时做无菌水对照。
每个处理重复 3 次，在 25℃和 120 r·min-1，摇床培养第 10 d 时，取部分样品测定水相中的磷酸盐，第 11 d
时向剩余的三角瓶中各补充 10 mL 无菌水，培养 20 d 后将培养物尽量倒出，在 8000 r·min-1 下离心 5 min，
分别收集上清液和底泥，。测定上清液中的溶解性正磷酸盐浓度。将底泥样品在阴凉处风干后研磨过 20 目
筛，按照磷的分级测定方法(鲍士旦, 1999）测定出铝结合的磷酸盐（Al-P）、铁结合的磷酸盐(Fe-P)、闭蓄
态磷酸盐(O-P)、钙结合的磷酸盐(Ca-P)的含量，研究分析菌株对底泥中磷酸盐的释放特征。
2.6 分析测定方法
通过测定培养液在 600nm 处的吸光度来表征菌体细胞的生长量。将培养体系在 8000 r·min-1下离心 5
min 后，用钼锑抗比色法测定上清液中溶解性正磷酸盐浓度。
利用底泥中磷的连续提取方法，分别逐一提取待测底泥中不同形态的磷，用钼锑抗比色法测定各种形
态磷含量（鲁如坤, 1999）。
2.7 数据分析
文中的所有实验数据利用 SPSS20.0 和 Excel 软件进行处理，对有关数据进行了显著性分析。
3 结果(Results)
3.1 穗花狐尾藻内生溶磷菌的分离和鉴定
3.1.1 穗花狐尾藻内生溶磷菌的分离
5
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1 SP5 P<0.01
5 d 262.45 mg·L-1 SP5






图 1 5 株穗花狐尾藻内生菌对磷酸钙的溶解作用
Fig.1 Solubilization of Ca3(PO4)2 by five strains of endophtic bacteria from Myriophyllum spicatum
3.1.2 菌株 SP5 的鉴定
SP5 牛肉膏蛋白胨 25℃ 24 h
菌落（见图 2a）。光学显微镜观察发现，菌体细胞呈短杆状、无芽孢、无荚膜、革兰阴性（见图
2b）。VITEK 2 COMPACT GN 鉴定卡的鉴定结果表明菌株 SP5 与居泉沙雷氏菌的相似度为 99%（见表 1）。
将菌株 JM1 的 16S rRNA 基因序列提交 GenBank，Blast 结果表明其与沙雷氏菌属中的 5 种菌均有 98%的
同源性。测序后的序列通过 MEGA6.0 软件用 Neighbor-joining method（邻接法）生成了系统发育树状图（图
3）。从该系统发育树可知，SP5 菌株属于肠杆菌科中的沙雷氏菌属（Serratia sp.），且与 Serratia glossinae
处于同一分支，亲缘关系较近。根据 16S rRNA 同源性比较，结合菌株的形态学观察和生理学特征，可基
本将分离的 SP5 菌株归属为沙雷氏菌属，命名为 Serratia sp. SP5。






图2 菌株SP5纯化和革兰氏染色
Fig. 2 The purified and gram staining of strain SP5
0
50
100
150
200
250
300
CK SP1 SP2 SP3 SP4 SP5
内生菌
溶
解
性
正
磷
酸
盐
的
浓
度
/
（
mg
·
L-
1
）
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图3 基于16S rRNA 基因序列构建的系统发育树
Fig. 3 Phylogenetic tree based on the sequence of 16S rRNA
表 1 菌株 SP5 的 VITEK 2 GN 鉴定结果
Table 1 Identification result of strain SP5 by VITEK 2
编
号
项目 反
应
编号 项目 反
应
编
号
项目 反
应
编号 项目 反
应
编
号
项目 反
应
编
号
项目 反
应
2 APPA - 3 ADO + 4 PyrA + 5 IARL + 7 dCEL - 9 BGAL +
10 H2S - 11 BNAG + 12 AGLTp - 13 dGLU + 14 GGT - 15 OFF +
17 BGLU + 18 dMAL - 19 dMAN + 20 dMNE + 21 BXYL - 22 BAIap -
23 ProA + 26 LIP - 27 PLE + 29 TyrA - 31 URE - 32 dSOR +
33 SAC - 34 dTAG + 35 dTRE + 36 CIT - 37 MNT + 39 5KG -
40 ILATK - 41 AGLU - 42 SUCT - 43 NAGA - 44 AGAL - 45 PHOS -
46 GIyA - 47 ODC + 48 LDC + 53 IHISa - 56 CMT + 57 BGUR -
58 O129R + 59 GGAA - 61 IMLTa - 62 ELLM + 64 ILATa -
3.2菌株 SP5的溶磷动力学
将菌株 SP5 接种至溶磷培养基中培养，每隔 24 h 采样分析，结果如图 4 所示。从图 4 中可以看出菌株
SP5 进入培养体系后分别在 24 h、72 h、96 h 进入快速生长期、对数生长期和稳定期。图 4b 表明菌株 SP5
在溶磷过程中会降低培养液的 pH 值，培养液的最低 pH 值可达到 4.32，从图中还可以看出培养液中磷酸
根离子和培养液的 pH 值变化特征一致，表明菌株 SP5 主要通过产生酸性物质促进磷酸根的释放。
Serratia glossinae strain C1 |NR 116808.1
SP5
Serratia liquefaciens strain ATCC 27592 |NR 121703.1
Serratia symbiotica strain CWBI-2.3 |NR 117512.1
Rahnella aquatilis HX2 strain HX2 |NR 074921.1
Pectobacterium carotovorum subsp PC1 |NR 102825.1
Pantoea agglomerans strain ATCC 27155 |NR 114505.1
Lonsdalea quercina strain LMG 2724 |NR 114706.1
gi|645321365|ref|NR 118348.1| Lonsdalea quercina subsp. populi strain NY060 |NR 118348.1
Xenorhabdus beddingii strain DSM 4764 |NR 042822.1
Pantoea cypripedii strain LMG 2657 |NR 119369.1
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图 4 菌株 SP5 溶磷过程中培养液中磷酸根离子及其 pH 值随时间的变化
Fig.4 Change in phosphate concentration and pH of culture liquid with time during the solubilization of Ca3(PO4)2 by strain SP5
3.3 氮源对菌株溶磷及产酸的影响
分别利用三种氮源研究了菌株的溶磷和产酸能力，结果如图 5 所示。从图中可以看出菌株 SP5 在三种
氮源中对磷酸钙均具有不同程度的溶解作用，但菌株 SP5 优先利用铵根离子溶磷，其次为硝酸根离子，而
尿素则不利于菌株溶磷能力的发挥。从图 5 中可以看出，与对照相比，菌株 SP5 利用铵根离子产酸能力最
强（P<0.01），以硝酸根为氮源时产酸能力明显下降（P<0.05），而利用尿素时则产碱性物质。这表明菌
株 SP5 的溶磷能力可受到氮源种类的影响，酸性物质是其溶磷的主要物质，但除此之外，菌株 SP5 还会产
生其他溶磷能力低的物质，具体机理有待于进一步研究。







图 5 氮源对菌株 SP5 释放磷酸根的量及培养液 pH 值的影响
Fig.5 Effect of nitrogen source on phosphate concentration and pH of culture liquid during the solubilization of Ca3(PO4)2 by strain
SP5
3.4 pH值对菌株 SP5生长及溶磷能力的影响
分别利用将牛肉膏蛋白胨液体培养基和溶磷培养基研究了 pH 值对菌株生长和溶磷能力的影响，结果
如图 6 所示。从图 6 看出适宜菌株生长的 pH 值范围为 5-9，表明菌株对 pH 值的适应能力强。从图 6 中还
0
50
100
150
200
250
300
0 24 48 72 96 120
时间/h
溶
解
性
正
磷
酸
盐
的
浓
度
/（
mg
·
L-
1
）
2
4
6
8
0 24 48 72 96 120
时间/h
pH
0
50
100
150
200
250
300
CK SP5
处理
溶
解
性
正
磷
酸
盐
的
浓
度
/
（
mg
·
L-
1
）
葡萄糖+硫酸铵
葡萄糖+硝酸钠
葡萄糖+尿素
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
CK SP5处理
pH
葡萄糖+硫酸铵
葡萄糖+硝酸钠
葡萄糖+尿素
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可以看出，pH 值为 7 时，与对照相比，菌株 SP5 对磷酸根离子的相对释放量最大，是对照的 16 倍，在酸
性条件下（pH 值为 5 和 6）菌株仍然保持着溶磷能力，但在碱性条件下菌株的溶磷能力明显下降，当 pH
值为 9 时，菌株溶磷能力受到明显的抑制（P<0.01）。

图 6 初始 pH 对菌株 SP5 生长及溶磷的影响
Fig.6 Effect of initial pH on growth of strain SP5 and its abilitiy to solubilize Ca3(PO4)2
3.5金属离子对菌株 SP5溶磷能力的影响
为了研究高含量金属离子对内生溶磷菌 SP5 溶磷效果的影响，在无机磷基础培养基其他成分含量不变
的情况下，分别将 Mg、Fe、Mn 三种金属离子的浓度提高至原来的 10 倍，再利用相应的培养基进行溶磷
实验。从图 7 中可以看出共存高浓度的金属离子时，菌株释放出的磷酸根离子净含量明显降低（P<0.05）。
与原培养基相比，高含量的 Mg、Mn、Fe 离子分别使得培养液中溶解性磷酸根离子的浓度下降了 42.8、
143.82、113.25 mg/L，说明菌株的溶磷能力对 Mn 最敏感，对 Mg 有一定的抗性。







图 7 金属离子对菌株 SP5 溶磷的影响
Fig.7 Effect of metal ions on Ca3(PO4)2 solubiliztion by strain SP5


0
0.3
0.6
0.9
1.2
1.5
1.8
2.1
4 5 6 7 8 9 10
pH值
O
D
6
0
0
0
50
100
150
200
250
300
350
5 6 7 8 9
pH值
溶
解
性
正
磷
酸
盐
的
浓
度
/
（
mg
·
L-
1
）
CK SP5
0
50
100
150
200
250
300
CK Mg Mn Fe
不同重金属处理
溶
解
性
正
磷
酸
盐
的
浓
度
/
（
mg
·
L-
1
）
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3.6碳氮比对菌株溶磷的影响
培养基的碳氮比不仅影响着菌株的生长还可影响其生理代谢过程，从而影响溶磷物质的产生，因此本
文研究了在 NBRIP 培养基的基础上单独改变氮源或碳源时不同碳氮比对菌株 SP5 溶磷的影响，结果如图 8
所示。从图中可以看出碳氮比及碳氮量都对菌株 SP5 的溶磷效果产生影响，总的来说碳氮比为 35:1 时碳氮
量对溶磷效果没有影响；碳量不变时，随着氮含量的降低，溶磷能力随着碳氮比的增加而逐渐增加，但增
加至 35:1 时不再继续增加；氮量不变时碳氮比在 25:1-35:1 时保持最佳的溶磷效果，但碳氮比增加或降低
都会减少磷酸根离子的释放量。
0
50
100
150
200
250
300
350
10:1 20:1 25:1 30:1 35:1 40:1
碳氮比
溶
解
性
正
磷
酸
盐
的
浓
度
/（
mg
·
L-
1
）
氮不变 碳不变

图 8 碳氮比对菌株 SP5 溶磷的影响
Fig.8 Effect of C/N on Ca3(PO4)2 solubiliztion by strain SP5
3.7 菌株 SP5 对底泥中磷酸盐的释放
为了研究菌株 SP5 对底泥中磷的释放作用，分别在模拟培养的第 10 d 与第 20 d 采样测得上覆水中正
磷酸盐浓度，结果如图 9 所示，表明菌株 SP5 对底泥中磷酸根离子的释放具有明显的促进作用，上覆水中
磷酸盐的浓度在培养后的 10 d 和 20 d 分别是对照组的 2 倍和 1.5 倍，培养 20 d 后底泥中 Al-P、Fe-P 的含
量与对照组相比无明显降低，而闭蓄态磷（O-P）和 Ca-P 分别比对照组降低了 15.21%和 34.87%。以上结
果表明菌株 SP5 可通过释放底泥中的 Ca-P 来增加活性磷的含量，可为植物吸收提供更多的可利用性磷，
从而加速底泥中磷的去除。





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图 9 菌株 SP5 对底泥中不同形态磷的释放及对上覆水中磷酸根离子浓度的影响
Fig.9 Release of phosphate in differernt forms in sediment by strain SP5 and its effect on the phosphate concentration in water.

4 讨论(Discussion)
植物内生菌是一类寄生于健康植物的组织和器官内的真菌、细菌或放线菌，可通过固氮、溶解营养物
质、与致病菌进行空间和营养竞争以及产生水解酶、抗生素和其他活性代谢产物等过程增强植物对恶劣环
境和致病菌的抵抗力以及特殊功能的发挥，因此在农业、环境保护、药物开发等领域被广泛应用(曹凯等,
2015; 王晓洋等, 2015; 王志伟等, 2014 )。目前对于植物内生菌的研究主要是集中在陆生植物，而对于水生
植物内生菌的理论和应用研究相对较少。目前学者们主要从水葫芦内分离出了 32 个属 56 株内生细菌（蓝
江林等, 2008 ），从北京官厅水库的水生植物芦苇、菹草、睡莲和茨藻中分离获得了 12 个属 100 株的细菌，
其中具有溶磷作用的菌株 36 株，同时还有多株细菌具有降解萘和农药的能力（Chen 等, 2012 ），从穗花狐
尾藻内分离获得了一株可降解双酚 A 的内生菌为类芽孢杆菌属菌株（王乐乐等, 2015 ）。狐尾藻是北方水
体中常见的一种耐污、耐低温植物，在富营养化水体修复方面具有重要的应用价值。但由于水体中的磷大
部分以不溶态的形式存在于底泥或悬浮物中，并且我国北方，尤其是东北地区低温期长，植物作用时间短，
因此在富营养化水体修复方面效果较差。鉴于此，本文试图获得一株具有溶磷作用的内生菌，进而利用该
菌促进穗花狐尾藻生长的同时还可以将水体中的不溶性磷活化出来，增强植物的吸收量，从而提高寒区富
营养化水体植物修复效率。结果本文通过组织表面消毒、内生菌分离、共生培养等步骤从寒区水体中健康
的穗花狐尾藻植株内分离获得了 5 株内生菌，其中菌株 SP5 具有较强的溶磷能力。16S rRNA 序列比对表
明，菌株 SP5 属于肠杆菌科中的沙雷氏菌属（Serratia sp.），且与 Serratia glossinae 处于同一分支，亲缘关
系较近。于婷等人从大豆土壤中分离获得了一株具有溶磷作用的沙雷氏菌，这表明环境中沙雷氏菌在溶磷
方面可能具有一定的优势，另外研究表明沙雷氏菌对植物病害还具有生防作用（钱兰娟等, 2011）。菌株 SP5
主要通过产酸溶磷，这和大部分溶磷菌的释磷机理一致。氮源对微生物的溶磷作用具有不同的影响，菌株
SP5 溶磷的优先利用氮源为硫酸铵，而有的微生物则以硝酸根为优选氮源（赵小蓉等, 2002）。适宜菌株 SP5
生长的 pH 范围为 5-9，而最佳溶磷效果则出现在初始 pH 值为 7，在酸性环境中的溶磷效果好于碱性环境，
表明环境中 pH 的变化将会影响到菌株的溶磷效果，其在酸性环境中的额应用效果会更好。共存较高的金
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
无菌水 菌株SP5
处理
溶
解
性
正
磷
酸
盐
的
浓
度
/
（
mg
·
L-
1
）
10d
20d
0%
10%
20%
30%
40%
Al-P Fe-P O-P Ca-P
不同形态的磷
不
同
形
态
磷
含
量
的
降
低
比
例
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属离子时，菌株 SP5 的溶磷能力都收到明显的影响，其中 Mg 离子的影响最小，而 Mn 离子的影响最大，
这可能是金属离子与磷酸根形成沉淀或者代谢产物与重金属螯合而减少了对 Ca 的螯合，进而降低了磷酸
根的释放（钟传青和黄为一，2004；Hameeda et al., 2008）。培养液中碳氮比和碳氮量对溶磷影响很大，总
的说来碳氮比为 35:1 时溶磷效果做好，大的碳氮比有利于菌株溶磷能力的发挥。研究表明碳氮比对微生物
的生理生化过程及代谢产物会产生明显的影响（易艳梅和黄为一，2008），因此进一步说明环境条件对菌
株溶磷效果的发挥会产生重要影响，实际应用中必要时可以通过人工干预来增强菌株SP5溶磷功能的发挥。
在灭菌底泥模拟应用中发现，菌株 sP5 对底泥中磷酸根离子的释放产生了非常明显的积极效果，主要是释
放了底泥中 O-P 和 Ca-P 态的磷，而释放出的磷则可以迁移，并且可以进入上覆水中，这表明菌株 SP5 在
增强寒区富营养化水体植物修复效果方面可发挥积极作用，具有明显的应用价值。
5 结论（Conclusions）
（1）从寒区富营养化水体中的健康穗花狐尾藻植株内分离获得了一株具有溶磷作用的内生菌 SP5，16S
rRNA 序列鉴定结果表明该菌为沙雷氏菌属。
（2）菌株 SP5 主要通过产生酸性物质来溶解磷酸钙，溶磷和生长的最佳氮源为硫酸铵， 最佳碳氮比
为 35:1。菌株适宜生长的 pH 值范围较大，但 pH 为 7 时菌株 SP5 对磷酸根离子的相对释放量最大。共存
高浓度重金属离子时菌株释放的磷酸根会减少，影响程度大小的顺序为 Mn > Fe > Mg。
（3）菌株 SP5 对底泥中的 O-P 和 Ca-P 有较强的溶解释放能力，从而增加液相中磷酸根离子的浓度，
因此菌株 SP5 在增强穗花狐尾藻修复富营养化水体方面具有较大的应用潜力。
责任作者简介：李明堂（1976－），副教授。目前主要从事环境污染控制与修复方面的研究。E-mail：
limtdoc2008@163.com。
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