全 文 ：网络出版时间:2011 －7 －22 16:53 网络出版地址:http:/ /www． cnki． net /kcms /detail /34． 1086． R． 20110722． 1653． 201108． 1051_005． html
◇论 著◇
穿孔膜片钳方法记录 L型钙通道及脱氢紫堇碱对其影响的研究
孟红旭，王 宝，刘建勋
(中国中医科学院西苑医院实验研究中心，北京 100091)
收稿日期:2011 － 04 － 08，修回日期:2011 － 05 － 10
基金项目:国家重大新药创新项目(No 2009ZX09301-005) ;国家自然
科学基金重点项目(No 30830118)
作者简介:孟红旭(1972 －) ，男，博士，助理研究员，研究方向:中药
药理学，Tel:010-62835635，E-mail:amfd003@ 163． com;
刘建勋(1955 －) ，男，博士，研究员，博士生导师，研究方
向:中药药理学，通讯作者，Tel:010-62835601，E-mail:liu-
jx0324@ sina． com
doi:10． 3969 / j． issn． 1001 － 1978． 2011． 08． 005
文献标识码:A 文章编号:1001 － 1978(2011)08 － 1051 － 04
中国图书分类号:R-332;R284． 1;R322． 11;R329． 24;
R542. 202. 3
摘要:目的 比较全细胞膜片钳和穿孔膜片钳方法记录大鼠
心室肌细胞 L型钙通道电流随时间经过的变化差异，并观察
脱氢紫堇碱对 L型钙通道的影响。方法 采用全细胞膜片
钳和穿孔膜片钳方法记录急性分离的大鼠心室肌细胞 L 型
钙通道电流。结果 采用全细胞膜片钳法记录到的 L 型钙
通道电流峰值在 15 min内衰减了(34 ± 23)%(n = 10) ，采用
穿孔膜片钳方法记录到的 L型钙通道电流峰值 15 min 内仅
衰减了(2. 7 ± 3. 4)%(n = 9) ;采用穿孔膜片钳方法能够记
录到人参皂苷 Re(100 μmol·L －1)的抑制效应，而采用全细
胞膜片钳方法产生的电流衰减几乎完全掩盖了人参皂苷 Re
的效应。脱氢紫堇碱(10，100 μmol·L －1)能够抑制 L 型钙
通道的电流峰值，抑制率分别为(9 ± 7. 5)%(n = 5) ; (28. 6
± 8. 5)%(n = 5)。结论 穿孔膜片钳方法较全细胞膜片钳
方法在对 L型钙通道电流记录方面更具稳定性和准确性，脱
氢紫堇碱能够浓度依赖性的抑制 L型钙通道。
关键词:穿孔膜片钳;全细胞膜片钳;心室肌细胞;L 型钙通
道;电流衰减;脱氢紫堇碱
在采用全细胞膜片钳技术对 L 型钙通道电流
记录时，L型钙通道电流会发生随时间的经过而逐
渐减小的“rundown”现象，对观察药物对 L 型钙通
道效应造成很大影响。而穿孔的膜片钳方法的使用
减少了“rundown”现象的发生。此文比较了全细胞
膜片钳和穿孔膜片钳方法记录 L 型钙通道电流随
时间经过的变化差异，并观察了脱氢紫堇碱(de-
hydrocorydaline，DHC)对 L型钙通道的影响。
1 材料与方法
1． 1 心室肌细胞的分离 采用急性酶分法获得单
个心室肌细胞［1］。
1． 2 膜片钳技术 通过电极拉制仪(PULL-100，美
国)拉制电极，选择杆状、表面光滑、纹理清晰的心
肌细胞，利用三维操纵器移动电极贴近目标细胞，并
轻压在细胞表面，稍加负压即可形成 1 GΩ 水平以
上的高阻抗封接，再用较大负压吸破细胞膜，形成
普通的全细胞记录形式。穿孔膜片钳技术需要在电
极内液中充入两性霉素 B(0. 2 ～ 0. 3 g·L －1，Sig-
ma) ，移动电极贴近目标细胞，并轻压在细胞表面，
稍加负压，几分钟内可见系统阻抗逐渐降低，至 100
MΩ左右形成稳定穿孔。实验过程由刺激采集软件
Pulse控制，经膜片钳放大器 (EPC10，德国) ，通过
模数转换采集数据，存放于计算机硬盘。
1． 3 L-型钙通道电流记录方法 将细胞钳制在
－ 40 mV 使钠通道和 T型钙通道失活，电极内液用
CsCl 代替 KCl 阻断 K +电流外流。给予从 － 40mV
至 0mV持续 250 ms 的除极电压，可以得到迅速活
化缓慢失活的内向电流，能够被盐酸地尔硫卓(10
μmol·L －1)阻断［2］，确定为 L型钙通道电流。根据
实验情况分别采用全细胞膜片钳和穿孔膜片钳方法
每隔 10、15、30 s 给予上述除极电压连续记录 15
min以上。L型钙电流峰值幅度取电流活化峰值点
与失活后电流轨迹的垂直距离。
1． 4 药物和配制液体
1． 4． 1 药物 人参皂苷 Re 由中国药品生物制品
检定所购置，批号:1107054-200421;脱氢紫堇碱由
中国中医科学院西苑医院实验中心提供;配液所需
药品由英国 Alfa Aesar公司购置。
1． 4． 2 配制液体(mmol·L －1) 无钙台式液:NaCl
140，KCl 5. 4，NaH2PO4 0. 33，MgCl2 1，Glucose 10，
Hepes 10 (pH 7. 4 NaOH) ;KB 液:KOH 70，KCl
40，KH2PO4 20，Glutamic acid 50，MgCl2 3，Taurine
20，EGTA 0. 5，Hepes 10，Glucose 10 (pH 7. 4
KOH) ;细胞外液:台式液(无钙台式液 + CaCl2
1. 8) ;电极内液:CsCl 140，MgCl2 2，CaCl2 1，EGTA
11，MgATP 5，Hepes 10 (pH 7. 2 CsOH)
1． 5 数据处理 所有数据采用同一细胞给药前后
·1501·中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2011 Aug;27(8) :1051 ～ 4
比较，用 珋x ± s表示 。所获数据采用组间 t检验。
2 结果
2． 1 采用全细胞膜片钳和穿孔膜片钳方法记录 L
－型钙通道电流随时间经过的比较 普通的全细胞
膜片钳方法记录的 L 型钙通道电流“rundown”现象
非常明显，电流峰值随时间经过出现明显衰减，15
min内衰减幅度能达到初始值的(34 ± 23)%(n =
10)。Fig 1A、C显示了一例采用普通的全细胞膜片
钳方法每隔 10 s 给予除极刺激电压连续记录 15
min L型钙通道电流随时间经过的变化情况:C图显
示 15 min内电流峰值幅度随时间经过逐渐衰减，a，
b，c，d分别是 1、6、11、15 min时间点的电流峰值，而
对应这些时间点的电流轨迹则在 A 图显示。这例
细胞的电流峰值在 15 min 时衰减了 30%。Fig 1B、
D显示了一例采用穿孔膜片钳方法的记录:这例细
胞的电流峰值在15 min时几乎没有衰减，a，b，c，d分
别显示 1、6、11、15 min 时间点的电流轨迹和峰值。
采用穿孔全细胞膜片钳方法对 10 个细胞的观察发
现:电流峰值在 15 min 内的衰减幅度为(2. 7 ±
3. 4)%，甚至一些细胞的电流峰值还略有升高。获
得两组数据经组间 t 检验 P ＜ 0. 01，差异有显著性。
同时我们发现穿孔膜片钳方法记录到的 L 型钙通
道电流的失活速度明显快于普通全细胞的记录。
2． 2 采用全细胞膜片钳和穿孔膜片钳方法观察人
参皂苷 Re对 L型钙通道电流的抑制效应 人参皂
苷 Re 是人参的一种有效成分，有报道其对豚鼠心
室肌细胞 L型钙通道电有抑制作用［3］，本研究使用
它来观察全细胞膜片钳和穿孔膜片钳方法在记录药
物抑制效应中的差异。Fig 2A、C显示一例采用普通
全细胞膜片钳方法连续记录给予人参皂苷 Re(100
μmol·L －1)后 L 型钙通道电流随时间经过的变化
情况:A图为电流轨迹的变化，C 图为电流峰值幅度
的改变。a，b，c 分别显示给药前、给药中、洗脱后 3
种状态。由于给药前后电流峰值抑制处于衰减状
态，无法判断人参皂苷 Re 是否具有抑制效应。在
记录的其他 5 个细胞中都出现与图例相同的情况。
而采用穿孔全细胞膜片钳方法记录的 5 个细胞中，
给予人参皂苷 Re 后电流峰值逐渐被消减，药物洗
脱后被消减的峰值逐渐恢复，经过统计人参皂苷 Re
(100 μmol·L －1)对 L 型钙通道电流的抑制率为
(77. 4 ± 6. 68)%。Fig 2B、D 是一例采用穿孔全细
胞膜片钳方法连续记录的给予人参皂苷 Re 前后通
道电流的变化状况。a、b、c 分别是给药前、给药中、
洗脱后电流的电流峰值和电流轨迹。
2． 3 采用穿孔膜片钳方法观察脱氢紫堇碱对 L 型
钙通道的影响 脱氢紫堇碱是中药元胡的一种有效
成分，具有抗心肌缺血作用。我们采用穿孔膜片钳
方法记录了脱氢紫堇碱(10，100 μmol·L －1)对 L
型钙通道电流峰值的影响。Fig 3 显示一例给与脱
氢紫堇碱前后通道电流随时间经过的变化状况，低
浓度药物能够轻微消减电流峰值，高浓度的药物对
电流峰值的消减非常明显，药物洗脱后电流几乎完
全恢复。a，b，c 分别显示了是给药前、给药中电流
峰值和电流轨迹。脱氢紫堇碱(10，100 μmol·
L －1)对其他细胞也表现出抑制效应，对 L-型钙通道
I电流峰值的抑制率分别为(9 ± 7. 5)%(n = 5)和
(28. 6 ± 8. 5)%(n = 5) ，两组数据经组间 t检验 P ＜
0. 01，差异有显著性，显示这种抑制效应具有浓度依
赖性。
Fig 1 Changes of L-type calcium channel currents curve(over)
and current peak(under)over time through recorded by whole
cell patch clamp(A，C)and perforated patch clamp method(B，D)
a:1 min;b:6 min;c:11 min;d:15 min
·2501· 中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2011 Aug;27(8)
3 讨论
由于 L钙通道开闭受细胞内磷酸化的调节明
显，因此采用全细胞方法记录“rundown”现象比较
明显。本研究结果显示这种电流衰减对药物作用的
观察产生很大影响。采用穿孔的膜片钳技术能够将
钙电流衰减率从 30%减少到 10%以内，并能够稳定
记录对中药有效成分人参皂苷 Re 抑制效应，表明
穿孔膜片钳方法在记录 L 型钙通道电流记录方面
具稳定性和准确性，较全细胞膜片钳方法更适合对
药物作用进行观察。一些具有抗心肌缺血的中药有
效成分具有钙通道抑制剂的作用［4 － 6］，这些有效成
Fig 2 Effect of ginsenoside Re on L-type calcium channel
currents recorded by whole cell patch clamp(A，C)and
perforated patch clamp method (B，D)
a:Control;b:Ginsenoside Re 100 μmol·L －1;c:Washout．
Fig 3 Effect of Dehydrocorydaline(DHC 10，100 μmol·L －1)
on L-type calcium channel currents recorded
by perforated patch clamp method
a:Control;b:DHC 10 μmol·L －1;c:DHC 100 μmol·L －1
分对钙通道作用途径似乎与临床常用的钙拮抗剂直
接作用于钙通道蛋白不同，而是通过一些细胞转导
途径发挥抑制效应［1，7］。穿孔膜片钳技术是在保持
心肌细胞内容物保持相对稳定的条件下实施，因此
更适合研究中药有效成分对钙通道的影响。
中药元胡中一种生物碱脱氢紫堇碱具有抗心肌
细胞缺氧 /复氧损伤的作用，并且在正常氧和低氧条
件下能够阻止心肌细胞内钙超载［8 － 9］，本研究结果
显示脱氢紫堇碱能够浓度依赖性的抑制 L 型钙通
道提示脱氢紫堇碱抗心肌缺血作用的机制可能是通
过抑制 L 型钙通道的开放减少钙内流而抑制钙超
载，减轻心肌缺氧 /复氧损伤。
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Recording L-type calcium channel current by perforated patch clamp and
effect of dehydrocorydaline on L-type calcium channel
MENG Hong-xu，WANG Bao，LIU Jian-xun
(Research and Development Center，Xiyuan Hospital，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100091，China)
Abstract:Aim To observe the difference of recording
L-type calcium channel currents over time through by
whole cell patch clamp and perforated patch clamp
method and the effect of dehydrocorydaline on L-type
calcium channel by perforated patch clamp method．
Methods Whole cell patch clamp and perforated
patch clamp were used to record L-type calcium chan-
nel current in acutely isolated rat ventricular myocytes．
Results The L-type calcium channel current peak re-
corded by whole cell patch clamp decayed of the (34 ±
23)% (n = 10)within 15 minutes，while using perfo-
rated patch clamp，L-type calcium channel current
peak attenuated (2. 7 ± 3. 4)% (n = 9)within 15 mi-
nutes;The inhibitory effect of ginsenoside Re(100
μmol·L －1)could be clearly recorded by perforated
patch clamp method，while the current decaying pro-
duced by whole cell patch clamp almost completely o-
vershadowed the effects of ginsenoside Re． Dehydroc-
orydaline (10，100 μmol·L －1)could inhibit L-type
calcium channel current peak and the inhibitory rates
were (9 ± 7. 5)%(n = 5)and (28. 6 ± 8. 5)%(n = 5)
individually． Conclusions Perforated patch clamp
method has more stability and accuracy than ordinary
whole-cell patch clamp technique in recording L-type
calcium channel current;dehydrocorydaline can sup-
press L-type calcium channel in a concentration-de-
pendent manner．
Key words:perforated patch clamp;whole cell patch
clamp;ventricular myocytes ;L-type calcium channel ;
current decaying ;dehydrocorydaline
·4501· 中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2011 Aug;27(8)