全 文 ：加味五子衍宗方总黄酮对大鼠海马锥体细胞
ＶＧＣＣ通道的影响
李娌１，蔡浩然２，李琳２，王学美
（１北京大学 第一医院 中西医结合研究室，北京 １０００３４；
２北京大学 第一医院 中心实验室，北京 １０００３４）
［摘要］　目的：探讨加味五子衍宗方总黄酮成分对Ａβ２５３５作用后的大鼠海马ＣＡ１区锥体神经元电压门控钙通道电流的
作用。方法：应用全细胞膜片钳技术记录海马神经元ＩＣａ电流，采用内向电流的幅度作为观察指标，观察模型药物及干预药物
对其的作用。采用出生７ｄ的乳鼠取海马后制成脑片，选取立体感强、状态好的锥体细胞形成全细胞膜片钳记录，从５０ｍＶ
到＋５０ｍＶ范围（步进为５ｍＶ）一系列去极化电压脉冲刺激（脉冲宽度５００ｍｓ），以激发出电压依赖性的内向钙离子电流。记
录电流后加入Ａβ２５３５后，再加入总黄酮进行干预。结果：Ａβ２５３５淀粉蛋白可以通过增强ＩＣａ可引起胞内钙超载，正常幅度平均为
－（１５７１±１９９）ｐＡ，Ａβ２５３５作用后增大为 －（３２３２±２３４）ｐＡ，１２５，２５０，５００ｍｇ·Ｌ
－１的总黄酮作用之后，分别下降为
－（２５７９±３１６），－（１９６４±２９８），－（１６９３±３４０）ｐＡ。结论：引起胞内钙离子超载可能是Ａβ２５３５产生神经毒性作用的机
制之一，加味五子衍宗方总黄酮成分可通过抑制钙离子内流对神经元起一定保护作用。
［关键词］　β淀粉样蛋白；锥体细胞；全细胞膜片钳记录；五子衍宗方；电压依赖钙通道
［收稿日期］　２００８１０２０
［通信作者］　王学美，Ｔｅｌ：（０１０）８３５７３０５３，Ｅｍａｉｌ：ｗａｎｇｘｕｅｍｅｉｂｊ
ｍｕ＠１６３．ｃｏｍ
　　加味五子衍宗方是在补肾填精的古方五子衍宗
丸基础上加味而成的经验方。主要由枸杞子、菟丝
子、五味子、车前子、覆盆子以及淫羊藿等药组成。
近年来，对于轻度认知障碍（ｍｉｌｄｃｏｇｎｉｔｉｖｅｉｍｐａｉｒ
ｍｅｎｔ，ＭＣＩ）患者的临床研究表明，加味方可以提高
其记忆商，降低患者血清β淀粉样蛋白含量［１２］。轻
度认知障碍 ＭＣＩ代表 Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ病（ＡＤ）的极早期
阶段。ＡＤ的病理学特征为老年斑和神经元纤维缠
绕，而脑脊液Ｔａｕ蛋白和β淀粉样蛋白（Ａβ）水平的
异常被认为是这一病理改变的分子学基础。大多数
实验证明Ａβ的毒性作用与其影响电压依赖性钙通
道（ｖｏｌｔａｇｅｄｅｐｅｎｄｅｎｔｃａｌｃｉｕｍｃｈａｎｎｅｌｓ，ＶＤＣＣ）尤其
是高电压激活的钙通道（ｈｉｇｈｖｏｌｔａｇｅａｃｔｉｖａｔｅｄｃａｌｃｉ
ｕｍｃｈａｎｎｅｌｓ，ＨＶＡ），进而导致细胞内钙离子
（［Ｃａ２＋］ｉ）超载有关
［３］。本研究进一步了解加味五
子衍宗方对ＡＤ患者记忆改善的机制。
１　材料
１．１　动物
ＳＰＦ级ＳＤ大鼠，雌雄不拘，出生７～１０ｄ，由北
京大学医学部实验动物中心提供，动物合格证号
ＳＣＸＫ（京）２００６０００８。
１．２　药物
１．２．１　加味五子衍宗方　枸杞子 ４００ｇ，菟丝子
４００ｇ，五味子５０ｇ，车前子１００ｇ，覆盆子２００ｇ，淫羊
藿４００ｇ，以上药材购自同仁堂药店，由北京大学药
学院 屠鹏飞教授鉴定为正品。
１．２．２　加味五子衍宗方总黄酮和总多糖的制备　
采用醇提水沉法。药材使用９５％乙醇提取３遍，浓
缩成膏，石油醚萃取，６０℃减压蒸馏；离心除杂，大
孔树脂柱分离，梯度洗脱、干燥。薄层色谱鉴定，发
现黄酮类化合物主要集中在５０％和７０％质量浓度
乙醇的流份中。５０％乙醇中的黄酮得率为０２５％。
总多糖制备：提黄酮所剩药渣晾干，１０倍体积水提
取３遍，每遍１５ｈ，减压浓缩（≤６０℃），水提液合
并浓缩，Ｓａｖａｇｅ法去蛋白，低温干燥。得率３７％。
１．２．３　ＴＴＸ，Ａβ２５３５　Ｃａｅｓｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ，ＮａＡＴＰ，
ＧＴＰ，ＣｓＯＨ试剂购于美国 Ｓｉｇｍａ公司；其余普通化
学试剂均为分析纯，购于北京化学试剂公司。
１．２．４　溶液配制　改良人工脑脊液（ｍｍｏｌ·Ｌ－１）：
１９５Ｓｕｃｒｏｓｅ，２４ＮａＨＣＯ３，１０Ｇｌｕｃｏｓｅ，３ＫＣｌ，１２５
ＮａＨ２ＰＯ４，５ＭｇＣｌ２，１ＣａＣｌ２；用ＮａＯＨ将ｐＨ调至７２
；人工脑脊液（ｍｍｏｌ·Ｌ－１）：１２４ＮａＣｌ，２６ＮａＨＣＯ３，
１０Ｇｌｕｃｏｓｅ，１０ＨＥＰＥｓ，３ＫＣｌ，１２５ＮａＨ２ＰＯ４，１
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ＭｇＣｌ２，２ＣａＣｌ２；用 ＮａＯＨ将 ｐＨ调至７２；电极内液
（ｍｍｏｌ· Ｌ－１）：１２４Ｃａｅｓｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ，４ＮａＣｌ，５
ＥＧＴＡ，１０ＨＥＰＥＳ，３ＮａＡＴＰ，０５ＧＴＰ；用ＣｓＯＨ将ｐＨ
调至７２。ＴＴＸ配制成５ｍｍｏｌ·Ｌ－１的母液储存在
－２０℃备用，工作浓度５００ｎｍｏｌ·Ｌ－１；Ａβ２５３５配制
成０１ｍｏｌ·Ｌ－１的母液，３７℃老化 ７ｄ，储存在
－２０℃备用，工作浓度 １０ｍｍｏｌ·Ｌ－１。总黄酮用
ＤＭＳＯ溶解，加入灌流液中，ＤＭＳＯ在灌流体系体积
小于０１％。总多糖直接溶解在灌流液中。
１．３　仪器
标准壁硼硅酸盐玻璃微电极（有芯）（１Ｂ１５０Ｆ，
美国ＷＰＩ公司），微电极拉制仪（ＭＦ８３０，日本 Ｎａｒ
ｉｓｈｉｇｅ公司），小型机器微操作器（美国 ＷＰＩ公司），
膜片钳放大器（ＰＣ２Ｃ，华中科技大学仪博公司），
数据控制与采集器（ＵＤＡ１，华中科技大学仪博公
司），近红外干涉相差显微镜（ＮＲＤＩＣ）：（日本
Ｏｌｙｍｐｕｓ公司），图像摄像转化器（日本 ＤＶＣ公
司），多通道快速微量加药系统（ＭＰＳ２，华中科技
大学仪博公司）。
２　方法
２．１　大鼠海马脑片制作方法
参考刘振伟［４］等人方法将乳鼠海马制成数片
３００μｍ的脑片；将切好的脑片移至３２℃度氧饱和
的人工脑脊液中孵育 １ｈ；之后将脑片移至室温
（２２～２５℃）氧饱和的人工脑脊液中孵育１ｈ待用。
２．２　流程及数据采集和处理
选取立体感强、状态好的锥体细胞（图１），将记
录电极压接触到脑片表面，向内部施加负压，电极和
细胞膜之间形成高阻封接后（大于１ＧΩ），进一步将
膜吸破电极内液和细胞内液相通，钳制电压于 －７０
ｍＶ，形成全细胞膜片钳记录，从－５０ｍＶ到＋５０ｍＶ
范围（步进为５ｍＶ）一系列去极化电压脉冲刺激（脉
冲宽度为：５００ｍｓ），以激发出电压依赖性的内向钙
离子电流。记录电流后加入 Ａβ２５３５后，再加入总黄
酮或者总多糖进行干预。在实验中，应用 Ｐｃｌａｍｐ
６０程序中的Ｃｌａｍｐｅｘ程序记录出原始的锥体细胞
　　
全细胞膜电流图形，再应用 Ｃｌａｍｐｆｉｔ１００程序中的
Ｃｌａｍｐｆｉｔ程序对ＩＣａ的全细胞膜电流作统计分析。
图１　近红外微分干涉相差显微镜下的海马锥体细胞
（×４００）
２．３　统计学处理
计量资料用珋ｘ±ｓ表示。用ＳＰＳＳ１１０统计软件
进行数据统计。各组之间的数值比较采用样本均数
ｔ检验。Ｐ＜００５为差异有统计学意义。
３　结果
实验中所记录到的 Ｃａ２＋通道的电生理学特性
与文献报道一致［５］。应用 ＣｄＣｌ２５００μｍｏｌ·Ｌ
－１后
与对照组比较，可以阻断ＩＣａ（Ｐ＜００１，ｎ＝４）。
３．１　总黄酮对ＡＤ细胞模型ＩＣａ的影响
对照组引出的钙电流大小平均为 －（１５７１±
１９９）ｐＡ，加入１０μｍｏｌ·Ｌ－１浓度的Ａβ２５３５后，钙电
流显著增大，达到 －（３２３２±２３４）ｐＡ，与对照相
比具有显著差异（ｎ＝１８，Ｐ＜００１）。不同浓度的总
黄酮加入后，对增大的钙电流均有对抗作用，并且这
种作用与剂量呈一定相关性。１２５，２５０，５００ｍｇ·
Ｌ－１的 总 黄 酮 灌 流 后，钙 电 流 大 小 分 别 为
－（２５７９±３１６），－（１９６４±２９８），－（１６９３±
３４０）ｐＡ，差异具有显著性（Ｐ＜００１）。不同浓度
的总黄酮对Ａβ２５３５片断作用后的电压门控钙离子通
道的作用。以对照组记录到的钙离子电流作为
１００％。总黄酮为 １２５ｍｇ·Ｌ－１可以减小（３０４±
４０３）％；２５０ｍｇ·Ｌ－１可以减小（４６９±５６３）％
（均ｎ＝６，Ｐ＜００１）；５００ ｍｇ· Ｌ－１ 可 以 减 小
（５９５±６８２）％（均ｎ＝６，Ｐ＜００１）（表１）。
表１　加味五子衍宗方总黄酮不同剂量对海马脑片锥体细胞高电压门控钙离子电流的影响（珋ｘ±ｓ，ｎ＝６） ｐＡ　
分组 １２５ｍｇ·Ｌ－１ ２５０ｍｇ·Ｌ－１ ５００ｍｇ·Ｌ－１
对照　 －１５４１１±１７３ －１５７０±２０４ －１６０１±２２１
模型　 －３２１８０±２７８１） －３２１５±２１８１） －３２６３±２０７１）
总黄酮 －２５７９０±３１６２） －１９６４±２９８２） －１６９３±３４０２）
　　注：与对照组比１）Ｐ＜００１；与模型组比２）Ｐ＜００１（表２同）。
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３．２　总多糖对ＡＤ细胞模型钙离子通道的影响
１２５，２５０，５００ｍｇ·Ｌ－１的总多糖对于 Ａβ２５３５引
起的增大电压门控钙离子通道电流没有作用，加药
后测得的电流与模型组相比没有显著差异（１２５，
２５０ｍｇ·Ｌ－１剂量组ｎ＝４；５００ｍｇ·Ｌ－１剂量组 ｎ＝
３）（表２）。
表２　加味五子衍宗方总多糖不同剂量对海马脑片锥体细胞高电压门控钙离子电流的影响（珋ｘ±ｓ，ｎ＝４） ｐＡ　
分组 １２５ｍｇ·Ｌ－１ ２５０ｍｇ·Ｌ－１ ５００ｍｇ·Ｌ－１
对照　 －１５５６±２９０ －１５００±２０４ －１５３１±３９５
模型　 －３２０８±４５４１） －３１０５±５２８１） －３２４３±４７３１）
总多糖 －３１０６±５７８ －３２４４±５５７ －３３０９±５４２
４　讨论
海马是与学习、记忆、认知行为功能密切相关的
重要脑区。大量研究己证明其与学习记忆特别是空
间认知功能有关。神经元细胞大量的功能依靠钙信
号传导进行［６］，胞内的钙离子主要通过胞外环境的
钙离子内流和内质网的钙库释放。海马神经元上
ＶＤＣＣ根据激活电压的不同分为高电压激活的钙通
道和低电压激活的钙通道（ｌｏｗｖｏｌｔａｇｅａｃｔｉｖａｔｅｄｃａｌ
ｃｉｕｍｃｈａｎｎｅｌｓ，ＬＶＡ）。内源性的 Ａβ在 ＡＤ的发生
和发展中起重要作用，其中 Ａβ２５３５片断是其中毒性
较强的片断之一。老化后的 Ａβ片断较新鲜配制的
Ａβ２５３５具有毒性作用。研究表明，Ａβ可使培养的神
经元［Ｃａ２＋］ｉ明显增加，引起细胞内钙离子超载。钙
超载是多种脑性疾病所具有的共同特性，也是神经
元死亡的最后共同通路，因此细胞内钙离子超载被
认为是Ａβ产生细胞毒性的关键环节［７］。
淫羊藿及菟丝子为五子衍宗方的君药。前期研
究表明，加味五子衍宗方及其提取物对学习记忆具
有保护作用。加味方总黄酮、总多糖能显著增加其
空间探索能力，减少逃避潜伏期［８９］；加味方对于轻
度认知障碍患者记忆商具有提高作用，对其海马体
积和海马颞角具有改善作用，并且能降低患者血清
内β淀粉样蛋白含量。这些研究结果证明，加味方
及其总黄酮、总多糖成分对学习记忆的促进作用具
有多种途径。
不少中药被证明对海马细胞不同的离子通道具
有作用，例如，氧化苦参碱对海马神经元细胞膜钠电
流有明显的抑制作用，且这种作用具有浓度依赖
性［１０］；六味地黄汤含药血清可通过作用于延迟整流
Ｋ＋通道，对神经元起到保护作用［１１］。至于中药复
方成分或者单体对于 ＶＤＣＣ通道影响的研究，目前
仅见银杏内酯Ｂ可以抑制 Ａβ１４０引起的 ＶＤＣＣ通道
超载［１２］。另有大量中医药对于钙离子通道的研究
报道，集中于报道中药单体对于心肌 Ｌ钙通道具有
抑制作用 。
黄酮类成分具有很强的生物活性，对于神经退
行性疾病具有良好作用。本实验首次证明了１２５，
２５０，５００ｍｇ·Ｌ－１的加味方总黄酮可以对抗 Ａβ２５３５
对ＩＣａ的增强作用，表明其还可以通过降低 ＩＣａ进而
降低［Ｃａ２＋］ｉ，发挥对损伤神经元的保护作用。淫
羊藿苷和金丝桃苷正是加味方君药淫羊藿和菟丝子
的主要黄酮成分，本实验室前期的高效液相结果证
明加味方总黄酮的成分主要为淫羊藿苷和金丝桃苷
等黄酮类成分，总多糖成分主要为枸杞多糖
等［１３１４］。另有实验证明淫羊藿苷也可以对抗Ａβ２５３５
对ＩＣａ的增强作用，这从一个侧面反映淫羊藿作为加
味五子衍宗方君药的合理性。但是动物实验证明有
效的浓度为１２５，２５０，５００ｍｇ·Ｌ－１总多糖成分对于
损伤的ＶＧＣＣｓ没有表现出效果，考虑它对学习记忆
的保护作用不是通过此机制或者药物剂量还未达到
有效浓度所致。
神经元内的钙离子超载引起损伤的可能机制包
括：①触发Ｃａ２＋依赖的级联反应，直接损伤靶细胞
或产生细胞毒性物质，最终导致神经细胞的损伤和
死亡；②抑制 ＡＴＰ合成，最终使线粒体通透性转换
孔呈高通透状态，线粒体肿胀破坏，细胞能量耗竭，
同时触发其释放大量钙离子，致使细胞内超过承受
钙离子的限度时，使多种酶激活，细胞功能紊乱，死
亡；③诱发细胞凋亡，一些可以轻度提高钙离子浓度
的物质如谷氨酸受体激活剂，在使钙离子升高的水
平而又低于可引起细胞坏死时的浓度即可诱导细胞
凋亡［１５１６］。加味五子衍宗方总黄酮降低胞内
［Ｃａ２＋］ｉ的机制目前还不清楚，是否参与了这些下游
的干预也有待进一步研究。
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ｉｎｄｕｃｅｄｂｙａｍｙｌｏｉｄβ２５３５ｐｅｐｔｉｄｅｉｎＣＡ１ｐｙｒａｍｉｄａｌｎｅｕｒｏｎｓｏｆ
ｒａｔｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌｓｌｉｃｅ
ＬＩＬｉ１，ＣＡＩＨａｏｒａｎ２，ＬＩＬｉｎ２，ＷＡＮＧＸｕｅｍｅｉ１
（１ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＣｈｉｎｅｓｅａｎｄＷｅｓｔｅｒｎＭｅｄｉｃｉｎｅ，ＦｉｒｓｔＨｏｓｐｉｔａｌ，ＰｅｋｉｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０００３４，Ｃｈｉｎａ；
２ＤｅｐａｒａｔｍｅｎｔｏｆＣｅｎｔｒａｌＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＦｉｒｓｔＨｏｓｐｉｔａｌ，ＰｅｋｉｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０００３４，Ｃｈｉｎａ）
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：ＴｏｅｘｐｌｏｒｅｔｈｅｅｆｅｃｔｏｆｔｈｅｔｏｔａｌｆｌａｖｏｎｏｉｄｓｏｆＪｉａｗｅｉＷｕｚｉＹａｎｚｏｎｇｐｒｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｏｎｔｈｅＶｏｌｔａｇｅｇａｔｅｄ
ｃａｌｃｉｕｍｃｈａｎｎｅｌｏｆｔｈｅＣＡ１ｐｙｒａｍｉｄａｌｃｅｌｏｆｒａｔｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ．Ｍｅｔｈｏｄ：Ｔｈｅｉｎｗａｒｄｃａｌｃｉｕｍｃｕｒｅｎｔｗａｓｒｅｃｏｒｄｅｄｂｙｔｈｅｗｈｏｌｅｃｅｌ
ｐａｔｃｈｃｌａｍｐａｎｄｔｈｅａｍｐｌｉｔｕｄｅｏｆｉｔｗａｓｔｈｏｕｇｈｔｔｏｏｂｓｅｒｖｅｔｈｅｅｆｅｃｔｏｆＡβ２５３５ａｎｄｔｈｅｔｏｔａｌｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ．Ｔｈｅｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓｏｆｒａｔｗａｓ
ｓｅｐａｒａｔｅｄａｎｄｃｕｔｉｎｔｏｓｌｉｃｅｓ．Ａｃｔｉｖｅｐｙｒａｍｉｄａｌｃｅｌｓｏｆｓｌｉｃｅｓｗｅｒｅｃｈｏｓｅｎｆｏｒｔｈｅｗｈｏｌｅｃｅｌｐａｔｃｈｃｌａｍｐｒｅｃｏｒｄｉｎｇ．Ａｆｔｅｒｅｘｐｏｓｕｒｅｔｏ
Ａβ２５３５，ｖｏｌｔａｇｅｓｔｅｐｓ（５００ｍｓ）ｗｅｒｅｕｓｅｄｔｏｄｅｐｏｌａｒｉｚｅｓｔｅｐｗｉｓｅｉｎａｒａｎｇｅｆｒｏｍ５０ｔｏ＋５０ｍＶ（ｉｎｃｒｅｍｅｎｔ：５ｍＶ）．ＡｎｉｎｗａｒｄＣａ
２＋
ｃｕｒｅｎｔｗｈｉｃｈｗａｓｓｕｇｇｅｓｔｅｄｔｏｂｅｓｕｒｖｅｙｗａｓｅｖｏｋｅｄ．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｔｏｔａｌｆｌａｖｏｎｏｉｄｓｗａｓｔｏｂｅｏｂｓｅｒｖｅｄｉｆｉｔｈａｄｅｆｅｃｔｏｎｔｈｉｓｖｏｌｔ
ａｇｅｄｅｐｅｎｄｅｄｉｎｗａｒｄｃｕｒｅｎｔ．Ｒｅｓｕｌｔ：Ａβ２５３５ｃｏｕｌｄｅｎｈａｎｃｅｔｈｅｃａｌｃｉｕｍｃｕｒｅｎｔｔｏｉｎｄｕｃｅｉｎｔｒａｃｅｌｕｌａｒｃａｌｃｉｕｍｏｖｅｒｌｏａｄ．Ｔｈｅａｍｐｌｉ
ｔｕｄｅｏｆｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐｗａｓ－（１５７１±１９９）ｐＡ，ｂｕｔａｆｔｅｒａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆＡβ２５３５ｔｈｅｃｕｒｅｎｔｅｎｈａｎｃｅｄｔｏ－（３２３２±２３４）ｐＡ．
Ｗｈｅｎｔｈｅｔｏｔａｌｆｌａｖｏｎｏｉｄｓａｔｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆ１２５，２５０，５００ｇ·Ｌ－１ｗｅｒｅａｄｄｅｄ，ｔｈｅｃｕｒｅｎｔｄｅｃｌｉｎｅｄｔｏ－（２５７９±３１６），
－（１９６４±２９８）ａｎｄ－（１６９３±３４０）ｐＡ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ａβｉｎｄｕｃｅｄｉｎｔｒａｃｅｌｕｌａｒｃａｌｃｉｕｍｏｖｅｒｌｏａｄｍａｙｂｅｏｎｅｏｆ
ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｏｆβａｍｙｌｏｉｄｐｅｐｔｉｄｅ．ＴｈｅｔｏｔａｌｆｌａｖｏｎｏｉｄｓｏｆＪｉａｗｅｉＷｕｚｉＹａｎｚｏｎｇｐｒｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｃａｎｓｕｐｐｒｅｓｓｉｎｗａｒｄｃａｌｃｉｕｍｃｕｒｅｎｔｔｏｐｒｏ
ｔｅｃｔｎｅｕｒｏｎｓ．
［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］　Ａβ２５３５；ｐｙｒａｍｉｄａｌｃｅｌｓ；ｗｈｏｌｅｃｅｌｐａｔｃｈｃｌａｍｐ；ＷｕｚｉＹａｎｚｏｎｇｐｒｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ；ｖｏｌｔａｇｅｇａｔｅｄＣａ
２＋ ｃｈａｎｎｅｌｓ
（ＶＧＣＣｓ） ［责任编辑　古云侠］
·８７９１·
第３４卷第１５期
２００９年８月
　　　　　 　 　 　 　 　　　　　 　 　 　 　
Ｖｏｌ．３４，Ｉｓｓｕｅ　１５
　Ａｕｇｕｓｔ，２００９