全 文 ：农业生物技术学报 JournalofAgriculturalBiotechnology 2008,16 (1):121~126
*基金项目:高等学校博士学科点专项科研基金(No.20060019043)和北京市科技计划项目(No.H020620110130)资助。
**通讯作者。Authorforcorespondence.教授,博士,主要从事园林植物生理生态方面的研究。Tel:010-62733315;
Fax:010-62733603;E-mail:.
收稿日期:2007-05-16接受日期:2007-07-15
·研究论文·
爬行卫矛再生体系建立及根癌农杆菌介导的遗传转化*
尚爱芹 1,2,陈 颖 1,赵梁军 1**,田颖川 3
(1.中国农业大学观赏园艺与园林系,北京100094;2.河北农业大学园艺学院,保定071001;
3.中国科学院微生物研究所,北京100080)
摘要:以爬行卫矛(Euonymusfortuneivar.radicans)无菌苗下胚轴为外植体,在附加不同浓度植物生长调节剂的 MS基础培
养基上诱导培养,通过器官直接发生途径获得再生植株。结果表明,0.5mg/LBAP和 0.01mg/LNAA组合的诱导效果最佳,其
不定芽再生率高达92%,外植体平均不定芽数目为4.2个。将含有雪花莲凝集素基因(Galanthusnivalisagglutinin,GNA)的植物
表达载体pBCGm导入根癌农杆菌 (Agrobacteriumtumefaciens)LBA4404,通过农杆菌介导法遗传转化爬行卫矛的下胚轴,经
PCR和PCR-Southern检测,GNA基因已整合到转化植株的基因组中。遗传转化过程中,外植体不经预培养,菌液浓度OD=
0.6,共培养3d,有利于获得最高遗传转化效率。
关键词:爬行卫矛;不定芽再生;遗传转化
中图分类号:S184S188 文献标识码:A 文章编号:1006-1304(2008)01-0121-06
EstablishmentofDirectAdventitiousShootRegenerationSystem
ofEuonymusfortuneivar.radicansandItsGeneticTransformation
MediatedbyAgrobacteriumtumefaciens
SHANGAi-qin1,2,CHENYing1,ZHAOLiang-jun1**,TIANYing-chuan3
(1.DepartmentofOrnamentalHorticultureandLandscapeArchitecture,ChinaAgriculturalUniversity,Beijing100094,China;
2.ColegeofHorticulture,HebeiAgriculturalUniversity,Baoding071001,China;3.InstituteofMicrobiology,
ChineseAcademyofSciences,Beijing100080,China)
Abstract:Usinginvitrohypocotylsasexplants,theadventitiousshootsofEuonymusfortuneivar.radicanswerediferentiated
directlyfromthebasalMSmediumsupplementedwithdiferentplantgrowthregulatorsthroughorganogenesis.Theresultsshowed
thatthehighestregenerationfrequencywasobtainedwithMSmediumcontaining0.5mg/L6-BAand0.01mg/LNAA.Ninety-two
percentofregenerationfrequencyand4.2shootsperexplantswereobtainedafter30dofculture.ThebinaryvectorpBCGm
containingGalanthusnivalisagglutinin (GNA)genewasintroducedintoAgrobacteriumtumefaciensLBA4404.Andthehypocotyl
segmentsofE.fortuneivar.radicanswereinfectedthroughA.tumefaciens-mediatedtransformation.ResultshowedthattheGNA
genewasintegratedintothegenomeoftransgenicplantsconfirmedbyPCRandPCR-Southernanalysis.Andthehighest
transformationfrequencywasobtainedthroughexplantswithoutprecultured,infectingfor30minwithOD600=0.6Agrobacterium
tumefacien,andco-cultivatingfor3d.
Keywords:Euonymusfortuneivar.radicans;adventitiousshootregeneration;genetictransformation
爬行卫矛(Euonymusfortuneivar.radicans)为卫
矛科常绿藤本,在城市绿化中已广泛应用。近年来卫
矛属植物不断受到害虫滋扰,发生严重。虫害的发生
不仅严重地影响树体的正常生长和发育,降低了绿
化、美化的景观效果以及观赏价值,而且使园林绿化
的生态效益、社会效益和经济效益大大下降。目前主
要采用化学防治的方法,这不仅花费较高、操作不
便,而且污染环境。
有关卫矛属植物基因工程方面的研究报道不
多,尹淑萍等(2004)通过叶盘法将 CBF1基因导入
农 业 生 物 技 术 学 报 2008年
扶芳藤,以其提高其抗寒性,但其转基因植株的分子
检测还未见报道。
雪花莲凝集素 (Galanthusnivalisagglutinin,
GNA)的抗虫效果较好,且对人畜几乎无害,目前得
到了广泛的应用。GNA对刺吸式口器害虫如蚜虫、
褐飞虱、叶蝉等具有较好的抑制效果,并且对鳞翅目
害虫也具有中等抗性(Hilderetal.,1995;袁正强等,
2001)。到目前为止,已获得的转GNA植物涉及有蔬
菜(吴昌银等,2000)、农作物(权瑞党等,2004)、木本
植物(罗 青等,2001)、观赏植物(王关林等,2004)以
及牧草等。
本研究以爬行卫矛种子的下胚轴为试材,在建
立不定芽直接再生体系后,利用农杆菌介导法将
GNA基因转入爬行卫矛,以期获得抗虫性提高的新
品系。
1 材料和方法
1.1 植物材料
爬行卫矛(Euonymusfortuneivar.radicans)的种
子采自中国林业科学院内。在无菌的条件下,将种子
接种在MS培养基上,当下胚轴伸长到3~4cm时,
剪取0.6cm左右的下胚轴切段作为外植体。
1.2 根癌农杆菌和植物表达载体
根癌农杆菌 (Agrobacteriumtumefaciens)菌株
LBA4404和双元表达载体 pBCGm由中国科学院
微生物研究所提供。pBCGm含有 CoYMV启动子
调控下的GNA基因(图1)。
1.3 试剂来源
工具酶购自Takara公司 (日本),DIG标记试剂
盒购自Roche公司 (德国),用于PCR检测的GNA
基因引物由上海生物工程公司合成。其它常规试剂
均为国产分析纯。
1.4 不定芽再生体系的建立
将下胚轴外植体接种到含有植物生长调节剂
BAP (6-benzylaminopurine)、TDZ (thidiazuron)和
NAA(α-naphthaleneaceticacid)不同浓度组合的 MS
培养基上,观察不定芽的再生情况。培养6周后,再
生芽长到1.5~2.0cm时,切下转入生根培养基中进
行生根培养。培养基中含有 3%蔗糖和 0.6%琼脂,
pH5.8。培养条件为光照强度约40μmol/(m2·s);温
度22~25℃,相对湿度40%。
1.5 农杆菌介导的遗传转化
将长度为0.6cm的下胚轴外植体,接种于芽分
化培养基 (MS+0.5mg/LBAP+0.01mg/LNAA)
上,每个处理10个培养皿,每皿 10个外植体,预培
养 0~4d。用浓度为 OD600=0.2~1.0的根癌农杆菌
LBA4404菌液侵染预培养后的外植体。侵染时间
10~40min,侵染后,用无菌滤纸将外植体周围菌液
吸干,转接到分化培养基上,黑暗条件下共培养1~4
d,然后将经共培养的外植体转接入添加有 50mg/L
Kan(kanamycin)和300mg/LCarb(carbenicilin)的筛
选培养基上。当抗性植株长到3~4cm时,转入添有
30mg/LKan的 1/2MS生根培养基上进行生根培
养。
1.6 转基因植株的分子检测
剪取抗性植株和非转化植株的细嫩叶片,采用
CTAB(cetyltrimethylammoniumbromide)(Taiand
Tanksley,1990)方法提取基因组 DNA。以提取的
DNA为模板,根据pBCGm载体中GNA基因的序
列合成2对特异引物。
上游引物:P1:5-GGCTAAGGCAAGTCTCCTCAT-3;
下游引物:P2:5-ACTTTGCGGTCACGAGCTTGAT-3。
PCR反应体系为 25μL,反应条件:94℃起始
变性 5min;94℃变性 40s,60℃复性 50s,72℃延
伸1min,30个循环;72℃最终延伸 5min。采用常
规方法进行PCR扩增。PCR产物凝胶电泳分析;然
后用虹吸印记法将PCR产物转到尼龙膜上,用地高
辛试剂盒标记的 GNA基因 479bp探针对 PCR产
物进行Southern杂交。
2 结果和分析
2.1 爬行卫矛下胚轴再生体系的建立
2.1.1 植物激素对爬行卫矛不定芽再生的影响 将
爬行卫矛的下胚轴切段接种在附加不同浓度BAP、
TDZ和NAA的MS培养基上,进行不定芽的诱导。
每个处理10个培养皿,共100个外植体。接种4周
后对不定芽再生率进行统计。
研究表明,植物激素的种类、浓度以及组合均对
爬行卫矛下胚轴不定芽分化产生影
响。由表1可知,BAP比较有利于不
定芽的分化,而TDZ完全不能诱导
外植体产生不定芽。TDZ无论单独
使用还是与NAA结合,只能诱导愈
伤组织的形成。尽管BAP单独使用
图1.含有CoYMV启动子调控下的GNA基因的双元表达载体pBCGm
Fig.1.DiagramofbineryvectorpBCGmwithGNAgene
122
第1期 尚爱芹等:爬行卫矛再生体系建立及根癌农杆菌介导的遗传转化
能够诱导下胚轴形成不定芽,但是诱导率较低(34%
~40%),当与 NAA结合使用时,可以显著提高不定
芽的再生率。其中0.5mg/LBAP和0.01mg/LNAA
组合效果最佳。该处理的不定芽再生率为 92%,平
均外植体不定芽数目为4.2个。随着BAP浓度的升
高,不定芽再生率及外植体平均不定芽个数呈下降
趋势,当BAP浓度为 2.0mg/L时,其不定芽再生率
下降为 71%。因此,将 MS附加 0.5mg/LBAP和
0.01mg/LNAA作为诱导爬行卫矛不定芽分化的分
化培养基用于以后的遗传转化研究。
表1浓度及组合的植物激素对爬行
卫矛下胚轴不定芽再生的影响
Table1Efectofvariousconcentrationsandcombinationsof
cytokininsandauxinontheshootregenerationfromhypocotyl
explantsofE.fortuneivar.radicans
培养4周后进行统计分析。相同字母表示差异不显著(P>0.05)。
Datawererecordedafter4weeksofculture.Thesameletersinthe
samecolumnwerenotsignificantlydiferentatP>0.05byDuncan’s
multiplerangetest.
2.1.2 爬行卫矛不定芽发生的形态学观察 将
MS+0.5mg/LBAP+0.01mg/LNAA培养基作为爬
行卫矛的芽分化培养基,并对其不定芽的形成进行
形态学观察。接种7d后,开始形成愈伤组织(图 2,
A);11d后,在下胚轴的表面开始出现绿色小突起
(图2,B);培养14d后,即可形成肉眼可见的不定芽
(图 2,C);培养 21d后,不定芽大量出现,并开始展
叶(图2,D);之后,进入不定芽的伸长生长时期。
当再生不定芽长至1.5~2.0cm时,切下转入加
有不同浓度 IBA和 IAA生根培养基中进行生根培
养 (数据略),最佳的生根培养其为1/2MS附加0.5
mg/LIBA和0.5mg/LIAA,其生根率为91%。
2.2 爬行卫矛遗传转化体系的建立
2.2.1卡那霉素浓度的筛选 将爬行卫矛下胚轴切
段分别接种在含有0(CK)、10、20、40、60、80和100
mg/L的卡那霉素的分化培养基上,接种4周后,统
计其对不定芽再生的影响。研究发现,爬行卫矛的下
胚轴外植体对卡那霉素的浓度比较敏感。在不加卡
那霉素的培养基上(对照),不定芽的再生率为92%,
当卡那霉素浓度为10mg/L时,不定芽的再生率和
对照相比稍有下降(88%),不定芽生长正常;当卡那
霉素浓度为20mg/L时,对不定芽的分化产生一定
的抑制作用;上升为40mg/L时,不定芽的分化明显
受到抑制,不定芽再生率仅为 5%,且到后期,再生
芽全部白化死亡;当其浓度为60mg/L时则完全抑
制了不定芽的分化;当卡那霉素为 80和 100mg/L,
外植体全部白化死亡。因此,本研究选用50mg/L作
为爬行卫矛选择压力。
2.2.2 预培养时间对遗传转化的影响 从图3中
可以明显看出,爬行卫矛下胚轴未经预培养的转化
率最高,为5%;随着预培养时间的延长,抗性芽的
诱导率呈下降的趋势,预培养1d时,其抗性芽再生
处理/mg·L-1Treatment 再生率/% 外植体平均不定芽/个
细胞分裂素 生长素 Regeneration MeanNo.ofshoots
Cytokinins Auxin frequency perexplant
BAP
0.5
1.0
0.5
1.0
2.0
TDZ
0.5
1.0
0.5
1.0
NAA
0
0
0.01
0.01
0.01
NAA
0
0
0.01
0.01
40±3c
34±5d
92±2a
73.±6b
71±5b
0
0
0
0
1.8±0.2d
1.2±0.1e
4.2±0.2a
3.1±0.1b
2.3±0.2c
0
0
0
0
图2.爬行卫矛下胚轴不定芽分化的形态学观察
Fig.2.Themorphologicalobservationofadventitiousshoots
fromhypocotylofE.fortuneivar.radicans
培养基:(MS+0.5mg/LBAP+0.01mg/LNAA)。A.接种后7d形成愈
伤组织;B.接种后11d在外植体表面形成绿色小突起;C.接种后 14
d形成肉眼可见的不定芽;D.接种后21d形成大量的不定芽。
Medium:(MS+0.5mg/LBAP+0.01mg/LNAA).A.Formationofcalus
afterinoculatedfor7d;B.Formationofgreennodulesonthesurfaceof
explantsafterculturedfor11d;C.Adventitiousshootbudsafter
inoculatedfor14d;D.Alotofadventitiousshootsformedaftercultured
for21d.
123
农 业 生 物 技 术 学 报 2008年
图3.预培养时间对转化的影响
Fig.3.Efectofprculturetimeontransformationfrequencyof
E.fortuneivar.radicans
率为 4%,而预培养 4d时,其再生率仅为 1%,说明
预培养对爬行卫矛下胚轴的遗传转化有抑制作用。
2.2.3 农杆菌菌液浓度对遗传转化的影响 将未
经预培养的下胚轴外植体,用OD600=0.2~1.0根癌农
杆菌菌液侵染30min。图4为侵染时间为30min时
的转化率。由图4可知,菌液浓度在02~0.8之间,均
有一定的转化率,但以 OD600为 0.6的转化率最高
(6%),当 OD600为 1.0时,则完全没有 Kan+芽产生。
实验中同时发现,当菌液浓度高时可适当缩短侵染
时间,而浓度低时,可适当延长侵染时间,但不能过
长,否则会造成外植体材料褐死亡。根癌农杆菌菌液
浓度为OD600=0.6左右的转化效果最佳。
图4.菌液浓度对转化的影响
Fig.4.Efectofbacterialconcentrationsontransformantion
frequencyofE.fortuneivar.radicans
2.2.4 共培养时间对遗传转化的影响 实验结果
表明(图5),共培养1d时,农杆菌菌落生长量较少,
几乎看不到根癌农杆菌菌落,最终也没有得到转化
植株。随着共培养时间延长,转化率有所升高,当共
图5.共培养时间对转化效率的影响
Fig.5.Efectofco-cultivationtimeontransformationfrequentcy
E.fortuneivar.radicans
培养3d时,在外植体周围可见明显的根癌农杆菌
菌落,转化效率达到最高(6%);继续共培养时,根癌
农杆菌生长过度,使外植体间的菌落成片分布,造成
褐化而死亡。因此,3d为最佳的共培养时间。
2.3 再生植株的PCR和PCR-Southern检测
将爬行卫矛的下胚轴外植体经根癌农杆菌侵
染、共培养后,转到加有抗生素的分化培养基中,约
1个月后,只有抗性芽能在选择培养基上生长,逐渐
长大(图6,A);未转化成功的外植体逐渐褐化死亡,
即使有再生芽,也会白化死亡(图6,B)。当再生芽长
到3~5cm时,切下进行继代培养。
图6.爬行卫矛卡那霉素抗性植株
Fig.6.Kan+plantsofE.fortuneivar.radicans
A.Kan+抗性植株;B.假转化体。
A.Kan-resistant-plant;B.Kan-nonresistantplant.
以在含有 Kan的培养基上继代培养的抗性植
株基因组DNA为模板,进行PCR扩增,其中有5株
能扩增出与阳性对照相同的479bp条带 (图7),而
非转化植株则没有扩增条带。PCR-Southern杂交结
果进一步表明,PCR扩增有特异条带的5株再生植
株基因组DNA均有较强的杂交信号(图 8),初步表
明外源 GNA基因已经整合到爬行卫矛的基因组
中。
124
第1期 尚爱芹等:爬行卫矛再生体系建立及根癌农杆菌介导的遗传转化
3 讨论
目前,爬行卫矛再生及遗传转化体系的研究,国
内外均无报道。本研究建立了爬行卫矛以下胚轴为
外植体的直接不定芽再生体系,结果表明,激素种类
和配比是影响下胚轴再生的主要因子,本实验中以
0.5mg/LBAP和 0.01mg/LNAA的组合效果最佳,
而TDZ无论是单独使用还是和 NAA结合,均无不
定芽产生,NAA的添加促进愈伤组织的形成,这和
NagoriandPurohit(2004)对 Annonasquamosa的研
究结果是一致的。
在植物遗传转化中,以原生质体、悬浮细胞或愈
伤组织为受体时,获得的转基因植株都需要经过再
分化过程,不但周期长,且在长期继代过程中易产生
无性系变异。下胚轴是遗传转化过程中常用的外植
体(王关林和方宏筠,2002)。本研究以下胚轴为转化
受体时,其不定芽直接产生于下胚轴的表层细胞,不
需经过再分化过程,可缩短获得转基因植株的周期,
减少无性系变异。本研究建立了以根癌农杆菌介导
的遗传转化体系,从侵染到抗性芽的出现仅需约6
周时间,具有操作简单、再生芽迅速等优点。Cuiet
al.(2004)报道以金鱼草(AntirhinummajusL.)下胚
轴为外植体建立的遗传转化体系,比以其它外植体
建 立 的 转 化 体 系 快 1.5~3.0倍 。 Plastiraand
Perdikaris(1997)在对番茄进行遗传转化时也得到了
相同的结论。但是下胚轴在应用时存在着数量有限、
切口小、再生芽数量少以及转化效率低等局限性。本
研究的最终转化率较低,这是木本植物遗传转化过
程中所面临的共同问题。因此,如何提高其遗传转化
效率还有待于进一步深入研究。
关于外植体在转化前进行预培养的效果,有许
多不同的报道。FrayandEarle(1996)认为,预培养可
以使细胞处于一种易于接受外来信息感受态,有利
于根癌农杆菌的转化,同时可以减轻根癌农杆菌对
外植体的伤害,提高转化效率。DeBondtetal.(1994)
以苹果叶片为外植体研究了预培养对转化的影响,
结果表明,预培养明显促进了转化率。王关林等
(2004)认为,在菊花遗传转化过程中,预培养也是非
常必要的;而柴红梅等(2002)认为烟草的叶片不需
进行预培养。本研究中未经预培养的转化率最高,而
随着预培养时间的延长,抗性芽的诱导率呈下降的
趋势,说明预培养对转化有抑制作用。
本研究通过对外植体预培养、菌液浓度、侵染时
间和共培养时间等因素的实验,对根癌农杆菌介导
爬行卫矛下胚轴转化的条件进行了优化。实验结果
表明,在以根癌农杆菌介导爬行卫矛下胚轴遗传转
化中,获得较高转化频率的条件是:下胚轴外植体不
经预培养,直接在OD600为0.6的农杆菌菌液中侵染
30min,共培养3d后转到选择培养基上进行选择
培养。
图7.转GNA基因抗性植株PCR检测
Fig.7.PCRanalysisofkanamycinresistanttransferingGNA
geneplants
1,DNAmarker;2,阳性对照;3,阴性对照,即未转化植株;
4~7和9,转基因植株;8,假转化体。
1,DNAmarker;2,DNAfromputativelyplasmid;3,negativecontrol
plant;4~7and9,putativelytransformedplants;8,DNAfrom
non-transformedplant.
图8.转基因植株的PCR-Southern检测
Fig.8.PCR-SouthernanalysisoftransgenicGNAgeneplants
1,质粒对照;2,阴性对照;3~6和8,转基因植株;7,非转基因植株。
1,purifiedplasmid(pBCGm);2,negativecontrolplant;
3~6and8,transgenicplants;7,non-transgenicplant.
参 考 文 献
ChaiHM(柴红梅),ZhangSS(张绍松),WanM(万萌),Zhao
YC(赵永昌)andHuangXQ(黄兴奇).Constructionofbi-
naryexpressingvectorcontainingGNAgeneandα-PAP
geneandtransformationofthevectorintoNicotianatatacum
(J).SouthwestChinaJournalofAgriculturalSciences(西南
学业学报),2002,15(4):35~37(inChinese)
CuiML,EzuraH,NishimuraS,KamadaHandHandaT.A
rapidAgrobacterium-mediatedtransformationofAntirhinum
125
农 业 生 物 技 术 学 报 2008年
majusL.byusingdirectshootregenerationfromhypocotyl
explants(J).PlantScience,2004,166:873~879
DeBondtAK,EggermontP,DruartM,DeVI,GoderisJ,Van-
derleydenandWFBroekaert.Agrobacteriummediatedtrans-
formationofapple(Malus×domesticaBorkh.):Anassess-
mentoffactorsafectinggenetransfereficiencyduringear-
lytransformationsteps (J).PlantCelReport,1994,13:
587~593
FrayAandEarleED.Anexaminationoffactorsafectingthe
eficiencyofAgrobacterium-mediated transformation of
tomato(J).PlantCelReport,1996,16:235~240
HilderVA,PowerKSandGatehouseAMR.Expressionof
snowdroplectionintransgenictobaccoplantsresultsin
addedprotectionagainstaphids (J).TransgenicResearch,
1995,4:18~25
LuoQ(罗青),QuL(曲玲),CaoYL(曹有龙)andXuX(许
兴).PreliminarystudyoftransgenicChineseWolfberywith
resistancetoaphid (J).NinxiaJournalofAgricultureand
ForestryScienceandTechnology(宁夏农林科技),2001,1:
1~3(inChinese)
NagoriRandPurohitSD.InvitroplantletregenerationinAn-
nonasquamosathroughdirectshootbuddiferentiationon
hypocotylsegments (J).ScientiaHorticulturae,2004,99:
89~98
PlastiraVAandPerdikarisAK.Efectofgenotypeandexplant
typeinregenerationfrequencyoftomatoinvitro (J).Acta
Horticulturae(ISHS),1997,447:235~242
QuanRD(权瑞党),ShangM(尚梅),WangZY(王兆玉)and
ZhangJR(张举仁).Introductionofsnowdroplectingenein-
tomaizeeliteinbredlinesviaAgrobacteriumtumefaciens(J).
ActaBotBoreal-QccidentSin(西北植物学报),2004,24(5):
761~767(inChinesewithEnglishabstract)
TaiTHandTanksleySD.Arapidinexpensivemethodforiso-
lationoftotalDNAfromdehydratedplanttissue (J).Plant
MolecularBiologicalReport,1990,8(4):297~303
WangGL(王关林)andFangHJ(方宏筠).PlantGeneticEngi-
neering(2nd)(M).Beijing:SciencePress,2002.(inChinese)
WangGL (王关林),LiuYH (刘彦泓),GuoSH (郭绍华),
WangY(王宇),JiY(纪彦)andFangHJ(方宏筠).Study
ontransformationofsnowdroplectingenetoChrysanthemun
andaphisresistanceofthetransgenicplants(J).ActaGeneti-
caSinica(遗传学报),2004,31(12):1434~1438(inChinese
withEnglishabstract)
WuCY(吴昌银),YeZB(叶志彪),LiHX(李汉霞)andTang
KX(唐开轩).Genetictransformationoftomatowithsnow-
dropactingene(GNA)(J).ActaBotanicaSinica,2000,42(7):
719~723(inChinesewithEnglishabstract)
YinSP(尹淑萍),JinWM(金万梅),LuRQ(鲁韧强),PanQH
(潘青华)andBaiJ(白金).ShootregenerationandAgrobac-
terium-mediatedtransformationofEuonymusfortuneiHand.
-Mazz.(J).AdvanceinornamentalhorticultureofChina(中
国观赏园艺研究进展).2004,185~188(inChinese)
YuanZQ(袁正强),ZhaoCY(赵存友),ZhouY(周岩)and
TianYC(田颖川).Aphid-resistanttransgenictobaccoplants
expressingmodifiedgnagene(J).ActaBotanicaSinica(植物
学报),2001,43 (6):592~597 (inChinesewithEnglishab-
stract)
126