全 文 ：第 41 卷 第 5 期 东 北 林 业 大 学 学 报 Vol． 41 No． 5
2013 年 5 月 JOURNAL OF NORTHEAST FORESTRY UNIVERSITY May 2013
1)西北农林科技大学引进人才经费资助项目(Z111020901)、
林业公益性行业科研专项(201204308)。
第一作者简介:阙怡，女，1987 年 5 月生，西北农林科技大学林
学院，硕士研究生。
通信作者:李厚华，西北农林科技大学林学院，副教授。E －
mail:lihouhua73@ 163． com。
收稿日期:2012 年 7 月 28 日。
责任编辑:任 俐。
西府海棠组织培养体系的建立与优化1)
阙 怡 李厚华 付婉艺 梁 峥 付林江 刘媛媛
(西北农林科技大学，杨凌，712100) (大港油田园林绿化管理公司)
摘 要 以西府海棠成熟果实为外植体，消毒后取其种子进行培养获取无菌苗。以 MS为基础培养基，应用双
因素完全随机试验方法，研究了不同植物激素及其质量浓度配比对组培苗增殖、离体叶盘愈伤组织诱导及不定芽再
生的影响，并研究了不同的 IBA质量浓度及光照条件对生根的影响。结果表明:西府海棠最适增殖培养基为 MS + 6
－ BA 0． 5 mg·L －1 + IBA 0． 2 mg·L －1，平均增殖倍数为 6． 30;最适离体叶盘再生培养基为 MS + 6 － BA 4． 0 mg·L －1
+ NAA 0． 5 mg·L －1;最适生根培养基为 1 /2 MS +0． 3 mg·L －1 IBA;弱光比强光更利于组培苗的生根诱导。
关键词 西府海棠;组织培养;不定芽再生;组培苗生根
分类号 Q943． 1
Establishment and Optimization of Tissue Culture and Adventitious Shoot Regeneration on Malus micromalus /Que Yi，
Li Houhua，Fu Wanyi，Liang Zheng，Fu Linjiang(Northwest A＆F University，Yangling 712100，P． R． China);Liu Yuanyuan
(Da Gang Oilfield Landscape Management Company)/ / Journal of Northeast Forestry University． －2013，41(5)． －87 ～90
Seeds from ripe fruits of Malus micromalus were used as explants to obtain aseptic seeding． The main purpose was
conducted to study the influence of different phytohormone to shoot proliferation，callus induction and rooting of M． mi-
cromalus． The optimum medium for shoot proliferation is MS + 6 － BA 0． 5 mg·L －1 + IBA 0． 2 mg·L －1 With the average
proliferation value of 6． 30． The optimum medium for adventitious shoot regeneration is MS +6 － BA 4． 0 mg·L －1 + NAA 0．
5 mg·L －1 ． The optimum medium for rooting is 1 /2MS + 0． 3 mg·L －1 IBA． The roots induced under low light are better
than those under high light situation．
Keywords Malus micromalus;Tissue culture;Adventitious shoot regeneration;Tissue culture seedling rooting
西府海棠为蔷薇科苹果属植物，落叶小乔木，树
形峭立;叶长椭圆形，表面有光泽;花在蕾期为红色，
开放后呈淡粉红，花径约 4 cm;小果熟时泛红，萼洼
梗洼均下陷。西府海棠春天开花时红粉相间，秋季
小果缀满枝头，观赏价值极高，在我国已有悠久的栽
培历史。并且该种耐旱、抗寒，在我国北方园林中常
见栽培。明代王象晋在《群芳谱》中记载了“海棠四
品”，西府海棠就是其中之一。
西府海棠是观赏海棠育种的优良亲本。为突破
传统杂交育种的局限，近年来，越来越多的科学工作
者展开了观赏海棠的分子育种。转基因育种相对传
统杂交育种具有育种周期短、能突破种间生殖隔离
等优点［1］。已有的研究表明，苹果属植物转基因育
种多用农杆菌侵染叶盘法［2］。因此建立西府海棠
的高效组培快繁体系和离体再生体系是顺利进行观
赏海棠分子育种的基础。
目前，海棠的组培研究已取得一定的进展。
2007 年，张庆田等［3］对垂丝海棠组培再生体系进行
了研究，并通过调节激素 6 － BA 和 NAA 的配比成
功诱导叶盘再生不定芽。2009 年，戴全胜等［4］对颐
和园古西府海棠进行了组培快繁研究，优化了扩繁
培养基，使其最高增殖倍数达到 4． 16，但未进行叶
盘愈伤组织诱导和再生的研究。相比之下，苹果的
组培快繁和离体再生体系研究得比较深入［5］，很多
研究表明，以山梨醇作为碳源，适当的暗培养有利于
苹果属植物叶盘的愈伤组织诱导［6 － 7］。
本试验在前人研究的基础上，建立了系统、高效
的西府海棠组培快繁体系，探索了离体叶盘再生体
系，为进一步开展海棠的遗传转化、品种改良的研究
奠定了基础。
1 材料与方法
外植体消毒:本研究选用种子作为外植体。
2010 年 9 月份，于西北农林科技大学海棠园内采取
5 年生以上西府海棠树上成熟健康的果实，清水洗
净后置于加 3 ～ 5 滴 Tween20 的水中浸泡 30 min，然
后流水冲洗 1 ～ 2 h。在超净工作台上用 75%酒精
摇晃消毒 30 s，无菌水清洗 2 次;然后用 5% NaClO
浸泡 8 min，无菌水冲洗 3 次。
初代及继代培养:在无菌操作环境下切开消毒
好的果实，选取饱满的种子接种到 MS 培养基上，放
置于 25 ℃、室内自然光照下培养，约 1 个月后种子
萌发长出无菌小苗。当苗长到 2 ～ 3 cm高时将其转
接到本实验室所用的 MS培养基 + 1 mg·L －16 － BA
DOI:10.13759/j.cnki.dlxb.2013.05.018
+ 0． 1 mg·L －1 IBA中进行初步继代培养，以获得更
多数量的组培苗。
扩繁培养基的优化:采用 2 因素 3 水平的完全
随机试验方法，研究不同激素质量浓度配比对组培
苗增殖倍数的影响。以 MS +30 g·L －1蔗糖 + 7 g·
L －1琼脂为基础培养基;细胞分裂素选用 6 － BA，设
置 0． 5、1． 0、1． 5 mg·L －1 3 个水平;生长素选用
IBA，设置 0． 05、0． 10、0． 20 mg·L －13 个水平。共设
置 9 种组合，每种组合接种 15 个组培苗，重复 2 次。
30 d后统计增殖与植株生长情况。增殖倍数 =株高
1 cm以上的扩增组培苗数 /原接种的组培苗数。株
高用坐标纸粗略测量。健康指数分为 3 个等级:1
级，表现为扩增组培苗玻璃化、植株水渍状或植株叶
片枯黄死亡;2 级，表现为组培苗无玻璃化，但茎干
细弱，叶片过小或过大老化，可用于扩繁但不能取叶
再生;3 级，表现为扩增组培苗生长健壮，叶片大小
适中，叶片鲜绿。
叶片愈伤组织诱导及不定芽分化:选择继代培
养 30 d 后长出的健壮组培苗，取其顶部的幼嫩叶
片，垂直于主叶脉横切成约 0． 5 cm2 的叶盘，置于含
不同质量浓度 6 － BA和 NAA的 MS培养基上培养。
以 30 g·L －1山梨醇作糖源，琼脂 7 g·L －1，6 － BA
设置 1、2、4、6 mg·L －14 个水平，NAA 设 0． 1、0． 5、
1． 0 mg·L －13 个水平，共 12 种组合。25 ℃暗培养 2
周诱导出愈伤组织后转入光照下培养进行不定芽分
化(光照强度 1 500 ～ 2 000 lx，光周期为 16 h 光 /8 h
暗)。每两周更换 1 次培养基。每种组合 10 片叶，
重复 3 次，14 d后统计愈伤量，60 d后统计不定芽分
化情况。愈伤量分 4 个等级，0 代表无愈伤组织;1
代表仅在主叶脉的切口处有极少量愈伤组织;2 代
表仅在一端切口处诱导出大量愈伤组织，另一端愈
伤量较少或无;3 代表两端切口处均长满致密的愈
伤组织［8］。
生根与移栽:以继代培养 30 ～ 35 d 后长出的 2
cm以上的健壮组培苗为材料进行生根诱导试验，研
究激素质量浓度、光照强度及基础培养基对生根率
的影响。选择 IBA为生根诱导激素，设 0． 1、0． 2、
0． 3 mg·L －13 个水平;光照强度分为正常组培光照
(2 000 lx)和弱光(室内自然光) ;再在此试验基础上
进行基础培养基的选择，设 MS、1 /2MS 和 1 /4MS 3
个水平。每种处理 9 个苗，重复 3 次。40 d 后统计
生根率及根生长情况。生根率 = (生根的组培苗
数 /接种组培苗数)× 100%。将生根苗进行炼苗移
栽:洗净根部残留培养基，植于 V(细沙)∶ V(腐殖
质)∶ V(蛭石)= 5∶ 8∶ 2 的基质中，加盖透光塑料
杯，第一周每天喷 3 ～ 5 次水，以后逐渐减少喷水量，
2 周后去杯并移栽到大盆中。
数据分析方法:采用 SPSS 18． 0 统计软件对以
上数据进行方差分析和多重比较分析。
2 结果与分析
2． 1 不同质量浓度 6 － BA及 IBA组合对西府海棠
组培苗增殖的影响
幼嫩组培苗接入新的培养基约 1 周其底部切口
处开始长出愈伤组织，2 周后开始分化出丛生芽。
培养 30 d后的结果表明，丛生芽数量随着 6 － BA质
量浓度的增加呈增多趋势，但随着 6 － BA 质量浓度
的增加，丛生芽长势变弱，玻璃化现象越来越严重，
因此，在苗高大于 1 cm 标准下的增殖倍数反而随 6
－ BA质量浓度增加呈递减趋势(表 1)。在 MS + 0．
5 mg·L －16 － BA +0． 2 mg·L －1 IBA培养基中，西府
海棠组培苗的增殖倍数为 6． 30，健康指数为 3，为最
适增殖培养基。
表 1 不同激素质量浓度配比对西府海棠组培苗扩增及生
长的影响
组别
植物生长调节剂质量浓度 /mg·L －1
6 － BA IBA
增殖
倍数
苗高 /
cm
健康
指数
K1 0． 5 0． 05 3． 78ab 2． 36d 1
K2 0． 5 0． 10 4． 00b 2． 24bcd 1
K3 0． 5 0． 20 6． 30c 2． 28cd 3
K4 1． 0 0． 05 2． 78a 2． 18bcd 2
K5 1． 0 0． 10 5． 32c 2． 00abc 3
K6 1． 0 0． 20 3． 56ab 2． 01abc 2
K7 2． 0 0． 05 3． 41ab 1． 93ab 1
K8 2． 0 0． 10 3． 67ab 1． 74a 2
K9 2． 0 0． 20 3． 78ab 2． 40d 2
注:同列内不同字母表示用 Duncan’s法检测在 P ＜ 0． 05 水平上
差异显著。
2． 2 不同质量浓度 6 － BA 和 NAA 组合对西府海
棠离体叶盘不定芽再生的影响
2 周暗培养结束后，所有的叶盘都能诱导出乳
黄色的愈伤组织，但不同的激素配比诱导出的愈伤
量差异显著(表 2，图 1D － F)。随 NAA质量浓度的
升高，愈伤量显著增加。当 6 － BA 质量浓度达到 4
mg·L －1时，愈伤组织可以分化芽，但数量不多。总
体而言，C8 组合诱导出的愈伤组织分化能力更强。
2． 3 不同培养基及培养环境对西府海棠组培苗生
根的影响
2． 3． 1 不同 IBA质量浓度对西府海棠组培苗生根
的影响
IBA质量浓度对组培苗生根诱导的试验结果表
明，在 1 /2MS 培养基中，相同的光照条件下，生根
率、每苗平均根数随 IBA 质量浓度的升高呈递增的
趋势(表 3)。当 IBA质量浓度为 0． 3 mg·L －1时，植
78第 5 期 阙 怡等:西府海棠组织培养体系的建立与优化
株生长健壮，叶色浓绿，生根率和每苗平均根数也最
高，为试验组合中的最适激素质量浓度。
2． 3． 2 不同光照条件对西府海棠组培苗生根的影响
光照条件对组培苗生根影响的试验结果表明，
在相同的激素质量浓度下，组培苗在弱光下诱导生
根比在正常光照下诱导的生根率高(表 3) ，并且弱
光环境下出根时间比正常光照下短，平均 5 d 就开
始有生根现象，而正常光照下需 1 周以上才能观察
到生根。综上考虑，宜在弱光下进行生根诱导。
2． 3． 3 不同基础培养基对西府海棠组培苗生根影响
在 IBA质量浓度 0． 3 mg·L －1、弱光环境诱导
的条件下，随着大量元素的减少，其生根率显著升
高，但当使用 1 /4MS培养基时，其生根率虽最高，但
须根极少，且长势细弱。因此，仍选用 1 /2MS 作为
最适基础培养基。
综上所述，西府海棠最适生根条件为在 1 /2MS +
0． 3 mg·L －1 IBA培养基中于弱光下诱导。
表 2 不同激素质量浓度配比对西府海棠离体叶盘再生的
影响
组别
植物生长调节剂质量浓度 /mg·L － 1
6 － BA NAA
愈伤
量
愈伤组
织颜色
分化状况
C1 1 0． 1 1 浅绿色 无根芽分化
C2 1 0． 5 2 绿色 无根芽分化
C3 1 1． 0 3 绿色稍带红 无根芽分化
C4 2 0． 1 1 绿色 无根芽分化
C5 2 0． 5 2 绿色 无根芽分化
C6 2 1． 0 3 绿色稍带红 分化出 1条根
C7 4 0． 1 1 绿色，白色 分化出 2个芽
C8 4 0． 5 2 浅绿色 分化出 3个芽，1条根
C9 4 1． 0 3 绿色 无根芽分化
C10 6 0． 1 1 绿色 无根芽分化
C11 6 0． 5 2 绿色 无根芽分化
C12 6 1． 0 3 绿色 分化 1个芽
A － C．扩繁培养中，健康指数分别为 1、2、3 的 3 种扩繁苗表现;D － F．叶盘再生培养中，愈伤量分别为 1、2、3 的表现;G．离体叶盘再生诱导出的
大量不定根;H．组培苗生根;I．炼苗培养。
图 1 西府海棠组织培养
3 结论与讨论
木本植物外植体的建立多选用带腋芽茎段，但
常表现出高污染率和不同程度的褐化问题。本研究
初期曾选择当年生带腋芽茎段为外植体进行消毒处
理，但污染率太高(95%以上) ，可能是因为鳞片上
有毛状附属物，不利于消毒。改用果实为外植体后，
其污染率降至 0。从果实中取种子比直接用种子进
行消毒的好处在于，果实表面光滑，并且消毒液没有
直接接触种子，起到保护作用。
不同质量浓度激素组合对西府海棠组培苗增殖
的影响的试验结果表明，丛生芽数量随着 6 － BA 质
量浓度的增加呈增多趋势，当 6 － BA质量浓度增加
到 2 mg·L －1时，单株丛生芽数量最多能达 10 以上，
88 东 北 林 业 大 学 学 报 第 41 卷
但大多数丛生芽有玻璃化、矮化现象，不能继续用于
增殖。丛生芽玻璃化的发生可能是由高质量浓度的
细胞分裂素所导致的［9 － 10］;而丛生芽矮小不伸长可
能是由于增殖苗数太多，营养物质和生长素供应不
足而导致。因此，本研究统计了大于 1 cm的扩增苗
数及组培苗的健康指数，以利于选择最适培养基。
表 3 不同培养基及光照条件对西府海棠组培苗生根的影响
基础培
养基
IBA /
mg·L －1
光照
条件
生根率 /
%
每苗平均
根数 /根
根长 /
cm
描 述
1 /2MS 0． 1 正常光照 16． 67a 1 6． 00 须根极多，肉红色
弱 光 27． 77ab 2 2． 86 无须根，乳白色
0． 2 正常光照 20． 00a 2 4． 86 须根多，肉红色
弱 光 40． 00abc 2 1． 98 须根少，乳白色
0． 3 正常光照 41． 67abc 4 2． 86 须根较多，肉红色
弱 光 75． 00bc 3 2． 35 须根较多，乳白色
MS 0． 3 弱 光 50． 00abc 1 2． 12 须根少，乳白色
1 /4MS 0． 3 弱 光 87． 50c 5 2． 00 须根极少，根下端略红
注:同列内不同字母表示用 Duncan’s法检测在 P ＜ 0． 05 水平上
差异显著。
西府海棠离体叶盘经 14 d 暗培养后，很容易诱
导出愈伤组织，但从愈伤组织分化不定芽却较困难，
这与 Jin et al．［11］的研究相似。适当增加生长素质
量浓度，其愈伤组织有向根分化的趋势，用 0． 3 mg·
L －16 － BA +2． 0 mg·L －1 IBA的激素配比培养叶盘，
45 d后分化出大量丛生根(图 1G)。当 6 － BA质量
浓度增加到 4 mg·L －1时有芽分化，虽然数量极少，
但是可在此基础上进行西府海棠离体叶盘再生培养
基的进一步优化。
生根培养结果表明，弱光环境有利于生根，且生
根时间短。这可能是因为弱光环境利于愈伤组织向
根的分化［12］。但弱光限制了光合作用，不利于地上
部分的生长。因此，在弱光下成功诱导生根后，应将
组培苗立即置于正常光照下培养［13］。在生根试验
中随着基础培养基中大量元素的减少生根率反而呈
升高的趋势，这可能是因为随着培养基中大量元素
的减少，NH4NO3 质量浓度逐渐降低，对植物生根的
抑制作用减弱，从而导致了生根率的提高［14］。
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