全 文 ：第21卷 第21期
Vol.21 No.21
2015年 11月
November.2015Guiding Journal of Traditional Chinese Medicine and Pharmacy
*基金项目：国家自然科学基金（No.31170510）；黑龙江省应用
技术研究与开发计划项目（No.GA13B202-3）；黑龙江省教育
厅科学技术研究项目（No.12531656）；黑龙江中医药大学“优
秀创新人才支持计划”-优秀青年教师
通讯作者：王振宇，E-mail：wzy219001@hit.edu.cn
百华花楸（Sorbus pohuashanensis）为蔷薇科落
叶小乔木，在我国主要分布于东北吉林长白山区、黑
龙江省小兴安岭以南山地；俄罗斯远东、朝鲜北部也
有分布。百华花楸提取物具有一定抗氧化的作用活
性，其提取物中含有大量的多酚、黄酮类成分 [1]。多
酚、黄酮类化合物经研究表明具有很好的抗氧化活
性，如清除活性氧自由基[2]、抑制油脂过氧化反应[3]、
对正常小鼠肝组织匀浆体外生成氧化脂质减少[4-5]等
抗氧化效果。DPPH是一种非常稳定的人工合成自由
基，其甲醇溶液显紫色，最大吸收波长范围在515~
528 nm[6]。当抗氧化剂与DPPH反应时，抗氧化剂提供
1个电子与1个DDPH自由基配对结合，使DPPH的特
征紫色消失，根据吸光度的变化测抗氧化剂的活性[7]。
因此种方法快速、灵敏，已广泛用于抗氧化剂清除自
由基能力的测定。此方法的清除活性一般用TEAC
(trolox equivalent antioxidant capacity)表示 [8]。本文
选取响应面法作为一种优化方法，考虑了试验随机
误差，而传统优化是不考虑试验随机误差的。同时，
响应面法将复杂的未知函数关系在小区域内用简单
百华花楸抗氧化活性物质提取技术研究*
于晓瑾1，2，王振宇1，高 宇2，谢国梁2，孙 璐2，刘瑞海1，3
（1.哈尔滨工业大学食品科学与工程学院，黑龙江 哈尔滨 150090；2.黑龙江中医药大学药学院，黑龙江
哈尔滨150040；3.美国康奈尔大学食品科学系，纽约 伊萨卡 14853-7201）
[摘要] 目的：实验以百华花楸提取物对DPPH清除率为指标，以保证提取物高抗氧化活性。方法：实验在单因素试验基础
上，采用CCD响应面设计法，建立了乙醇浓度、料液比、超声温度三因素与DPPH抗氧化活性之间的回归优化模型，对超声波辅助
提取工艺进行优化。结果：确定了最佳提取工艺参数为：乙醇浓度81%，料液比10∶51，超声温度52℃，对DPPH抗氧化活性的实际
值为3328.79（μmolTE/100g）。结论：响应面法对于优化百华花楸提取物抗氧化活性的工艺合理可行，为增加提取物的抗氧化活性
提供了理论依据。
[关键词] 百华花楸提取物；DPPH；响应面法
[中图分类号] R284.2 [文献标识码] A [文章编号] 1672-951X（2015）21-0020-05
Antioxidant Substance of Sorbus Pohuashanensis Extractive Technique Study
YU Xiao-jin1,2, WANG Zhen-yu1, GAO Yu2, XIE Guo-liang2, SUN Lu2, LIU Rui-hai1,3
(1.School of Food Science and Engineering, Harbin Institute of Technology, Harbin Heilongjiang 150090, China;
2.College of pharmacy, Heilongjiang University of Chinese Medicine, Harbin Heilongjiang 150040, China;
3.Department of Food Science, Cornell University ,Ithaca, NY 14853-7201, America)
[Abstract] Objective: DPPH removal rate of the Sorbus pohuashanensis Hedl as the index, in order to guarantee the high
antioxidant activity of extract. Methods: Experiment established the alcohol concentration, ratio of material to solvent, ultrasonic
temperature three factors and the return of the clearance between DPPH optimization model, to optimize the ultrasonic assisted
extraction process. Results: The optimal parameters for extraction process are settled: alcohol concentration 81%, ratio of material
to solvent 10∶51, ultrasonic temperature 52℃, and the antioxidant activity of DPPH is 3328.79 (μmolTE/100 g). Conclusion: The
experiment result indicates that RSM is feasible to the optimization of the antioxidant activity of Sorbus pohuashanensis extrac－
tive, and a theoretical basis is offered with an increased antioxidant activity of extract.
[Key words] Sorbus pohuashanensis extractive; DPPH; response surface methodology(RSM)
!!!!!!!!!!!!!
!!!!!!!!!!!!!
中药制剂与药理分析
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DOI:10.13862/j.cnki.cn43-1446/r.2015.21.007
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的一次或二次多项式模型来拟合，计算比较简便。以
超声提取百华花楸提取物抗氧化活性的DPPH的
TEAC值为研究对象，利用响应面方法对具有抗氧化
活性提取物的提取工艺进行优化，以期增加最后提
取物的抗氧化活性。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器 百华花楸果实(采摘于黑龙江省
张广才岭地区)；DPPH试剂 Sigma-Aldrich公司；其
他试剂均为分析纯。全波长酶标仪：美国Thermo Sci－
entific；超声波清洗器：宁波新芝生物科技股份有限
公司；电子天平：上海良平仪器仪表有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 百华花楸提取物的制取 称取冷冻鲜果10 g，
置于100 mL小瓶中，在不同的超声温度下，加入不同
浓度、不同料液比的乙醇，超声数分钟，具体操作方
法见单因素实验。趁热抽滤，定容至100 mL，备用。
1.2.2 DPPH的测定方法 本实验采用对DPPH清除
率的影响来确定其抗氧化活性，使用Trolox作为标准
溶液，实验操作如下：其反应体系包括20 μL样品或
20 μL Trolox标准溶液与150 μL DPPH甲醇溶液，漩
涡振荡器上混匀，避光反应30 min后，在515 nm处测
定吸光度[9]。每份样品平行操作3次，计算公式如下：
DPPH自由基清除率 (%)=[(AContral-ASample)/
AContral]×100%
式中AContral-20 μL 80%乙醇溶液与150 μL
DPPH混合后的吸光度；ASample -20 μL/mL样品与
150 μL DPPH溶液混合后的吸光度。
样品的抗氧化活性用TEAC来表示（即样品对
DPPH清除率的EC50值与Trolox的EC50值的比较）。
1.2.3 单因素实验设计
1.2.3.1 料液比对提取物抗氧化活性的影响 分别
称取10 g冷冻百华花楸鲜果，置5个100 mL锥形瓶
中，按料液质量体积比1：3、1：4、1：5、1：6、1：7加入
70%浓度的乙醇，60℃水浴超声20 min，趁热抽滤，
将滤液置100 mL量瓶中，加70%乙醇至刻度，摇匀，
备用。
1.2.3.2 乙醇浓度对提取物抗氧化活性的影响 分
别称取10 g冷冻百华花楸鲜果，置于5个100 mL锥形
瓶中，分别按料：液=10：60加入30%、50%、70%、80%、
90%的乙醇溶液，60℃水浴超声20 min，趁热抽滤，
将滤液置100 mL量瓶中，加对应的不同浓度乙醇至
刻度，摇匀，备用。
1.2.3.3 超声温度对提取物抗氧化活性的影响 分
别称取10 g冷冻百华花楸鲜果，置5个100 mL锥形瓶
中，按按料：液=10：60加入70%的乙醇，超声温度分
别为20℃、30℃、40℃、50℃、60℃，超声20 min后，趁
热抽滤，将滤液置100mL量瓶中，加70%乙醇至刻度，
摇匀，备用。
1.2.4 响应面法对百华花楸提取物抗氧化活性提取
条件进行优化综合 根据单因素实验结果，根据
Central-Composition的中心合成实验设计原理，采用
响应面法在三因子三水平上对百华花楸提取物抗氧
化活性的提取条件进行优化。实验因素和水平见表1。
表 1 响应面分析因素及水平表
水平
-1 0 1
料液比（X1）/(m/V) 1：4 1：5 1：6
乙醇浓度（X2）/(%) 70 80 90
提取温度（X3）/(℃) 45 50 55
1.2.5 实验方法和软件 单因素试验结果分析利用
SPSS19.0进行方差分析及多重比较，响应面试验设
计和结果分析利用Design-Expert8.0实现。画图采用
GraghPad Prism 5。
2 结果与讨论
2.1 料液比对抗氧化活性的影响 由图1可知，液
料比从1∶3到1∶5递变时，抗氧化活性显著增加，液料
比增加到1∶5到1∶7时，抗氧化活性显著下降。对结果
进行单因素方差分析（ANOVA）并进行Fisher LSD多
重比较，方差分析结果见表2。LSD多重比较结果见
表3。
图 1 料液比对百华花楸总黄酮抗氧化活性的影响
表 2 料液比对总黄酮含量影响的单因素方差分析
（ANOVA）结果
差异源 平方和 自由度 均方 F值 P值
组间SSt 770791.800 4 192697.950 16.369 ＜0.05
组内SSe 164812.794 14 11772.342
总计Total 935604.594 18
表2结果表明料液比不同时总黄酮抗氧化活性
有统计学意义。进一步利用Fisher LSD法进行两两
因素
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间多重比较，结果见表3。
表 3 Fisher LSD多重比较结果
料液比 1：4 1：5 1：6 1：7
1：3 0.481 0.000b 0.032a 0.003b
1：4 0.000b 0.108 0.011a
1：5 0.001b 0.003b
1：6 0.345
注：a表示p值小于0.05，b表示P值小于0.01。
表3多重比较结果表明，综合显示料：液为1：5，
1：3时，与其他料液比之间的总黄酮抗氧化活性更具
有显著性影响。而1：3时的抗氧化活性明显低于1：5
的抗氧化活性，所以选取1：5为最佳条件。
2.2 乙醇浓度对抗氧化活性的影响 由图2可知，
乙醇浓度在80%之前随着乙醇浓度的增大其抗氧化
活性增加较为明显，80%后的其抗氧化活性略有下
降。进行下一步的单因素方差分析（ANOVA）并进行
两两间多重比较Fisher LSD检验。方差分析结果见
表4。多重比较LSD检验见表5。
图 2 乙醇浓度对百华花楸总黄酮抗氧化活性的影响
表 4 乙醇浓度对总黄酮含量影响的单因素方差分析
（ANOVA）结果
差异源 平方和 自由度 均方 F值 P值
组间SSt 708190.90 4 177047.73 40.44 ＜0.01
组内SSe 65670.24 15 4378.02
总计Total 773861.14 19
表4结果表明乙醇的五个浓度间提取抗氧化活性
间差异有统计学意义，即乙醇浓度有显著的影响。进
一步为了比较各浓度之间哪些有差异，进行Fisher
LSD多重比较，结果见表5。
表 5 Fisher LSD多重比较结果
乙醇浓度% 50 70 80 90
30 0.043a 0.670 0.000b 0.049a
50 0.018a 0.000b 0.942
70 0.000b 0.021a
80 0.000b
注：表中数值为不同浓度LSD比较p值，aP<0.05下有统计
学意义，bP<0.01下有统计学意义。
根据表5多重比较结果，综合显示高醇浓度为
80%与低醇浓度30%~70%，90%之间的抗氧化活性
差异有显著性影响。且80%提取物的抗氧化活性最
高，因此醇浓度选择为80%。
2.3 超声温度对抗氧化活性的影响 由图3可知，
在50℃之前，随温度的升高，抗氧化活性不断增加，
在50℃时达到最大，超过50℃下降。进行进一步单
因素方差分析结果见表6。LSD多重比较检验结果见
表7。
图 3 超声温度对百华花楸总黄酮抗氧化活性的影响
表 6 超声温度对总黄酮含量影响的单因素方差分析
（ANOVA）结果
差异源 平方和 自由度 均方 F值 P值
组间SSt 172683.155 4 43170.789 8.161 <0.01
组内SSe 79352.063 15 5290.138
总计Total 252035.218 19
表6结果表明超声温度对于总黄酮含量的影响有统计学
意义。进一步进行Fisher LSD多重比较，结果见表7。
表 7 Fisher LSD多重比较结果
超声温度 30 40 50 60
20 0.003b 0.037a 0.000b 0.015a
30 0.246 0.055 0.457
40 0.005b 0.663
50 0.012a
注：表中数值为不同浓度LSD比较p值，aP<0.05下有统计
学意义，bP<0.01下有统计学意义。
根据表7多重比较结果，综合显示超声温度为
50 ℃时与其他超声时间的抗氧化活性差异有显著
性差异。且其抗氧化活性也是最高，故选择最佳超声
温度为50℃。
2.4 响应面实验结果 在单因素实验结果基础上，
以X1，X2，X3为自变量，以抗氧化活性TEAC值为响应
值Y，进行响应面分析实验，实验结果见表8。
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表 8 响应面分析方案及实验结果
实验号 X1 X2 X3 TEAC值（μmolTE/100g）
1 -1.000 1.000 -1.000 2271.57
2 0.000 0.000 0.000 3645.33
3 0.000 1.000 0.000 3071.91
4 0.000 0.000 0.000 3339.03
5 -1.000 -1.000 1.000 2636.45
6 -1.000 1.000 1.000 2335.95
7 0.000 0.000 0.000 3247.03
8 0.000 0.000 0.000 3286.06
9 0.000 0.000 1.000 3113.19
10 0.000 0.000 0.000 3437.26
11 1.000 -1.000 1.000 2502.29
12 0.000 -1.000 0.000 2958.87
13 1.000 -1.000 -1.000 1899.14
14 0.000 0.000 -1.000 2936.00
15 1.000 1.000 1.000 2758.83
16 1.000 0.000 0.000 2923.44
17 1.000 1.000 -1.000 2422.04
18 0.000 0.000 0.000 3414.94
19 -1.000 0.000 0.000 2829.06
20 -1.000 -1.000 -1.000 16.1641
表8中有14个实验为析因实验，6个为中心实验。
20个实验点分为析因点和零点，其中析因点为自变
量取值在X1、X2、X3所构成的三维顶点，零点为区域
的中心点，零点实验重复6次，用以估计实验误差。分
析结果见表9。
表 9 响应面 ANOVA结果
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 Prob>F
模型 517.05 9 57.45 24.66 <0.0001
X1 6.66 1 6.66 2.86 0.1217
X2 15.55 1 15.55 6.68 0.0272
X3 48.47 1 48.47 20.80 0.0010
X1X2 2.26 12.26 0.97 0.3484
X1X3 0.26 10.26 0.11 0.7448
X2X3 18.67 118.67 8.01 0.0178
X12 56.58 1 56.58 24.29 0.0006
X22 27.19 1 27.19 11.67 0.0066
X33 25.63 1 25.63 11.00 0.0078
残差 23.30 10 2.33
失拟 13.12 5 2.62 1.29 0.3934
误差 10.17 5 2.03
总和 540.35 19
模型的确定系数 0.9569
模型的调整系数 0.9181
建立球面设计二次回归模型为：Y=-744.86618+
7.25447X1+4.37210X2+14.46733X3+0.00530976 X1X2-
0.00361217X1X3-0.030550X2X3-0.045361X12-0.031446
X22-0.12211X32
从表9中回归分析结果可知，整个模型显著性检
验F=24.66，P<0.0001，回归方程有统计学意义。决定
系数R2=0.9569，调整后的决定系数R2=0.9181，均较
高，说明这种实验方法是可靠有效的。失拟检验F=
1.29，P=0.3934>0.05，说明该模型不失拟，拟合的较
好。
模型中X1、X3、X2X3、X12、X22、X32对Y值的影响非
常显着，表明实验因子对响应值不是简单的线性关
系，二次项、交互作用对响应值均有很大的影响。图
4～图6直观地给出了各个因子交互作用的响应面的
3D响应面图和相应等值线图。从图中可以看出，当
令其中一个因素固定时，另外两个因素的变化最优
值均在初选的零点指标值附近，这也说明，预实验选
择的初始零点较好。
进一步利用最快梯度法寻优，可以得到X1、X2、X3
最佳提取条件为：乙醇浓度80.91%，料：液为10：51.28，
超声温度51.63 ℃，理论最佳抗氧化活性为3416.43
（μmolTE/100 g）。为了检验响应面法的可行性，采用
得到的最佳提取条件进行百华花楸提取物抗氧化活
性的验证实验，同时考虑到实际操作和生产的便利，
以乙醇浓度81%，料：液为10：51，超声温度52℃为最
佳。3次平行实验得到的实际平均抗氧化活性为
3328.79（μmolTE/100g），与理论值相差87.64（μmolTE/
100 g）。因此，响应面法对百华花楸提取物抗氧化活
性的优化是可行的，得到的总黄酮提取条件具有实
际应用价值。
图4a Y=f(X1，X2)的3D响应面图
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图4b Y=f(X1，X2)的等值线图
图5a Y=f(X1，X3)的3D响应面图
图5b Y=f(X1，X3)的等值线图
图6a Y=f(X2，X3)的3D响应面图
图6b Y=f(X2，X3)的等值线图
3 结 论
3.1 本文在单因素实验的基础上，将响应面法应用
于优化百华花楸提取物抗氧化活性的提取。实验结
果表明，乙醇浓度、料液比、超声温度的平方项和乙
醇浓度、超声温度以及料液比和超声温度的交互作
用对百华花楸提取物抗氧化活性的影响显著。说明
乙醇浓度、料液比和超声温度对百华花楸提取物抗
氧化活性的影响不是简单的线性关系。
3.2 回归分析和验证实验结果表明，此方法合理可
行。得到百华花楸提取物抗氧化活性提取的最佳条件
为：乙醇浓度81%，料：液为10：51，超声温度52℃。抗
氧化活性的实际值为33.2879（μmolTE/g）。
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（收稿日期：2015-03-30 编辑：蒋孟良）
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