全 文 ：228 2012, Vol.33, No.23 食品科学 ※生物工程
从天山花楸中分离筛选纤维素酶产生菌及其
酶学性质研究
付建红，任晓源，范秋霜，谢连珍，谢红桃
(新疆师范大学生命科学学院，新疆 乌鲁木齐 830054)
摘 要：从天山花楸茎、叶和果实中分离到53株内生细菌，利用刚果红初筛平板获得透明圈较大的4株菌，在此基
础上进行摇瓶复筛，得到一株产纤维素酶活力较高的菌株(S11)。该菌发酵培养12h，产羧甲基纤维素酶(CMCase)酶
活力最高达到39.47U/mL。该酶最适反应pH值为5.0，在pH 5.0～6.0范围内较稳定；最适反应温度为50℃，在50℃
以下酶的热稳定性较好，60～70℃几乎完全失活；各种供试金属离子与化学试剂对酶活性都有不同程度的抑制作
用，其中Ca2+、SDS和EDTA的抑制作用最强。
关键词：天山花楸；纤维素酶产生菌；酶活性；酶学性质
Screening of Cellulase-Producing Bacterium from Sorbus tianshanica and Enzymatic Characteristics
FU Jian-hong，REN Xiao-yuan，FAN Qiu-shuang，XIE Lian-zhen，XIE Hong-tao
(College of Life Science, Xinjiang Normal University, rmüqi 830054, China)
Abstract：Fifty-three endophytic bacteria were isolated from Sorbus tianshanica Rupr. stems, leaves and fruits. Four
colonies were surrounded by big transparent zones in congo red agar medium. A strain (S11) with higher cellulase activity
was isolated and cultured in shake fl asks for secondary screening. Maximum carboxymethyl cellulase (CMCase) activity
was found to be 39.47 U/mL after 12 h culture. The optimal reaction pH for crude CMCase solution was 5.0, and it revealed
high stability at pH 5.0–6.0. The optimal reaction temperature was 50 ℃, and its activity remained stable below 50 ℃ but
was almost completely lost at 60–70 ℃. The CMCase activity was inhibited by all tested metal ions and compounds, and
dramatically inhibited by Ca2+, SDS and EDTA.
Key words：Sorbus tianshanica Rupr.；cellulase-producing bacterium；cellulase activity；enzymatic characteristics
中图分类号：Q814.1 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2012)23-0228-04
收稿日期：2011-10-13
基金项目：新疆维吾尔自治区高校科研计划青年教师科研启动基金项目(XJEDU2009S68)；
新疆师范大学博士科研启动基金项目(XJNUBS0905)；新疆师范大学校级重点实验室开放基金项目(XJKL10-9)
作者简介：付建红(1970—)，女，副教授，博士，研究方向为特殊环境微生物资源的开发与利用。E-mail：fjh_719@163.com
天山花楸(Sorbus tianshanica Rupr.)是落叶灌木或乔
木，在分类上隶属于蔷薇科苹果亚科[1]。文献记载天山花
楸的药理作用始于《救荒本草》：味甘苦、性平，利肺
止咳、补脾生津。1980年载入《新疆维吾尔自治区药品
标准》(第一册)，天山花楸主治肺结核、哮喘、咳嗽、胃
炎、胃痛、VA和VC缺乏症[2-3]，其主要活性成分是黄酮
类化合物。目前国内外学者主要着重于天山花楸的繁殖
技术、植物化学成分及其提取工艺的研究[4-12]，而有关天
山花楸内生菌及其产生的活性代谢产物的研究却未见报
道。为保护植物资源，从天山花楸中分离产黄酮内生菌
具有重要的意义。采用酶法辅助提取银杏黄酮、甘草黄
酮的研究已见报道[13-14]，本实验室尝试使用由天山花楸内
生菌产纤维素酶菌株发酵液辅助醇水法提取黄酮，以提
高天山花楸内生菌代谢物中黄酮提取率。本研究通过从
天山花楸中筛选产纤维素酶内生菌，建立内生菌发酵液
应用于天山花楸黄酮提取的辅助技术，为内生菌纤维素
酶在黄酮提取中的应用提供方法和技术参考。
纤维素是自然界中最丰富的一种可再生资源，但是
由于降解困难，导致纤维素资源的利用率非常的低。纤
维素酶(Cellulase)是降解纤维素生成还原糖的一组酶的总
称。目前，纤维素酶已在医药、日用化工、废水处理、动
物食料的加工、谷物乙醇发酵、果汁制取、造纸及纺织工
业等各个领域得到应用，其前景十分广阔。近年来微生物
来源的纤维素酶的研究十分活跃，尤其是特殊环境中的纤
维素酶产生菌具有独特的酶学性质，扩大了纤维素酶的应
用范围。但是至今纤维素酶在工业上的应用还十分有限，
菌株产酶量低及较高的生产成本是主要的限制因素。因
此，筛选酶活高的野生菌株，对纤维素酶的工业化生产及
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纤维素类资源的开发利用都具有重要意义。
迄今为止，关于筛选产纤维素酶菌株的报道大多
限于从土壤或水体中分离的菌株[15-16]，尚未有从天山花
楸植物的内生菌中筛选产纤维素酶菌株的报道。内生
菌最初可能通过对植物细胞纤维素的降解，破坏植物
细胞壁，进入植物体内的，因此理论上很多内生菌能
够产生纤维素酶，能够利用植物组织中的纤维素为唯
一碳源 [17]。本研究从天山花楸内生菌中筛选出产羧甲基
纤维素酶的菌株S11，并对其酶学性质进行初步研究，以
期为该酶在实际中的应用提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与培养基
天山花楸采自新疆巴里坤天山南麓。
内生菌分离和保藏培养基采用牛肉膏蛋白胨培养基
(NA培养基)。
产纤维素酶菌株筛选培养基 (g)：CMC-Na 20、
Na2HPO4 2.5、KH2PO4 1.5、蛋白胨2.5、酵母膏0.5、琼脂
20，去离子水定容至1L，调节pH7.0～7.2，灭菌备用。
发酵培养基(g)：CMC-Na 10、蛋白胨10、酵母膏10、
NaCl 5，去离子水定容至1L，调节pH值至8.0，灭菌备用。
1.2 仪器与设备
3K30台式冷冻离心机 美国Sigma公司；UV-
4802H型紫外-可见分光光度计 上海尤尼柯仪器有限
公司；SW-SJ-IFD型超净工作台 上海博讯实业有限公
司医疗设备厂；ZHWY-200B恒温培养振荡器 上海普
城分析仪器制造有限公司；LRH-250生化培养箱 上海
一恒科学仪器有限公司。
1.3 天山花楸内生细菌的分离
选取长势好、无病害天山花楸植株的茎、叶、
果实，先用自来水冲洗干净，用滤纸吸干水分，然后
进行表面消毒处理。将茎截成长约1cm的小段，叶剪
成约0.5cm×0.5cm的小块。在经过紫外消毒的接种间
内，把剪好的材料置于75%的乙醇中浸泡1～5min(叶
片1min，茎、果实5min)，并用无菌水冲洗4次。再用
0.525g/100mL次氯酸钠浸泡7min，最后用无菌水冲洗5
次，用无菌滤纸吸干水分。用无菌刀片将表面消毒过的
花楸茎纵向切开，切面向下置于分离培养基上；也可小
心刮除茎外皮，转接到分离培养基上。果实削去表皮，
切成0.4cm×0.4cm×(0.2～0.3)cm的小块置于分离培养基
上。28℃条件下培养3～7d，样品和对照各设3个重复。
将0.1mL最后一次冲洗的无菌水涂布于分离培养基上培养
48h以上不长菌，可确定为表面消毒完全，分离到的是内
生菌。最后将分离到的内生细菌采用梯度稀释法和划线
法纯化、保存。
1.4 纤维素酶产生菌的筛选
将菌株点接于筛选培养基上，置于37℃培养箱中培
养48h，然后将质量浓度为1mg/mL刚果红溶液倒入培养
基中染色1h，弃去刚果红后，使用1mol/L NaCl溶液浸泡
脱色1h。若菌株周围有透明水解圈出现，则说明该菌株
产生纤维素酶。测量透明水解圈与菌落直径的比值，初
步确定产纤维素酶活性高的菌株。
1.5 摇瓶产酶实验
将筛选出的菌株分别接种于装有50mL发酵培养基的
250mL三角瓶中，37℃、150r/min振荡培养，定时取样测
定发酵液中的酶活力。
1.6 酶活力测定
摇瓶培养液于4℃、5000r/min离心30min，上清液即
为粗酶液。移取粗酶液0.5mL于试管中，加入含质量浓度
为1g/100mL CMC-Na的柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液1.5mL
作为底物，然后在50℃水浴锅中准确作用30min后，加入
1.5mL DNS试剂，沸水浴加热5min，立即用流水冷却，
并加入2mL蒸馏水，在分光光度计上于540nm波长处进行
比色测定，用对照管溶液调零后，测定各管吸光度。对
照管盛放同样处理的等量失活酶液，以扣除发酵液中的
还原糖。对照葡萄糖标准曲线，计算酶活力。在上述反
应条件下，单位时间每毫升酶液降解CMC-Na生成1μg葡
萄糖定义为一个酶活力单位，用U/mL表示。
2 结果与分析
2.1 产纤维素酶植物内生菌的分离、筛选
样品表面消毒鉴定结果显示，样品表面消毒彻底，
天山花楸的茎、叶在NA平板培养基上所生长的微生物为
植物内生菌。共分离到53株细菌。纤维素-刚果红培养基
初筛结果获得4株水解圈明显，出现早且直径较大的菌
株，编号分别为S4、S5、S9、S11，菌株S11产生的透明
水解圈见图1。
图1 菌株S11产生的透明水解圈
Fig.1 Transparent hydrolysis circle of strain S11
2.2 摇瓶复筛结果
以酶活力为指标对2.1节初筛所得4株菌进行摇瓶复
筛，酶活力高且发酵时间短的菌株为目标菌株，结果见
图2。S4和S5菌株产酶能力差异不大，酶活力增长速率较
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快，在发酵12h时酶活力为17.2～20.3U/mL，此后随着发
酵时间的延长，酶活力增长缓慢。菌株S9在发酵初期酶
活力较低，随着发酵时间的延长，酶活力随之上升。菌
株S11产酶能力明显高于其他菌株，发酵时间短且酶活力
较高，在发酵12h时酶活力达到最大，为39.47U/mL，因
此S11为所选菌株。
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
12 24 36 48
ᯊ䯈/h
䝊
⌏
࡯
/ (U
/ m
L)
S4 S9S5 S11
图 2 摇瓶复筛酶活力曲线
Fig.2 Cellulase activity during secondary screening
2.3 S11菌株所产纤维素酶的性质
2.3.1 pH值对纤维素酶活力的影响
用pH3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、10.6
的缓冲溶液配制质量浓度为1g/100mL CMC-Na的底物溶
液，加入酶液反应后，测定酶活力，结果见图3。酶作用
的pH值范围为5.0～8.0，最适pH值为5.0。此后，随着pH
值的增大，酶活力缓慢下降，表明菌株S11所产纤维素酶
是中性酶。
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
3 4 5 6 7 8 9 10 11
pH
䝊
⌏
࡯
/ (U
/ m
L)
图 3 pH值对纤维素酶活力的影响
Fig.3 Effect of pH on cellulase activity
2.3.2 pH值对纤维素酶稳定性的影响
0
20
40
60
80
100
120
3 4 5 6 7 8 9 10 11
pH
Ⳍ
ᇍ
䝊
⌏
࡯
/%
图 4 pH值对纤维素酶稳定性的影响
Fig.4 Effect of pH on the stability of cellulase
将酶液用不同pH值缓冲液稀释，在30℃条件下恒温
水浴1h，再用pH5.0的柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液适当稀
释，以未保温的相应pH值的稀释酶液为对照，测定相对
酶活力，结果见图4。酶在pH值5.0～6.0时较稳定，pH值
高于7.0时，酶活力下降较快，当pH值达8.0时，剩余酶活
力不到50%。
2.3.3 温度对纤维素酶活力的影响
将粗酶液与含1g/100mL CMC-Na的柠檬酸-柠檬酸三
钠缓冲液(0.05mol/L，pH 5.0)混合，分别在30、40、50、
60、70℃条件下反应30min，测定酶活力，结果见图5。
随着反应温度的升高，酶活力逐渐提高，当反应温度为
50℃时，酶活力达到最大值，此后酶活力随温度升高而
降低，所以菌株S11所产纤维素酶最适反应温度为50℃。
0
2
4
6
8
10
12
14
30 40 50 60 70 80
⏽ᑺ/ć
䝊
⌏
࡯
/ (U
/ m
L)
图 5 温度对纤维素酶活力的影响
Fig.5 Effect of temperature on cellulase activity
2.3.4 纤维素酶的热稳定性
将粗酶液分别置于30、40、50、60、70℃水浴锅中
保温10、15、20、30、35、40、50、60min，然后冷却，
在50℃条件下反应30min，测定酶活力，以未经过处理的
酶样为对照，计算相对酶活力，结果见图6。温度对酶活
力影响较大，在30、40、50℃保温30～35min时相对酶活
力比较稳定，此后随温度的升高相对酶活力急剧降低，
60℃保温15min和70℃保温10min后相对酶活力几乎为0。
0
20
40
60
80
100
120
0 10 15 20 30 35 40 50 60
ᯊ䯈/min
Ⳍ
ᇍ
䝊
⌏
࡯
/% 30ć
40ć
50ć
60ć
70ć
图 6 纤维素酶的热稳定性
Fig.6 Heat resistance of cellulase activity
2.3.5 金属离子和相关化学试剂对纤维素酶活力的影响
向酶促反应体系中添加不同的金属离子溶液和化学
试剂，使其终浓度达到10mmol/L(SDS和EDTA分别是
2g/100mL和5mmol/L)，在50℃反应30min后，测定酶活
力。以未加金属离子和化学试剂的酶液为对照，计算相
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对酶活力，结果见表1。所有供试金属离子与化学试剂
对酶活性都有不同程度的抑制作用，其中Ca2+、SDS和
EDTA的抑制作用最强。
表 1 金属离子对纤维素酶活力的影响
Table 1 Effects of metal ions and compounds on cellulase activity
金属离子 Ca2+ Mg2+ Fe2+ K+ Na+ Zn2+ Cu2+ Fe3+ Mn2+ SDS EDTA 对照
相对酶活力/% 37.2 60.7 65.4 85.4 56.7 72.5 55.3 50.4 59.4 36.9 45.5 100
3 讨 论
由于植物内生菌与植物的关系密切，同时能产生
丰富多样的活性物质，甚至会产生和其宿主植物相同或
相似的生物活性成分，因此从中发现新的有活性的化合
物潜力相当大，从植物内生菌中寻找抗病、抗肿瘤物质
以及特殊酶类具有深远意义。天山花楸生长在新疆伊犁
河谷，海拔高度1800～3000m左右的林地之中。在长期
的进化过程中天山花楸具备了较强的耐荫能力和一定的
耐瘠薄能力。此外，它对温度的适应范围比较广，可耐
受－35℃低温。因此，生长在这类特殊生境的药用植物
体内的内生菌在物种分布、代谢途径或代谢产物多样性
方面都有其特殊性。这类植物的内生菌可能产生多种新
奇生物活性物质，是潜在的、重要的微生物资源。
天山花楸植株生长缓慢，出种率和种子发芽率均较
低，种子育苗较难，并且天山花楸无性繁殖技术尚不成
熟，这些都限制了其直接利用和推广栽培。目前，有关
天山花楸内生菌的分离及其产生的活性物质研究尚未见
报道，本研究首次从天山花楸中分离出具有纤维素酶活
性的内生细菌。
经过初筛和复筛，本研究得到一株生产周期短、酶
活力较高的菌株S11。S11所产纤维素酶的最适反应温度
为50℃，并且在该温度以下酶的热稳定性较好。菌株S11
所产纤维素酶是中性酶，作用pH值范围广，可满足酶法
辅助提取天山花楸黄酮的工艺条件。虽然该酶的酶活力
距离应用的要求还有一定的差距，但可以通过诱变育种
和结合基因工程手段构建高效表达的工程菌，或者优化
发酵条件提高产量，以达到实际应用的目的。
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