全 文 ：北方园艺 2008(11):131 ～ 133 ·生物技术 ·
第一作者简介:张春芳(1982-),女 ,硕士, 现主要从事果树分子生
物学研究工作。
通讯作者:李天忠。 E-mail:litianzhong1535@163.com。
基金项目:国家自然科学基金资助项目(30671443);北京市重点实
验室资助项目。
收稿日期:2008-07-29
秋子梨等九个品种 S 基因型的鉴定
张春 芳 , 李 茂福 , 韩振 海 , 龙 慎山 , 李天 忠
(中国农业大学园艺植物研究所 ,北京 100094)
摘 要:根据梨 S基因高度保守区设计兼并引物 ,对各秋子梨品种的基因组进行 S基因特异
性扩增 、连接 、转化并测序 ,GenBank中比较后确定各品种的S基因型。9个供试品种的 S基因型
分别为:秋子梨中的`寒香 为S36Sx ,`苹香 为S1 S31 ,`南果梨为 S34S34 ,`金香水为S1Si ,`延边大
香水为 S31S36 ,`寒红为 S27S34 ,`小香水为 S29 S34 ,`花盖王为 S31 S31 S34S34 ,白梨中的`锦丰为
S19S34 。
关键词:秋子梨;自交不亲和性;S基因;S基因型鉴定
中图分类号:S 661.203.3 文献标识码:A 文章编号:1001-0009(2008)11-0131-03
我国是梨的原产地之一 ,拥有丰富的品种资源。大
多数梨品种表现为配子体自交不亲和性 ,极少数品种具
有自交亲和性现象。因此 ,鉴定不同梨品种的 S基因型
可为田间合理配置授粉树提供依据。迄今为止 ,鉴定并
报道已知 S基因型的梨品种绝大多数属于白梨 、砂梨和
西洋梨系统[ 1-2] ,对于起源于我国北部的秋子梨品种的 S
基因型的报道极少[ 3] ,目前仅发现并鉴定了`京白梨和
`早梨 18 S基因型为 S16S30和 S4S28 [ 2] ,而秋子梨的代表
品种如`南果梨 、`延边大香水 、`小香水 、`花盖王等
均缺乏关于 S基因型的相关研究。研究通过对基因组
DNA进行 S基因特异性 PCR扩增并测序 ,来鉴定部分
生产上栽培的秋子梨品种及具有秋子梨亲缘关系的品
种的 S基因型 ,为生产上合理配置授粉树提供依据 ,也
为深入开展自交不亲和遗传机制研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 植物材料
`寒香 、`寒红 、`苹香 、`金香水 、`延边大香水 、
`小香水 等品种采自吉林省果树研究所梨资源圃 , `南
果梨和`花盖王品种采自沈阳农业大学保存圃 ,`锦丰
品种采自中国农业科学院郑州果树研究所。其中 , `南
果梨 、`延边大香水 、`小香水是我国古老的地方品种;
`花盖王 是`花盖梨 的四倍体大果芽变;`寒香 、`苹
香 、`金香水 、`寒红 均为传统的秋子梨品种杂交后代 ,
亲本如表 2所示。
1.2 总 DNA提取和 PCR扩增
取幼嫩叶片液氮速冻后于-70℃低温下保存待用。
基因组DNA提取主要采用改良的CTAB 法[ 4] ,经1%琼
脂糖凝胶电泳检测后 ,于-20℃储存备用。
S-RNase基因特异性PCR及克隆测序:根据梨S基
因 DNA序列中高度保守区 C1和可变区下游的保守区
C3 ,设计合成一对简并引物 , `FTQQYQ 和`IIWPNV
见表 1[ 5] ,引物由上海申能博彩生物技术有限责任公司
合成。用提取的基因组 DNA为模板进行 PCR扩增 ,反
应条件参照谭晓风等的方法[ 6] 。PCR扩增产物用 1.5%
琼脂糖凝胶电泳分离 ,切胶回收目的条带。回收产物连
接到 pMD18-T 载体上 ,转化大肠杆菌 ,经菌落 PCR鉴
定 ,挑取阳性克隆测序。测序由北京诺塞基因组研究中
心有限公司完成。
1.3 限制酶酶切与鉴定
特异片段序列分析及 S基因型确定:用国家生物技
术信息中心(NCBI)的Blast软件对所测得 S基因序列进
行检索 ,根据相似程度 ,确定测序结果的 S基因名称 ,从
而确定供试梨品种的S基因型。
南果梨的 PCR扩增产物用限制性内切酶 DraⅠ和
EcoRⅤ在37℃温度下进行酶切3 h ,酶切产物用2%琼脂
糖凝胶电泳进行鉴定。
1.4 品种 S基因型的特异性验证
根据测序结果以及 GeneBank登录的基因序列设计
S单元型特异性引物(见表 1),对用兼并引物扩出的结
果进行进一步的验证。
2 结果与分析
2.1 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳分离
由图 1中可知 , `锦丰 、` 苹香 、` 延边大香水 在
300～ 500 bp之间有 2条扩增条带。`南果梨 、`寒红 、
`小香水 、`花盖王 和`金香水 在 300 ～ 400 bp之间处
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·生物技术· 北方园艺 2008(11):131～ 133
有一条扩增条带 ,`寒香 在510 bp在有一条扩增条带。
表 1 研究所用的引物序列
引物名称 引物序列 5′-3′ 备注
PuS1SpF GATCATGTAGGCTTCTGGGAA
PuS1SpR CAACCAATTCAGTCGTCGTCCT
PuS29 SpF GCAAGAATACAACCATTACTCCTC
PuS29SpR CAGAAAAATTGTGATTGTGAGCC
PuS27 SpF CAGCTGTGGGTATCCCGCAATAAT
PuS27SpR AATCGGCCGGGCAGAGATATG
PuS19 SpF ATACTCGAACCCCAGTTGGT
PuS19SpR AATATCGTGATCCTTGTGGAAA
PuS iSpF CAATCCGCCAATAATGAACGACAC
PuSi SpR CAACCAATTCTGTCACCCCACCATTA
PuS34 SpF TATTATTCATAGGGGATGACGG
PuS34SpR TTCCACGCATTATTCAATCCTAT
FTQQYQ TTTACGCAGCAATATCAG Ishimizu等 ,1999
anti-(I/M)IWPNV ACGTTCGGCCAAATA /CATT
图 1 梨品种 S 基因兼并引物扩增的琼脂糖凝胶电泳图
注:1.寒香;2.苹香;3.南果梨;4.金香水;5.延边大香水;6.寒红;7.小
香水;8.花盖王;9.锦丰;M.Markers。
2.2 S基因型的鉴定与分析
将PCR扩增产物经凝胶分离后回收 ,克隆并测序。
在GenBank中与其它已登录的 S基因核酸酶序列进行
比对 ,以确定各个品种的 S基因型。其中`寒红 、`小香
水 、`花盖王的第一条带扩增较弱 ,经过切胶回收进行
二次扩增后测序 , `金香水 经过多个克隆测序 ,分别获
得2个 S基因序列。根据相似程度确定这些品种的 S
基因型为:`锦丰为 S19S34 , `苹香 为 S1S31 , `金香水为
S1S i ,`延边大香水为 S31S36 ,`寒红为 S27S34 ,`小香水
为S29S34 。
图 2 梨品种S 基因特异性扩增的琼脂糖凝胶电泳图
注:1.寒香;2.苹香;3.南果梨;4.金香水;5.延边大香水;6.寒红;7.小
香水;8.花盖王;9.锦丰;M.Markers。
表 2 9个梨品种的 S基因型
品种 S基因型 片断大小/bp NCBI登录号 亲本
寒香 S36Sx 536/ x DQ417607.1/ 延边大香水×苹香
苹香 S1S31 367/345 DQ515793.1/
DQ124366.1 苹果梨×延边谢花甜
南果梨 S34Sx 341/ x DQ269500.1/ 地方品种
金香水 S1S i 367/361 DQ515793.1/
AF518319.1 香水梨×苹果梨
延边大香水 S31S36 345/536 DQ124366.1/
DQ417607.1 地方品种
寒红 S27S34 352/341 EF643640.1/
DQ269500.1 南果梨×晋酥
小香水 S29S34 347/341 AY601098.1/
DQ269500.1 地方品种
花盖王 S31 S31S34S34 341/ 341/
345/345
DQ124366.1/
DQ269500.1
花盖梨的四倍
体大果芽变
锦丰 S19S34 444/341 EF643638.1/ DQ269500.1 苹果梨×茌梨
2.3 品种 S基因型的特异性验证
测序结果通过Blast软件分析后 ,在Genebank中找
到该基因的全长序列后分别设计 S 单元型特异性引物
(见表1),来进一步的验证所得结果。如图 2所示 ,PuS1
SpF和 PuS1SpR只在`苹香和`金香水 中有扩增 ,表明
含有 S1基因型;PuS19SpF 和 PuS19SpR只在`锦丰 中有
扩增;PuS27 SpF 和 PuS27 SpR只在`寒红 中有扩增;
PuS29SpF 和 PuS29 SpR只在`小香水 中有扩增;PuS i
SpF和 PuSiSpR只在`金香水 中有扩增;PuS34 SpF 和
PuS34SpR能在`南果梨 、`寒红 、`小香水 、`花盖王和
`锦丰 中都有扩增 ,表明含有 S34基因型。这与用兼并
引物扩增的结果一致。
图 3 南果梨的 DraⅠ、EcoRⅤ酶切图谱
`寒香 (S36 Sx)是`延边大香水 (S31S36)和`苹香
(S1S31)的杂交后代[ 7] ,通过特异性引物扩增的方法只扩
增出一条带 ,即 S36 ,但通过亲本可以推断它的另外一个
S 基因可能是 S1 。同时 ,由于杂交过程中可能存在自交
亲和 ,因而另外一个 S 基因还可能是 S36或 S31 ,而同样
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的引物在`苹香和`金香水 中扩出 S1 ,在`苹香 、`延边
大香水和`花盖王 中可扩出 S31 ,却未能在寒香中扩增
出来 ,因此 ,寒香的 S基因型有可能是S31S36 。
`寒红 (S27 S34)是`南果梨 (S34Sx)的杂交后代 ,与
S基因型鉴定相符合 ,其中`寒红的S34基因应该是来自
`南果梨 。但是 ,特异性引物扩增得不到`南果梨的另
一个 S基因。通过 S34等位基因的限制性内切酶 DraⅠ和
EcoRⅤ均能将此片段切开 , 酶切产物大小分别为 250 、
91 bp和215、126 bp的片段 , 符合 S34等位基因被切割
的情况(图 3)。另外 ,张茂君等杂交试验证明:`南果梨
(S34Sx)和`寒红(S27S34)之间授粉表现为单向亲和[ 8] ,
即`南果梨 (S34Sx)×` 寒红 (S27S34)的坐果正常 ,花序
坐果率为 93.3%;反交则表现不亲和 ,坐果率为0。以上
结果可以初步推断`南果梨的 S 基因型可能为 S34S34 ,
即纯和体。`花盖王 是从`花盖梨中选出四倍体芽变
品种[ 9] ,因此 ,应为同源四倍体 ,而测序结果为 S34S31 ,则
它的 S基因型可能为 S34S34S31S31 。
3 讨论
通过 S-RNase基因特异性 PCR扩增及克隆测序 ,
直接确定了`苹香 、` 金香水 、`延边大香水 、`寒红 、
`小香水 、`锦丰等 7个品种的S基因型。并推测出`寒
香 、`南果梨和`花盖王 的S基因型。`南果梨 、`延边
大香水 、`小香水 是我国古老的地方品种 ,菊池秋雄等
人认为 ,我国华北和东北地区栽培的梨品种 ,均源出于
秋子梨 ,他把属于白梨系统的部分品种归于秋子梨的另
一个变种[ 10] 。根据汪先甫等人对果树进化的推断 ,秋子
梨和白梨在是平行演化的[ 11] 。通过对部分秋子梨代表
品种的 S基因鉴定发现 ,原始的秋子梨品种存在的 S基
因型是白梨系统中常见的 S基因型 ,同时并未在秋子梨
品种发现新的S基因型。因此 ,秋子梨和白梨可能在自
交不亲和基因分化完成后才发生的演化过程。
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Identification of S-genotypes of Ussurian Pear Cultivars
ZHANG Chun-fang , LI Mao-fu , HAN Zhen-hai , LONG Shen-shan , LI Tian-zhong
(Institute of Horticultural Plants , China Ag ricultural University , Beijing 100094 , China)
Abstract:Partial S-RNase genes of Ussurian pear were amplified and cloned by using tw o pairs of primers based on the
conserved regions of pear S-RNase structure in nine cultivars of unknown S-genotypes.The PCR products were
sequenced and compared in GenBank.The S-genotypes of the nine tested cultivars were identified as follows :`Hanxiang
was S36Sx ,`Pingxiang was S1S31 ,`Nanguoli was S34S34 , J`inxiang shui was S1S i , `Yanbian Daxiangshui was S31S36 ,
`Hanhong was S27S34 ,`Xiaoxiangshui was S29S34 ,`Huagaiw ang was S31S31S34S34 , J`infeng was S19S34 .
Keywords:Ussurian pear(P.ussuriensis Maxim);Self-incompatibility;S-RNase genes;S-genotyping
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