全 文 ：经测定 , 提取液中的生物碱含量较酸水提取液中低。加之考
虑到制成 pH敏感凝胶剂的成型需要 , 因此选用盐酸水溶液
为提取溶剂 , 盐酸加入量为 2 mL盐酸 /7 g生药。
4.2.2 水提取复方中吴茱萸药材所含挥发油的问题 , 由于
现代药理研究表明 , 左金丸的主要有效部位为总生物碱类 ,
因此挥发油的提取与否有待下一步研究。
参考文献:
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超声萃取元宝枫总黄酮及其抑制 FAS的研究
李 , 陈钧坚 , 张英侠
(首都医科大学化学生物学与药学院 ,北京 100069)
收稿日期:2007-09-12
基金项目:国家自然科学基金资助项目(No.30500648);北京市教育委员会发展计划面上项目(No.KM200610025006)。
作者简介:李 (1974-),女 ,讲师 ,研究方向:天然产物有效成分分离和分析 ,电话:010-83911522, E-mail:junily88@sohu.com。
关键词:元宝枫;总黄酮;FAS抑制剂
中图分类号:R284.2 文献标识码:B 文章编号:1001-1528(2008)10-附 2-03
元宝枫(AcerTrunctumBunge),又名五角枫 , 系槭树科槭
属植物 , 广泛分布在我国的大江南北。元宝枫因翅果形状象
中国古代 “金锭”而得名。元宝枫叶中含有黄酮 、强心苷 、绿
原酸 、甾体 、鞣质和多糖等多种生物活性成分。大量研究表
明 , 黄酮类化合物具有清除自由基 、抗氧化 、抗突变 、抗肿瘤 、
抗菌 、抗病毒和调节免疫 、防治血管硬化 、降血糖等功能 [ 1] 。
还有许多黄酮类化合物被证明有抗 HIV病毒活性 [ 2, 3] 。总
黄酮的提取方法主要有有机溶剂回流法 、冷浸法 、超声波提
取法 、渗漉法和水煮法等 [ 4] 。黄酮类化合物在植物体内存在
形式不同对应的生物活性也有不同 ,探索简单 、高效地提取
具有生物活性的相关黄酮类化合物可以提高植物的利用率。
脂肪酸合酶(EC2.3.1.85, fatyacidsynthase, 缩写 FAS)
是体内合成脂肪途径中一个很重要的酶 ,它通过催化乙酰辅
酶 A(Acetyl-CoA)和丙二酰辅酶 A(Malonyl-CoA)生成长链
脂肪酸。 90年代以来 , 相关的基础研究发现动物脂肪酸合
酶在癌症中起着重要作用。J.Hopkins大学的学者综述了近
年来国际的众多研究成果 , 提出了肿瘤生物学的新观点 , 指
出脂肪酸的合成和侵犯型肿瘤的生长 、存活存在一定关系 ,
该酶是治疗癌症的新的潜在靶部位 , 抑制 FAS有可能成为
一条新的化疗途径 [ 5, 6] 。
研究元宝枫叶中主成分之一的黄酮类化合物是否与抑
制 FAS存在一定的相关性 , 可以促进元宝枫叶中黄酮的分
离和利用。本文设计了元宝枫叶乙醇超声提取的正交实验 ,
探索采用最佳提取方法所得的提取液中黄酮类化合物含量 ,
及其对 FAS的抑制率的大小 , 并对两者的相关性进行了比
较研究 , 为元宝枫叶的开发利用和筛选 FAS天然抑制剂提
供科学依据。
1 仪器与材料
1.1 仪器
FZl02型微型植物试样粉碎机(河北省黄骅市齐家务科
学仪器厂);超声清洗机;TGL-16G台式离心机(上海安亭科
学仪器厂);紫外-可见分光光度计(SHIMADZUUV2550)。
1.2 材料
芦丁(购自中国药品生物制品检定所);NaNO2 、A1
(NO3)3 、NaOH、KH2PO4、K2HPO4和乙醇为分析纯;Acetyl-
CoA、Malonyl-CoA、NADPH(购自 SIGMA公司);水为双蒸水;
元宝枫落叶采自北京百望山。
2 方法与结果
2.1 正交实验设计 正交实验采用正交表 L9(33)。以黄
酮类化合物含量和对 FAS的抑制率为考察指标 , 以超声时
间 、溶剂浓度 、固液比为考察因素 , 三水平实验方案见表
1[ 7] 。
表 1 正交实验因素水平设计
水平因子 A乙醇浓度 /% B料液比 C时间 /min
1 60 1:08 10
2 70 1:14 20
3 80 1:20 30
2.2 工艺过程设计 取 3 g元宝枫树叶粉末置于锥形瓶
中 ,根据正交表排列条件各自按 B比例加入 A浓度的酒精 ,
置于超声清洗机中 , 超声 C时间(min), 每隔 5 min搅拌一
次。完毕后 ,在室温放冷备用。
2.3 黄酮类化合物含量的测定
2附
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Vol.30 No.10
2.3.1 配制标准溶液:精密称取芦丁标准品 13.20 mg, 用
50%的乙醇溶解 , 全部转移到 50 mL量瓶中 , 并定容 ,摇匀。
2.3.2 绘制标准曲线并测样品浓度:精密量取对照品溶液
0.5, 1.5, 2.5, 3.5, 4.5mL, 分别置于 25mL量瓶中 ,加 5%的
NaNO2水溶液 1.0 mL摇匀 , 6 min后加 10%的 Al(NO3)3水
溶液 1.0 mL摇匀 , 6min后 ,再加 4%的 NaOH水溶液 10 mL
摇匀。 15 min后用 50%的乙醇定容 , 摇匀。同时做空白液。
在 505 nm下测定吸光度 , 以浓度为横坐标 , 吸光度为纵坐
标 , 绘制标准曲线。得方程:
A=0.011 95C-0.005 42 R2 =0.999 42
2.3.3样品供试液的配制及黄酮含量的测定:取 1.5 mL9个
样品液离心 5 min转速为 8 000 r/min。分别精密量取上清
液 200μL于 25 mL量瓶中 , 加 5%的 NaNO2水溶液 1.0mL,
6 min后 , 加 10%的 A1(NO3)3 水溶液 1.0 mL, 6 min再加
4%的 NaOH水溶液 10 mL。 15 min后用 50%的乙醇定容 ,
摇匀。同时做空白液。 在 505 nm下测定吸光度 , 并根据标
准曲线计算出黄酮含量。
2.4 对 FAS抑制活性的测定 在 2 mL测活体系中加入
1.85mL0.1mol/L, pH7.0, KH2P04-K2HP04缓冲液 , 37 ℃恒
温 ,再依次加入 25μLAcetyl-CoA(0.2 mM)、 50 μLMalonyl-
CoA(0.4mM), 50μLNADPH(1.3 mM),在一定提取液存在
下 ,加入 10μgFAS启动酶促反应 ,并于 340 nm波长下测定
NADPH每分钟吸光度的变化作为酶活性指标。测定不同提
取液量对 FAS的抑制程度 ,根据提取物浓度-抑制率曲线 ,由
料液比可计算出折合成干叶的质量 , 把添加了抑制剂之后的
活度减去酶活(22)再除以原酶活即得 Δa, 除去干叶质量可
计算出单位量叶子的抑制性。
2.5 黄酮含量测定结果 本实验所得数据如表 2、3, 测定
了总黄酮的含量 ,将正交表中数据进行统计处理 , 由极差分
析结果表明 , 3个因素对提取效果影响的大小顺序为:B>A
>C。由方差分析结果表明 , 3个因素对黄酮含量都没有显
著影响 ,而且发现 B因素的 R值比误差的 R值小 , 说明此因
素可忽略。根据实验结果和方差分析 , 最佳的提取条件是
A3B3C2 ,即乙醇浓度为 80%, 固液比为 1∶20,提取 20 min。
表 2 黄酮含量分析结果
水平因子 A乙醇浓度 /% B料液比 C时间 /min D误差 总黄酮 /mg
1 1 60 1 1∶8 1 10 1 76.584
2 1 60 2 1∶14 2 20 2 85.359 75
3 1 60 3 1∶20 3 30 3 98.617 5
4 2 70 1 1∶8 2 20 3 84.498
5 2 70 2 2∶14 3 30 1 101.592 8
6 2 70 3 1∶20 1 10 2 86.67
7 3 80 1 1∶8 3 30 2 90.402
8 3 80 2 1∶14 1 10 3 100.238 3
9 3 80 3 1∶20 2 20 1 132.555
I 260.561 25 251.484 263.492 3 310.731 8
I 272.760 75 287.190 75 302.414 28 262.431 8
II 323.195 25 317.842 5 290.612 3 283.353 8 T=856.517 3R 62.634 66.358 5 38.920 5 48.3
S2 735.053 838 5 735.328 033 265.505 7 391.130 6
表 3 黄酮含量方差分析表
因素 离差平方和 自由度 S2 F值 显著性
A 2205.161 516 2 735.0538 1.879 306
B 2205.984 099 2 735.328 1.880 007
C 796.517 173 5 2 265.5057 0.678 816
D 1173.391 656 2 391.1306
F(3, 3)=9.28
2.6 酶活测定结果 本实验所得数据见表 4、5, 由极差分析
酶活数据得 , 3个因素对酶活影响的大小顺序为 B>A>C,
结果表明 B因素存在显著性 , 其他两个因素都没有显著影
响。根据实验结果和方差分析 , 最佳条件是 A1B3C3 , 即乙醇
浓度为 60%, 固液比为 1∶20,提取 30min。
2.7 综合分析结果 数据见表 6, Δa/干叶以 10为标准 ,每
多 0.25 g就加 1分 , 每少 0.25 g就减 1分;总黄酮以 100 mg
为标准 , 每多 1mg就加 1分 ,每少 1mg就减 1分 , 进行分析。
结果表明 , 最佳条件为 A3B3C3 , 即乙醇浓度为 80%, 固液比
为 1∶20, 提取 30 min。
2.8 验证实验结果 按实验最佳条件进行验证实验 , 分析
见表 7,优化提取条件各项指标均达到正交实验表中结果的
较高值。
3 讨论
3.1 本实验运用正交设计 ,通过方差分析 , 得到黄酮的最佳
提取工艺条件是乙醇浓度为 80%, 固液比为 1∶20, 提取 20
min。
3.2 本实验运用正交设计 ,通过方差分析 , 得到 FAS抑制剂
的最佳提取工艺条件是乙醇浓度为 60%, 固液比为 1∶20,提
取 30min。
3.3 运用综合评定法分析得最佳条件为乙醇浓度为 80%,
固液比为 1∶20, 提取 30 min。
3.4 本实验表明提取黄酮最佳条件和对 FAS的抑制最佳条
件并不完全一致 ,但固液比都是越大越好 , 而乙醇浓度和时
间都各有最佳。说明元宝枫叶提取物中黄酮类物质的含量
与对 FAS抑制效果之间不是正相关 , 表明只有一部分黄酮类
成分对 FAS有抑制作用。
3附
2008年 10月
第 30卷 第 10期
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表 4 对酶抑制的分析结果
水平因子 A乙醇浓度 /% B料液比 C时间 /min D误差 Δa/干叶
1 1 60 1 1∶8 1 10 1 13.866 81
2 1 60 2 1∶14 2 20 2 18.328 74
3 1 60 3 1∶20 3 30 3 26.009 01
4 2 70 1 1∶8 2 20 3 12.537 5
5 2 70 2 1∶14 3 30 1 16.737 07
6 2 70 3 1∶20 1 10 2 17.788 27
7 3 80 1 1∶8 3 30 2 13.027 24
8 3 80 2 1∶14 1 10 3 15.267 83
9 3 80 3 1∶20 2 20 1 21.111 55
I 58.204 56 39.431 54 46.922 91 51.715 42
I 47.062 84 50.333 64 51.977 79 49.144 26
II 49.406 62 64.908 83 55.773 32 53.814 33 T=154.674
R 11.141 72 25.477 28 8.850 409 4.670 077
S2 23.003 88 108.931 5 13.143 06 3.647 327
表 5 对酶抑制的方差分析
因素 离差平方和 自由度 S2 F值
A 69.011 64 2 23.003 88 6.307 052
B 326.794 5 2 108.931 5 29.866 12 ＊
C 39.429 18 2 13.143 06 3.603 477
D 10.941 98 2 3.647 327
F(3, 3)=9.28
3.5 近年来 , 超声技术应用于提取植物中的生物碱 、苷类 、
生物活性物质 、动物组织浆的毒质等研究已有报道 , 表明其
具有能耗低 、效率高 、不破坏有效成分的特点。 很多研究表
明 , 利用超声波产生的强烈振动 、高的加速度 、强烈的空化效
应 、搅拌作用等 ,可加速植物材料中的有效成分进入溶剂 ,从
而增加有效成分的提取率 , 缩短提取时间 , 并且还可避免高
表 6 综合分析
因子水平 A乙醇浓度 /% B料液比 C时间 /min D误差 Δa/干叶 总黄酮 /mg 评分
1 1 60 1 1∶8 1 10 1 13.866 81 76.584 -7.948 77
2 1 60 2 1∶14 2 20 2 18.328 74 85.359 75 18.674 72
3 1 60 3 1∶20 3 30 3 26.009 01 98.617 5 62.653 53
4 2 70 1 1∶8 2 20 3 12.537 5 84.498 -5.352 02
5 2 70 2 1∶14 3 30 1 16.737 07 101.592 8 28.541 02
6 2 70 3 1∶20 1 10 2 17.788 27 86.67 17.823 09
7 3 80 1 1∶8 3 30 2 13.027 24 90.402 2.510 968
8 3 80 2 1∶14 1 10 3 15.267 83 100.238 3 21.309 57
9 3 80% 3 1∶20 2 20 1 21.111 55 132.55 5 77.001 19
I 73.379 48 -10.789 8 31.183 88 97.593 44
I 41.012 09 68.525 31 90.323 9 39.008 78
II 100.821 7 157.477 8 93.705 52 78.611 09 T=154.67 T=856.517 3 T=215.213 3
R 59.809 64 168.267 6 62.521 64 58.584 66
S2 597.546 4 4 724.159 824.21 46 595.648 4
注:Δa/干叶以 10为标准 ,每多 0.25g就加 1分 ,每少 0.25g就减 1分;总黄酮以 100mg为标准 ,每多 1mg就加 1分 ,每少 1mg就减 1分。
表 7 验证数据分析
编号 A乙醇浓度 /% B物料比
C时间
/min
黄酮含量
/mg Δa/干叶
1 80 1:20 30 104.355 22.300 9
2 80 1:20 30 107.947 5 22.563 3
3 80 1:20 30 104.767 5 21.776 2
温对提取成分的影响 [ 8 , 9] 。超声波可以强化乙醇浸提法 , 达
到省时 、高效 、节能的目的 , 此方法采用全物理过程 ,无任何
污染 , 是一条理想的提取黄酮类物质的途径 , 具有广阔的应
用前景。
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4附
2008年 10月
第 30卷 第 10期
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超声法提取水蓼中总黄酮的工艺研究
蔡 玲 , 李爱阳
(湖南工学院化工系 ,湖南 衡阳 421008)
收稿日期:2007-09-23
作者简介:蔡 玲(1967-),女 ,硕士研究生 ,研究方向:天然产物化学 ,电话:13317348608, E-mail:clingcling2008@163.com。
关键词:水蓼;总黄酮;正交试验;超声
中图分类号:R284.2 文献标识码:B 文章编号:1001-1528(2008)10-附 5-02
水蓼 PolygonumhydropiperL.一年生草本 , 生于水边 、路
旁湿地。我国南北各地均有分布 [ 1] 。水蓼可以治疗血消症 ,
消积止痛 , 可用于症瘕痞块 、瘿瘤肿痛 、食积不消 、胃脘胀痛。
其应用历史悠久 , 我国许多古书 、药典都有其功用主治的记
载。例如:水蓼:《别录》:“蓼叶 , 归舌 , 除大小肠邪气 , 利中
益志” 。 《唐本草》:“主被蛇伤 , 捣敷之;绞汁服 , 止蛇毒入腹
心闷;水煮渍脚 ,消脚气肿。” 水蓼:《本经》:“主明目 , 温中 ,
耐风寒 , 下水气 ,面目浮肿 ,痈疡。” 《药性论》:“归鼻。 除肾
气 , 兼能去疬疡。”等 [ 2 , 3] 。本实验采用单因素和正交实验方
法系统地研究了超声波法提取水蓼总黄酮的最佳提取工艺 ,
并与常规的乙醇回流提取进行了比较 ,以期为水蓼中总黄酮
开发利用提供理论依据。
1 材料 、试剂与仪器
1.1 材料与试剂
水蓼茎和叶(购于上海金山张堰);芦丁标准品(购自中
国药品生物制品检定所;H14023525, );亚硝酸钠 、氯化铝 、
氢氧化钠均为分析纯;95%乙醇 ,湖南师大试剂厂。
1.2 实验仪器
仪器:756型紫外-可见分光光度计 , 上海精密科学仪器
有限公司;恒温水浴锅 , 武汉琴台医疗器械厂;粉碎机;SHI-
MADZUAY120型分析天平(日本岛津制作所)。
2 实验方法
2.1 总黄酮的含量测定
参考有关总黄酮含量测定的方法 [ 4-7] , 精确称取 10 mg
已烘干至恒重的芦丁标样 , 以 60%乙醇溶液超声溶解并定
容至 50mL摇匀即得浓度为 0.2 mg/mL芦丁标准液。 对芦
丁标准液显色后用 1 cm比色皿在波长 400 ～ 700 nm区间扫
描 , 确定最大吸收波长为 510nm。
准确移取芦丁标准液 0.0、1.0、2.0、 3.0、 4.0、 5.0 mL分
别置于 25 mL量瓶中 , 各加入 5% NaNO2溶液 1.0 mL, 摇
匀 ,放置 6 min,加 10% AlCl3溶液 1.0mL,摇匀 , 放置 6 min,
再加入 4% NaOH10.0 mL,最后用 60%乙醇溶液稀释至刻
度 ,摇匀 , 放置 15 min, 试剂空白为参比液 ,在 510 nm处测定
吸光度 ,绘制标准曲线。
用最小二乘法进行线性回归 , 得到回归方程为:A=
0.003 16+10.154 07ρ, RSD=0.52%, 回归系数 r=0.9996。
2.2 提取实验方法
2.2.1 乙醇提取法
将干燥的水蓼粉碎后 , 准确称取 10 g, 加入 150 mL60%
的乙醇溶液 , 在 85℃下回流提取 2次 ,每次 2h, 冷却后 ,减压
抽滤浓缩至 20 mL, 再用 60%的乙醇定容到 100mL。吸取 3
mL, 置于 25 mL比色管中 , 加入 5%亚硝酸钠溶液 1 mL, 摇
匀 ,放置 6 min, 加 10%氯化铝溶液 1 mL, 摇匀 , 放置 6 min,
再加入 4%氢氧化钠 10.0mL,最后用 60%乙醇溶液稀释至
刻度 ,摇匀 , 放置 15 min, 测定吸光度 [ 8] 。
2.2.2 超声提取法
将 1g水蓼粗粉用一定浓度体积的乙醇作溶剂 , 预泡 24
h, 超声波提取一定的时间 , 取出过滤 ,得到提取的样品溶液 ,
测定浸取液吸光度 ,并计算黄酮提取率。考虑到本实验室的
超声发生器的频率是固定的(100赫兹), 本试验主要用单因
素实验和 L9(33)正交实验讨论乙醇浓度 、超声波提取时间 、
料液比对水蓼中总黄酮得率的影响。
总黄酮含量的测定:以芦丁为标样 , 采用亚硝酸钠-三氯
化铝比色法 , 在可见光 510 nm处测定其吸光值。 提取率
(%)=(黄酮类化合物质量 /干物料质量)×100%。
5附
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第 30卷 第 10期
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