全 文 ：第 33卷 第 2期 东　北　林　业　大　学　学　报 Vo .l 33 No. 2
2005年 3月 JOURNAL OF NORTHEAST FORESTRY UN IVERSITY M ar. 2005
花楸嫩叶和茎段的愈伤组织诱导 1)
　　　王爱芝　沈海龙　黄　剑　　李长海　　　　 范少辉
(东北林业大学 ,哈尔滨 , 150040)　　　　(黑龙江省森林植物园)　　(中国林业科学院林业研究所)
　　摘　要　以花楸嫩叶和茎段为外植体 , 在添加 BA、TDZ、 IBA、NAA、2, 4 -D组成的不同激素组合的 MS培养基
上培养 , 以诱导愈伤组织。以幼嫩的茎段为外植体时 , 从愈伤组织的诱导率 、体积和生长状态综合考虑 , 得出生长
素的效应为 NAA>2, 4 - D>IBA;最佳激素种类组合为 NAA1. 0 m g /L+BA0. 5 ～ 3. 0 m g /L、2, 4 - D1. 0 m g /L+
BA0. 5 ～ 3. 0 mg /L或 TDZ0. 01 ～ 0. 5 mg /L。以幼嫩的叶片为外植体时, 虽然诱导率可达 100%,但只是在切口处长小
米粒大小的愈伤组织 ,生长素的诱导效应大小为 2, 4 -D>NAA >IBA,最佳激素组合为 2, 4 - D1. 0m g /L+BA0. 5 ～
3. 0m g /L。将初代培养的愈伤组织转入增殖培养基 ,增殖效果都非常好 , 4周后愈伤组织长满培养瓶。
关键词　花楸;嫩叶;茎段;愈伤组织;激素组合
分类号　Q949. 751. 8;S722. 37
Callus Induction from Tender Leaf and Stem Segm ent Exp lan ts of Sorbus pohuashanensis /W ang A izh i, Shen
H ailong, Huang Jian(Northeast Fore stry University, H arbin 150040, P. R. Ch ina);L i Changha i(Fo rest Bo tan ica l Gar-
den of H eilong jiang P rovince);Fan Shaohu i(Research Institu te of Forestry, Ch inese A cademy o f Fo restry) / /Jou rna l o f
No rtheast Fo restry Un ive rsity. -2005, 33(2). - 12 ～ 14
Tender lea f and stem segment ofSorbus pohuashanensis were cu ltured fo r ca llus induction onMSmedium supplemented w ith
diffe ren t hormone combinations including BA, TDZ, IBA, NAA and 2, 4 -D. Conside ring synthetically from the induc tion rate,
vo lume and grow th status o f ca llus, we ob ta ined that the effec t sequence o f auxin w as NAA>2, 4 -D>IBA and the optimum
ho rm one com bination was 1. 0 mg /L NAA+0. 5～ 3. 0mg /L BA, 1. 0mg /L 2, 4 -D+0. 5 ～ 3. 0mg /L BA or 0. 01 ～ 0. 50m g /L
TDZ when tender stem segm entw as taken as explants. A lthough the induction rate could reach 100%, the ca llus was ve ry sma ll
and induced only from the cut when tende r leaf w as taken as explants. The effect sequence of auxin was 2, 4 -D>NAA >IBA
and the op timum hormone combination was 1. 0m g /L 2, 4 -D+0. 5～ 3. 0mg /L BA. When the callus in first culturew as trans-
ferred on to pro lifera tion medium , they wou ld becom e full of bo ttle afte r fourweeks.
K ey words　Sorbus pohuashanesis;Tender lea f;Stem segm en t;C allus;H orm one combination
　　花楸 (Sorbus pohuashanesis Hedl)一般采用播种繁殖 , 人
们在生产实践中已经积累了一些关于种子的采集 、处理 、播
种 、抚育管理 、病虫害防治等方面的一些经验 [ 1 ～ 5] 。但花楸实
生苗生长周期长 、成型慢 ,且采种母树不足(林内散生 ), 果实
收集困难 , 出种率仅为 1%[ 1] , 种子发芽率 (出种率与发芽率
有何区别)低 ,出苗率不稳定。近些年来 , 有人对花楸扦插作
了探索性试验 [ 6] , 但目前尚未达到最佳生根率。 因此 , 笔者
尝试通过组织培养手段来繁殖和培育花楸苗木 , 以期找到诱
导愈伤组织的最佳激素组合 , 进而找到适合愈伤组织分化的
培养基 , 诱导出不定芽 ,然后伸长生长 、生根 , 培育成植株。
1　试验材料的采集与处理
试验材料分别于 2003年 5月 7日 、16日取自黑龙江省森
林植物园内约 20年生的生长良好的 20株花楸树上及其基部
的萌生条上。
接种前将采回的材料放在加有少量水的烧杯里 , 使小枝
切口浸入水中 , 用蒸馏水喷洒叶面 , 然后用牛皮纸蒙盖烧杯
口 , 以防水分散失 ,置于冰箱内 4℃下临时贮存。
1. 2　研究方法
1. 2. 1　外植体消毒和切割
将茎段和叶子用蒸馏水冲洗干净 , 用 75%酒精消毒 30 ～
60 s,然后加数滴吐温 -20, 用 3%H2O 2溶液分别搅拌消毒 4、
3 m in, 在超净工作台下用无菌水冲洗 ,直到干净为止。将茎段
剪成 0. 5 ～ 1. 0 cm长的小段 ,将叶子沿着距离主脉两侧 0. 2 ～
0. 3 cm处剪下 ,切成约 0. 5 cm ×0. 5 cm的小块待接种之用。
1. 2. 2　试验用培养基
1)国家 “十五 ”攻关课题(2001BA510B08)、哈尔滨市科技攻关
课题(2003AA6CN094)资助。
第一作者简介:王爱芝 ,女 , 1975年 8月生 ,东北林业大学林学
院 ,研究实习员。
收稿日期:2004年 4月 5日。
责任编辑:张建华。
　　基本培养基均采用 MS培养基,添加 20 g /L蔗糖和 6 g /L琼
脂。培养基灭菌前调整 pH值至 5. 8,以 121℃高压灭菌 20 m in。
培养基激素组合设计方案(注:激素的浓度单位均采用 mg /L)。
IBA和 BA组合:IBA分别采用 0、0. 1、0. 5、 1. 0、2. 0五个
水平 , BA分别采用 0、0. 5、 1. 0、3. 0、5. 0五个水平;NAA与 BA
或 TDZ组合:NAA分别采用 0、0. 1、0. 5、1. 0、2. 0、 3. 0六个水
平 , BA浓度水平同前 , TDZ分别采用 0、0. 01、0. 02、0. 05、0. 1,
0. 5六个水平;2, 4 -D与 BA或 TDZ组合:2, 4 -D浓度水平
同 IBA , TDZ分别采用 0、0. 01, 0. 05、 0. 1、 0. 5、1. 0六个水平 ,
BA浓度水平同前。
每个激素组合均设 10次重复 , 每个三角瓶中接种 3个外
植体。
1. 2. 3　培养条件
试验采用日光灯照射培养,每天以光照 16 h /黑暗 8 h交替照
明,强度为 3000 lx左右,温度为(25±2)℃,湿度约 70% ～ 80%。
2　结果与分析
2. 1　以花楸幼嫩茎段为外植体
2. 1. 1　 IBA和 BA组合对愈伤组织诱导的影响
当 IBA为 0. 1 ～ 1. 0 m g /L时 ,愈伤组织平均诱导率均在
60%左右 ,在 2. 0mg /L时 ,达最大值 90%(图 1)。从图 2可知,
诱导率随 BA浓度的增加呈上升趋势 ,在 5. 0 mg /L时 , 诱导率
达到 90%,但是愈伤组织体积小 ,而且颜色发白 , 后期增殖效
果不好。因此 ,诱导愈伤组织的最佳浓度范围为 IBA1. 0 ～ 2. 0
mg /L+BA0. 5 ～ 3m g /L,该范围内诱导率均高于 80%, 愈伤组
织呈黄绿色 , 体积可达 0. 6 cm3。
2. 1. 2　NAA与 BA或 TDZ组合对愈伤组织诱导的影响
NAA和 BA组合时 ,不同浓度 NAA对愈伤组织的诱导率
没有显著影响。当 NAA为 0. 1 ～ 1. 0 m g /L时 ,愈伤组织诱导
率均可达到 100%, 愈伤组织呈翠绿或黄绿色颗粒状。而当
NAA浓度相同时 ,不同浓度 BA对愈伤组织诱导率及其体积、
接种后外植体的生长状态的影响及其显著。如图 2所示 , 在未
添加 BA的组合中 , 平均诱导率仅为 69. 33%, 当 BA在 0. 5 ～
DOI牶牨牥牣牨牫牱牭牴牤j牣cnki牣dlxb牣牪牥牥牭牣牥牪牣牥牥牰
3. 0m g /L范围内 ,愈伤组织诱导率均可达到 100%, 但 BA在
5. 0m g /L时 ,诱导率有所下降 , 大部分外植体接种一周后开
始萎蔫 , 且愈伤组织表面有一层白色的角质层。
图 1　愈伤组织平均诱导率随 IBA浓度变化
图 2　愈伤组织平均诱导率随 BA浓度变化
由图 3可看出,愈伤组织的平均体积随 NAA浓度的增加先
逐渐增大,在 1. 0mg /L时平均体积达到最大值 0. 49 cm3 ,甚至包
围整个外植体;当 NAA浓度大于 2. 0 mg /L时, 愈伤组织体积又
逐渐减少,颜色黄白而且结构致密。由图 4可知 ,愈伤组织的平
均体积随 BA浓度变化也呈现出基本相似的趋势,当 BA浓度为
3. 0mg /L时,平均体积最大为 0. 32 cm3;BA为 0. 5 mg /L和 5. 0
mg /L时,平均体积基本相同,分别为 0. 22 cm3和 0. 21 cm3。
NAA和 TDZ组合使 45. 9%的幼嫩茎段变褐 , 有 27%的
茎段无变化 , 诱导出愈伤组织的茎段仅占接种外植体总数的
27. 1%。当 NAA为 0. 1 ～ 3 m g /L、 TDZ为 0. 01 ～ 0. 5 mg /L
时 , 培养 10 d后在切口处均能长出小米粒大小的黄白色致密
的愈伤组织 , 2周后愈伤组织变褐甚至整瓶培养基变成黄褐
色 , 其效果明显不如 BA 和 NAA 的组合。 较好的组合为
NAA2. 0 m g /L+TDZ0. 02 mg /L。
图 3　愈伤组织平均体积随 NAA浓度变化
图 4　愈伤组织平均体积随 BA浓度变化
2. 1. 3　2, 4 -D与 BA或 TDZ组合对愈伤组织诱导的影响
从图 5可知 ,当 2, 4 -D与 BA组合时,未添加 2, 4 -D时也
能诱导出愈伤组织 ,愈伤组织平均诱导率随其浓度的增加呈直线
增加。当 2, 4 -D≥1. 0m g /L时 ,在切口处诱导出的白色愈伤组
织体积很小 ,结构致密;与 TDZ组合时 ,不添加 2, 4 -D则没有愈
伤组织生成 ,愈伤组织平均诱导率随其浓度的增加先增加后平缓
下降,在 0. 5mg /L时达最大值 83. 33%;当 2, 4 -D浓度高于 1. 0
mg /L时 ,愈伤组织颜色发白,结构致密,培养后期褐化严重。
图 5　愈伤组织平均诱导率随 2, 4 -D浓度变化从图 2可以看出 ,在 BA为 3. 0 mg /L时 ,愈伤组织的最高
平均诱导率达 88. 88%。因此 , 2, 4 - D和 BA诱导愈伤组织
的最佳浓度范围为 2, 4 -D1. 0 mg /L+BA1. 0 ～ 3. 0 m g /L。 从
图 6可知 ,在试验浓度范围内 , 愈伤组织平均诱导率在 60%
左右波动 , 因而 , 2, 4 -D和 TDZ诱导愈伤组织的最佳浓度范
围为 2, 4 -D1. 0 mg /L+TDZ0. 01 ～ 0. 5m g /L。
2. 2　以花楸幼嫩叶子为外植体
2. 2. 1　 IBA和 BA对愈伤组织诱导的影响
添加 IBA和 BA的 MS培养基,对诱导花楸嫩叶产生愈伤组
织的影响很小, 90%的外植体接种后无变化 ,诱导率仅为 10%。
2. 2. 2　NAA与 BA或 TDZ组合对愈伤组织诱导的影响
在添加了 NAA和 BA的 MS培养基中 , 花楸嫩叶吸收了
养分 、水分后肿胀拱起 ,呈墨绿色 , 近似于玻璃化状态 ,体积变
成原来的 4 ～ 6倍 , 当 BA浓度为 5 m g /L时 , 叶子变黄或上有
黄褐斑甚至变枯。 2周后在切口处陆续长出小米粒大小的黄
绿色或黄白色愈伤组织。由图 7可知 , 不同 NAA浓度对愈伤
组织的诱导率影响显著:当不添加 NAA时 , BA在试验浓度范
围内都不能诱导出愈伤组织 , 随着 NAA浓度的增加 , 诱导率
先增加后降低 , 在 0. 1、1. 0m g /L时分别达到两个峰值 60%和
64. 44%;当 NAA浓度为 0. 1 mg /L、BA为 0. 5 ～ 3. 0m g /L时 ,
愈伤组织诱导率达到最高 100%,但愈伤组织体积都很小 , 说
明 NAA对愈伤组织的诱导有促进作用 , 这与张小红等 [ 7]对香
椿愈伤组织诱导的研究结果一致。由图 8可以看出 ,愈伤组织平
均诱导率随 BA浓度变化的趋势与随 NAA变化相似 ,当 BA浓度
为 3. 0m g /L时 ,最高诱导率为 61. 11%。
图 6　愈伤组织平均诱导率随 TDZ浓度变化
图 7　愈伤组织平均诱导率随 NAA浓度变化
培养 15 d后 , NAA与 TDZ组合可在叶片切口诱导出小米
粒大小的黄白色致密愈伤组织 , 但直到一个月后 , 总诱导率
仍不足 20%。从图 7和图 8可知 , 平均诱导率随 NAA和 TDZ
浓度的增加呈现相同的趋势 , 当 NAA为 2. 0 mg /L时 , 诱导率
最大可达 69. 45%, 当 TDZ为 0. 1 m g /L时 , 诱导率可达 61.
11%。故其较好的组合为 NAA2m g /L+TDZ 0. 1 m g /L。
13第 2期　　　　　　　　　　　　　　　王爱芝等:花楸嫩叶和茎段的愈伤组织诱导　　　　　　　　　　　
图 8　愈伤组织平均诱导率随 BA浓度变化
2. 2. 3　2, 4 -D与 BA或 TDZ组合对愈伤组织诱导的影响
由图 10可知, 2, 4 -D与 BA组合时 ,愈伤组织平均诱导率呈
先降低后逐渐升高的趋势,当 2, 4 -D为 2. 0mg /L时 ,诱导率可
达 70%。 2, 4 -D与 TDZ组合时 ,低于 0. 1mg /L的 2, 4 -D对愈
伤组织诱导无效,当 2, 4 -D为 0. 5mg /L时,诱导率最大可达 72.
68%。 2, 4 -D与 BA或 TDZ组合时,均表现为 2, 4 -D≥1. 0m g /
L时 ,在切口处长出的愈伤组织较小 ,颜色发白 ,结构致密。
愈伤组织平均诱导率随 BA浓度的增加一直呈上升趋
势 , 见图 8。因此 2, 4 -D和 BA诱导愈伤组织的最佳浓度范
围为 2, 4 -D1. 0 mg /L+BA0. 5 ～ 3. 0 mg /L。从图 9可知 , 当
TDZ>0. 01 mg /L时 ,平均诱导率在 45. 56% ～ 60%之间波动 ,
2, 4 -D和 TDZ诱导愈伤组织的最佳浓度范围为 2, 4 -D0. 5
m g /L+TDZ0. 01 ～ 0. 05 m g /L。
图 9　愈伤组织平均诱导率随 TDZ浓度变化
图 10　愈伤组织平均诱导率随 2, 4 -D浓度变化
以幼嫩的叶片为外植体时 , 尽管 IBA、NAA、 2, 4 - D与
BA或 TDZ组合时的诱导率高达 100%, 但愈伤组织体积小 ,
可能与叶子取材时期有关。
2. 3　愈伤组织的增殖
根据初代培养观察结果 , 找出诱导愈伤组织最好的组合 ,
然后根据愈伤组织的生长状态确定愈伤组织增殖培养基的激
素组合 ,转瓶后增殖效果非常好, 四周后愈伤组织长满培养瓶。
3　结论和讨论
对诱导幼嫩茎段产生愈伤组织来说 ,从愈伤组织诱导率 、
体积及其生长状态综合考虑 ,生长素效应的大小顺序为 NAA >
2, 4 -D>IBA,最佳激素种类组合为 NAA1. 0mg /L+BA0. 5～ 3. 0
mg /L、2, 4 -D1. 0mg /L+BA0. 5 ～ 3. 0 mg /L或 TDZ0. 01 ～ 0. 5 mg /
L;对诱导花楸嫩叶产生愈伤组织的诱导率来说 ,生长素效应
的大小顺序为 2, 4 - D>NAA >IBA , 最佳激素种类组合为
2, 4 -D1. 0 mg /L+BA0. 5 ～ 3. 0 m g /L。将经初代培养诱导的
愈伤组织转入增殖培养基 ,四周后愈伤组织长满培养瓶。
不论以茎段还是叶片为外植体 ,接种后要么消毒过度 , 外
植体变褐 , 要么三四天后均出现严重的污染现象 , 有时污染率
高达 80%。而叶片则陆续出现染菌现象 ,到两周后污染数才
稳定 ,而且叶片的污染率(66. 7%)明显高于茎段 (30%), 消
毒的问题还有待进一步解决。
外植体愈伤组织的诱导与所用激素的种类、浓度及培养条
件有关 [ 8～ 10] 。有人曾指出[ 11] , TDZ是一种具有较高生物活性的
物质,在低浓度下即可表现出较强的细胞增殖作用, 对难以培养
的木本植物具有极其良好的促进作用。单一 TDZ对花楸叶愈伤
组织的诱导作用远不及对茎段强烈 ,这可能是由于叶比茎的形态
分化更完全 ,脱分化比较困难所致 ,而茎段形成层细胞本身就具
有增殖生长能力, 即使在离体条件下也不例外。同样 ,在单一
NAA或 2, 4 -D诱导下 ,茎段外植体可形成大量的愈伤组织 ,而
叶外植体产生的愈伤组织较少 ,这种差异是由外植体本身器官的
差异造成的。说明诱导和保持愈伤组织生长所需植物激素的种
类和浓度,除与供体植物的种类有关外, 还与外植体本身的生理
状态或对植物激素的敏感性密切相关 [ 12] 。不同外植体的诱导差
异 ,因植物种类而不同, 许多植物茎段愈伤组织诱导率高于叶
片 [13～ 17] ,而有的植物叶片比叶柄更易诱导出愈伤组织 ,说明外植
体脱分化难易程度与其生理状态有关 [18, 19] , 造成这种差异的原
因可能是不同外植体中所含的内源细胞分裂素与生长素的绝对
含量和相对比值不同所致 [ 20] 。植物生长是一个多因素共同协作
的过程 ,而本试验只涉及不同激素组合的影响 ,对外植体自身内
源生长调节物质的变化有待于做进一步的分析。
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