全 文 ：* 中科院“西部之光联合学者”、院地合作“全国科学院联盟”项目;甘肃省科技支撑计划(090NKCA127)资助
＊＊ 通讯作者 Tel:13109391608;E － mail:shigaofeng@ lut. cn
ＲP － HPLC法测定异紫堇碱的含量和相关物质*
李敏1，2，史高峰1，柳军玺2＊＊，邸多隆2，刘言娟2，冯艳1，2
(1. 兰州理工大学石油化工学院，兰州 730050;2. 中国科学院兰州化学物理研究所
中国科学院西北特色植物资源化学重点实验室 甘肃省天然药物研究重点实验室，兰州 730000)
摘要 目的:建立异紫堇碱 HPLC含量测定和有关物质检查方法。方法:采用 SinoChrom ODS － BP C18柱 (4. 6 mm × 250 mm，
5 μm) ，以乙腈 －三乙胺调至 pH 6. 02 的 0. 2%磷酸水溶液(50∶ 50)为流动相，检测波长为 270 nm，流速为 1. 0 mL·min －1，柱
温 30 ℃。结果:异紫堇碱与其相关物质峰完全分离，在 30 ～ 300 μg·mL －1浓度范围内呈良好线性关系(n = 6) ，相关系数 r =
0. 9999，定量限为 0. 03 ng，最低检测限为 0. 0075 ng，平均回收率 99. 4%，ＲSD = 2. 9%(n = 5)。结论:该方法可准确地进行定
性、定量检测且专属性好，精密度、准确度符合要求，方法可靠，可用于异紫堇碱的含量及其相关物质的测定。
关键词:异紫堇碱;秃疮花;生物碱含量测定;有关物质;反相高效液相色谱
中图分类号:Ｒ917 文献标识码:A 文章编号:0254 － 1793(2013)10 － 1748 － 04
ＲP －HPLC determination of isocorydine content and its related substances*
LI Min1，2，SHI Gao － feng1，LIU Jun － xi2＊＊，DI Duo － long 2，LIU Yan － juan2，FENG Yan1，2
(1. College of Petrochemical Engineering，Lanzhou University of Technology，Lanzhou 730050，China;
2. Key Laboratory of Chemistry of Northwestern Plant Ｒesources and Key Laboratory for Natural Medicine of Gansu Province，
Lanzhou Institute of Chemical Physics，Chinese Academy of Sciences，Lanzhou 73000，China)
Abstract Objective:To develop an HPLC method for the content determination of isocroydine and its related sub-
stances. Methods:The determination was performed on a SinoChrom ODS － BP column (4. 6 mm × 250 mm，5
μm)with acetonitrile － 0. 2% (v /v)phosphoric acid in water adjusted by triethylamine to pH 6. 02 (50:50)as
mobile phase. The flow rate was 1. 0 mL·min －1，the detection was set at 270 nm and the column temperature was
maintained at 30 °C. Ｒesults:Isocorydine and its related substances were completely separated. The calibration
curve linear between peak and isocorydine concentration was achieved in the range of 30 － 300 μg·mL －1(r =
0. 9999). The limit of detection (LOD)was 0. 0075 ng and the limit of quantity (LOQ)was 0. 03 ng. The average
recovery was 99. 4% with ＲSD 2. 9% (n = 5). Conclusion:The established method is proved to be specific，ac-
curate and reliable，which can be applied in the determination of isocorydine and its related substances.
Key words:isocorydine;Dicranostigma leptopodum (Maxim)Fedde;determination of alkaloid;related substances;
ＲP － HPLC
异紫堇碱(isocorydine) ，音译名异可利定，为阿
朴啡类生物碱，具有较好的药理学活性，如抗心律失
常、舒张血管、抗缺氧作用等［1 ～ 4］。2010 年，国家食
品药品监督管理局批准异紫堇碱盐酸盐(盐酸异可
利定片)作为处方药 (批准文号:国药准字
H53021977)用于胃、肠、胆、胰、子宫、血管痉挛所致
的疼痛，属解痉镇痛药。最近的研究显示异紫堇碱
可以通过诱导 PDCD4 相关细胞凋亡，选择性作用于
耐药的肝癌干细胞，也可以通过选择性 G2 /M 细胞
周期抑制和诱导细胞凋亡而抑制肝癌细胞分
化［5 － 7］，由此可见异紫堇碱作为解痉镇痛药或抗癌
药物及其先导物，均具有一定的开发应用前景。
异紫堇碱在紫金龙和白线薯等植物中有比较丰
富的分布，本研究组在对西北特色植物秃疮花的化
—8471— 药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2013，33(10)
DOI:10.16155/j.0254-1793.2013.10.016
学成分研究中发现，异紫堇碱在该植物中的含量较
高，为了开发利用西北区域丰富的植物资源，秃疮花
可以作为异紫堇碱的植物资源加以利用［8 － 11］。本
文采用高效液相色谱法，测定异紫堇碱的含量和进
行有关物质的检查。该法简便、快速，结果准确、可
靠，可以更好地控制本品的质量，为异紫堇碱及秃疮
花的有效利用提供科学依据。
1 仪器与试药
1. 1 仪器 Agilent 1200 型组合式全自动高效液
相色谱仪，包括 Agilent G1315B DAD 检测器、
G1328B手动进样器及配套的 Agilent Chemstation for
LC 3D化学工作站(version A. 10. 02) ;电子分析天
平为 Sartoirus BT 224S型。
1. 2 试药 异紫堇碱对照品为本实验室分离纯化，经
NMＲ，HＲ －ESI － MS，X － Ｒay 等光谱波谱技术鉴定为
本品，纯度为 98. 6%;异紫堇碱样品为本实验室采用大
孔吸附树脂技术自制产品(批号:20121001、20121015、
20121020、20121103、20121115、20121125)，乙腈为色谱
纯;磷酸、三乙胺为分析纯;实验用水为二次蒸馏水。
2 方法与结果
2. 1 色谱条件 色谱柱:SinoCrom ODS － BP C18柱
(4. 6 mm ×250 mm，5 μm) ;流动相:乙腈 － 0. 2% 磷
酸(50 ∶ 50，三乙胺调 pH 至 6. 02) ;检测波长:270
nm;流速:1. 0 mL·min －1，柱温:30 ℃;进样体积:20
μL。在上述条件下，异紫堇碱对照品溶液和供试品
溶液高效液相色谱图见图 1。
图 1 对照品溶液(A)和供试品溶液(B，批号:20121115)高效液相色谱图
Fig 1 HPLC chromatograms of reference solution (A)and sample solu-
tion (B，Lot No:20121115)
2. 2 溶液的配制
对照品储备液:取异紫堇碱对照品约 15 mg 精
密称定，置于 5 mL量瓶中，加流动相使其溶解并稀
释至刻度，摇匀，即得。
对照品溶液:精密量取对照品储备液 200 μL，
置 5 mL 量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，
即得。
供试品储备液:取批号 20121115 异紫堇碱样品
约 15 mg精密称定，置于 5 mL 量瓶中，加流动相溶
解并稀释至刻度，摇匀，即得。
供试品溶液:精密量取供试品储备液 200 μL，
置 5 mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，即得。
3 方法学验证
3. 1 专属性试验
将供试品储备液加流动相稀释至约 60 μg·
mL －1。分别以 0. 1 mol·L －1盐酸溶液、3 mol·L －1
氢氧化钠溶液和 30%过氧化氢溶液为强破坏条件，
进行酸破坏、碱破坏和氧化破坏试验。另取 2 份分
别放进 90 ℃的水浴锅(2 h)和在 254 nm 紫外灯照
射(1 h) ，进行热破坏和紫外线破坏试验［12］。
将上述破坏后的供试品溶液照“2. 1”项下的色
谱条件进行降解产物检出试验，见图 2。结果表明，
经酸、热和紫外条件破坏的供试品溶液的色谱图均
有不同程度的杂质峰产生，特别是在酸条件下和紫
外破坏条件。但是在碱和氧化条件下，供试品溶液
相对比较稳定。
3. 2 线性范围
精密量取对照品储备液适量，分别用流动相
稀释得浓度为 30、60、120、180、240、300 μg·
mL －1的系列溶液，分别取 20 μL 注入液相色谱仪，
记录色谱图。以异紫堇碱峰面积 Y 为纵坐标，对
照品溶液浓度 X 为横坐标进行线性回归处理，得
回归方程:
Y = 41. 13X － 330. 3 r = 0. 9999
结果表明异紫堇碱浓度在 30 ～ 300 μg·mL －1范围
内线性关系良好。
取上述对照品溶液适量，加流动相逐级稀释后
依法测定，以 10 倍噪音(S /N = 10)和 3 倍噪音(S /
N = 3)计算最低定量限和检出限分别为 0. 03 ng 和
0. 0075 ng。
3. 3 精密度试验 取“2. 2”项下对照品储备液加
流动相稀释至 60 μg·mL －1，精密量取 20 μL，连续
进样 5 次，峰面积 ＲSD(n = 5)为 1. 6%，本方法精密
度良好。
—9471—药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2013，33(10)
图 2 HPLC方法专属性考察图谱
Fig 2 Chromatograms of sample specificity
A. 酸破坏(decomposed by 0. 1 mol·L －1 hydrochloric acid) B. 碱破坏(decomposed by 3 mol·L －1 sodium hydroxide) C. 热破坏(decomposed by
heating at 90°C) D. 紫外线破坏(destroyed by ultraviolet light) E．氧化破坏(destroyed by hydrogen peroxide)
1. 降解产物(degradation product) 2. 异紫堇碱(isocorydine)
3. 4 稳定性试验 取同一份供试品溶液，用流动相
稀释至约 100 μg·mL －1，在上述相同色谱条件下，
分别于室温放置 0、2、4、6、8、10、24 h 后进样测定，
计算得异紫堇碱峰面积的 ＲSD 为 2. 7%(n = 7)。
表明供试品溶液在室温下 24 h内稳定。
3. 5 重复性试验 取 20121115 批号样品，按照
“2. 2”项下方法分别制备 5 份供试品溶液，测定异
紫堇碱含量为 96. 9%，ＲSD 为 0. 02%(n = 5) ，说明
方法重复性良好
3. 6 回收率试验 取20121115批号样品约15 mg，精
密称定，称取 5份，分置 5 mL量瓶中，加流动相稀释至
刻度，摇匀。精密量取此溶液 200 μL，置 5 mL量瓶中，
再精密加入对照品溶液 200 μL，加流动相溶解并稀释
至刻度，摇匀。精密量取20 μL，进样测定，结果见表1。
表 1 回收率试验结果(n =5)
Tab 1 Ｒesults of recovery test
序号
(No．)
供试品含量
(sample content)/μg·mL －1
对照品加入量
(added)/μg·mL －1
测得总量
(detected)/μg·mL －1
回收率(recovery)
/%
平均回收率
(average recovery)/%
ＲSD /%
1 123. 2 110. 1 235. 4 101. 9 99. 4 2. 9
2 117. 6 110. 1 219. 4 98. 5
3 120. 8 110. 1 227. 4 96. 8
4 119. 2 110. 1 225. 1 96. 2
5 121. 6 110. 1 235. 7 103. 6
3. 7 耐用性试验
3. 7. 1 流动相 pH 变化 将流动相 pH 分别调为
5. 75、6. 02、6. 25，取同一份供试品溶液，精密量取
20 μL，进样测定，记录峰面积，计算异紫堇碱峰面积
的 ＲSD(n = 6)为 2. 8%。
3. 7. 2 流动相比例变化 将流动相乙腈 －三乙胺
比例分别调为 48 ∶ 52、50 ∶ 50、52 ∶ 48，取同一份供试
品溶液，精密量取 20 μL，进样测定，记录峰面积，计
算异紫堇碱峰面积的 ＲSD (n = 6)为 0. 75%。
3. 7. 3 柱温变化 将柱温分别调为 25、30、35 ℃，
取同一份供试品溶液，精密量取 20 μL，进样测定，
计算异紫堇碱峰面积的 ＲSD(n = 6)为 1. 5%。
—0571— 药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2013，33(10)
3. 7. 4 检测波长变化 将检测波长分别调为 265、
270、275 nm，取同一份供试品溶液，精密量取 20
μL，进样测定，记录峰面积，计算异紫堇碱峰面积的
ＲSD(n = 6)为 2. 6%。
3. 8 含量测定 精密量取照“2. 2”项下方法制备
的供试品溶液及对照品溶液，用流动相稀释至线性
范围后，精密量取 20 μL，按上述色谱条件进行分
析，按外标法以峰面积计算异紫堇碱的含量，6 批样
品的含量结果见表 2。
表 2 不同批次样品异紫堇碱的含量测定结果
Tab 2 Ｒesults of determination of isocorydine content
批号
(Lot No．)
异紫堇碱含量
(content of isocorydine)/%
ＲSD
/%
20121001 93. 9 0. 04
20121015 91. 4 0. 05
20121020 97. 4 0. 22
20121103 96. 6 0. 34
20121115 98. 4 0. 01
20121125 97. 9 0. 03
4 讨论
4. 1 检测波长 根据上述含量测定和有关物质检
查方法，对样品进行二极管阵列检测，由 DAD 光谱
图可知，本品和专属性试验产生的降解物质在 270
nm处有最大吸收，故选择 270 nm作为检测波长。
4. 2 流动相 pH 以 0. 2%磷酸水溶液(用三乙胺
调节 pH)－乙腈(50∶ 50)为流动相，考察其 pH对异
紫堇碱色谱行为的影响。结果表明，pH对主峰与相
邻杂质峰间的分离度、保留时间、对称性均有影响。
流动相的 pH 越高，异紫堇碱在色谱中的保留时间
越长。而 pH 为 6. 02 时主峰与相邻杂质峰间的分
离度、保留时间、拖尾因子均较好，因此确定流动相
的最佳 pH为 6. 02。
4. 3 有机相中乙腈浓度 上述流动相的其他条件
不变，改变流动相中乙腈的浓度，考察异紫堇碱的色
谱行为变化。试验结果表明，乙腈浓度对异紫堇碱
主峰与相邻杂质峰间的分离度、保留时间均有显著
的影响。随着乙腈浓度的增加，主峰与相邻的杂质
峰间的分离度减小，保留时间缩短，当乙腈浓度为
50%时，保留时间在 8 min左右，能满足含量测定的
快速要求。乙腈浓度对主峰对称性影响较小。因
此，确定流动相中乙腈浓度为 50%。
4. 4 有关物质 在实验过程中发现，本品对紫外线
和高温敏感，故实验操作应尽量避免强光照射及高
温环境。
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(本文于 2012 年 12 月 3 日收到)
—1571—药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2013，33(10)