全 文 ：第 31卷　第 4期
2013年 12月 　　　　
广西师范大学学报:自然科学版
Journa l o f Guangx i No rmal Univ ersity: Na tural Science Edition
　　　　　　 Vol. 31　 No. 4
Dec. 2013
收稿日期: 2013-06-14
基金项目: 国家自然科学基金资助项目 ( 31060034, 30760029)
通信联系人: 唐绍清 ( 1965— ) ,男 ,广西恭城县人 ,广西师范大学教授 ,博士。 E-mail: shaoqing@ mailbox . g xnu. edu. cn
资源冷杉大院种群的小尺度空间遗传结构分析
刘招辉 1, 2 ,卢永彬 1, 2 ,张启伟 1, 2 ,刘燕华 3 ,唐绍清1, 2
( 1.广西师范大学生命科学学院 ,广西桂林 541004; 2.珍稀濒危动植物生态与环境保护省部共建教育部重点实验室 ,
广西桂林 541004; 3.广西师范大学 附属中学 ,广西桂林 541001)
摘　要:资源冷杉是我国特有的极度濒危植物 ,其中湖南省炎陵县大院分布的资源冷杉种群是最大的种群。
本研究应用 SSR分子标记对湖南省炎陵县大院的 4个资源冷杉种群进行小尺度的空间结构分析。 Sp统计量
表明 , 4个种群的空间遗传结构强度为: 鸡麻捷 ( 0. 018 6) > 香菇棚 ( 0. 018 4)> 和平坳 ( 0. 011 8) > 中牛石
( 0. 007 1)。种群内成对个体的多位点平均相关性系数 Fi j表明 ,中牛石种群呈随机分布 ,香菇棚、鸡麻捷和和平
坳这 3个种群具有一定的空间遗传结构 ,间接估算基因流扩散距离分别为: 16～ 37 m、 21～ 47 m和 28～ 63 m。
对于具有空间遗传结构的 3个种群 ,迁地保护取样时应分别相隔 10 m、 10 m和 25 m以上 ,以减少遗传相似性。
关键词: 资源冷杉 ; SSR;小尺度空间结构 ;基因流扩散 ;保护
中图分类号: Q948. 15　　　文献标识码: A　　　文章编号: 1001-6600( 2013) 04-0140-05
资源冷杉 Abies ziyuanesis是松科冷杉属植物 ,被录入《中国植物红皮书》中 [1 ] ,在 1998年世界自然保
护联盟 ( ICUN)拟定的“针叶树行动计划”中被列为全球重点保护的针叶树种 ,是国家一级重点保护植
物 [2 ]。资源冷杉分布于广西资源县和湖南城步县交界的银竹老山、湖南新宁县和东安县交界的舜皇山以及
湖南炎陵县大院 [3-4 ]。其中 ,银竹老山现有资源冷杉 42株 [5 ] ;湖南舜皇山有 30株左右 [ 6] ;种群最大的是湖南
省炎陵县大院 4个自然分布资源冷杉种群 ,据刘燕华等 [ 7]调查 ,株高 1 m以上个体总计有 477株。
空间遗传结构 ( spa tial genetic st ructure, SGS) ,即基因型非随机性的空间分布 [8-9] ,会影响种群对微生
境变化的适应能力、种群内个体的交配格局、种内竞争、有效种群大小、近交以及后代的适合度等 [10 ] ,进而
影响种群的动态和维持。因此 ,对濒危植物的残存种群空间遗传结构的分析有利于了解种群动态 ,以制订
有效的保护策略。
对于资源冷杉这样一个极度濒危物种 ,目前已应用 RAPD、 cpSSR等分子标记 [ 11-15]进行了研究 ,结果
均表明种群遗传多样性较低、遗传分化主要存在于种群间。此外 ,刘燕华等 [7 ]和刘招辉等 [16 ]分别对资源冷
杉的种群结构和空间分布格局进行了研究 ,但尚未有资源冷杉小尺度空间遗传结构的相关研究报道。本研
究 应用 SSR分子标记 ,对分布于湖南炎陵县大院农场的 4个自然分布的资源冷杉种群进行小尺度空间遗
传结构的分析 ,以期揭示濒危植物片段化种群空间遗传结构形成的原因 ,为资源冷杉的保育提供合理的策
略。
1　材料和方法
1. 1　材料
对湖南炎陵县大院的资源冷杉种群进行样地调查 ,在中牛石、香菇棚、鸡麻捷和和平坳 4个自然分布
种群内的每个高度超过 1 m的植株进行精确定位 ,种群信息见表 1。采集其叶片 (约 0. 1 g ) ,装入有变色硅
胶的封袋中 ,带回实验室后 - 20°C保存以备提取植物总 DNA。
DOI : 10. 16088 /j . i ssn. 1001 -6600. 2013. 04. 008
表 1　资源冷杉大院种群的采样信息
Tab. 1　 Sampling sites of Abies ziyuanensis in Dayuan,Hunan
采样地 种群代号 样本数 样地大小 海拔 /m 纬度 经度
中牛石 ZN S 59 40 m× 46 m 1 358 N26°25′54″ E114°02′48″
香菇棚 XGP 83 45 m× 70 m 1 486 N26°26′15″ E114°03′10″
鸡麻捷 JM J 84 55 m× 90 m 1 496 N26°26′26″ E114°04′4″
和平坳 HPA 232 100 m× 100 m 1 490 N26°24′35″ E114°01′50″
1. 2　 DNA提取和 PCR扩增及产物检测
采用改良的 CTAB法 [17 ]提取资源冷杉大院种群总 DNA, 10 g /L琼脂糖凝胶检测 DNA浓度。筛选出
6对 SSR引物 ( Abfi14[ 18]、 Abfi18[18 ]、 Abfi06[18 ]、 AFSI16[19 ]、 As09[20 ]、 As20[20 ] )用于 PCR扩增。 PCR反应体
系为 20μL,包括 1μL DNA,各 0. 2μL 50μmol /L正反引物 , 2μL 10× PCR buffer, 0. 4μL dN TPs ( 10
μmo l /L) , 0. 4μL M gCl2 ( 25 mmol /L ) , 0. 2μL Taq酶 ( 5 U /μL) ;程序为: 94°C 10 min; 94°C 45 s,退火温
度 50°C(或 55°C) 45 s, 72°C 45 s, 30个循环 ; 72°C 10 min; 4°C 30 min。 PCR产物用 60 g /L变性聚丙烯
酰胺胶电泳分离 ,银染显色。
1. 3　数据分析
用 GenAlEx6. 3[21 ]软件计算等位基因数、观察杂合度 Ho ( observ ed hetero zygo sity )、期望杂合度 He
( expected hetero zy gosi ty)、固定指数 F。用 GEN EPO P3. 1[22 ]在线软件进行 Hardy-Weinberg平衡检验。
利用 SPAGeDi 1. 3[23 ]分别分析 4个种群的 SSR标记的空间遗传结构。计算种群内成对个体间的相关
系数 F ij ( Fij为居群内随机样本 i与 j基因型完全一致的概率 ) ,以最小距离为 5 m作为等隔距离进行分组 ,
根据样地内个体间的空间分布情况 ,最大距离分别为: d ZN S= 45 m、 dXGP= 70 m、 d JM J= 70 m、 dHPA= 115 m ,
各分组的平均 Fi j值对 ln( ri j )回归得到回归斜率bF (rij为个体间地理空间距离 )。 Sp统计值代表利用相关系
数-距离曲线的斜率 bF和第一个距离等级内的平均相关系数 F ( 5 m)估算的 SGS强度 ,即 Sp= - bF /( 1-
F ( 5 m) )。二维空间内 ,邻群大小N b可用于估算基因流距离: Nb≈ 4πDe 2g ,其中De为有效种群密度 ,e2g为基因
流分布距离的二阶中心距。实际种群密度D近似等于有效种群密度De的若干倍: De= D×Ne /N ,其中Ne /
N为成年个体换算种群有效个体的比率 [ 9]。本文分别采用 De= D /2、D /4和 D /10估算 [9 ]。 连续种群的邻
群大小 Nb与 Sp互为倒数 [ 24] ,即: N b= - ( 1- F ( 5 m) ) /bF。
2　结果与分析
2. 1　空间遗传结构
对资源冷杉大院种群高 1 m以上植株进行 SSR位点扩增 ,所用的 6个 SSR位点均呈多态性 ,共检测出
24个等位基因。 4个种群的观察杂合度 Ho分布在 0. 571 4～ 0. 650 6,期望杂合度 He分布在 0. 534 4～
0. 644 3。 Hardy-Weinberg平衡检验显示和平坳种群的 Abfi18和 Abfi06这 2个位点偏离了 Hardy-
Weinberg平衡。
本研究将等距离设为 5 m ,并计算资源冷杉大院 4个种群内成对个体的多位点平均相关系数Fi j (图 1)。
4个种群的多位点平均相关系数 Fij图形的形状差异很大。 F ij值显著正相关的有 XGP、 JM J和 HPA种群分
别在 10 m、 10 m和 25 m范围内 ,表明 XGP、 JM J和 HPA种群分别在 10 m、 10 m和 25 m范围内个体间存
在明显的亲缘关系 ,说明了这 3个种群存在明显的空间遗传结构。而 ZN S种群在较近的距离内未表现出显
著正相关 ,而在 10 m左右的出现了显著正相关。在 4个种群中 ,F ij为负值均出现在较远的距离。 JM J种群
第一个间隔距离的相关系数 F ( 5 m)为 0. 055± 0. 014,是 4个种群中最大的 (表 2)。 Sp统计量表明: JM J种群
( 0. 018 6)的遗传结构最明显 ,而 ZN S种群 ( 0. 007 1)的遗传结构最不明显 (表 2) ,表明 4个种群的空间遗传
结构的强度顺序为:鸡麻捷> 香菇棚> 和平坳> 中牛石。
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虚线代表 95%置信区间上下限
图 1　资源冷杉大院种群的相关系数图
Fig . 1　 Cor relog rams of Kinship coefficients fo r Abies ziyuanensis population in Dayuan, Hunan
表 2　资源冷杉大院种群空间结构
Tab. 2　 Spatial genetic structure stat istics for Abies ziyuanensis population in Dayuan,Hunan
种群 数量 观察杂合度
Ho
期望杂合度
He
固定值
F
平均相关性系数
Fi j (± SE)
第一个间隔内平均相关系数
F (5 m ) (± SE) Sp
ZNS 57 0. 573 4 0. 569 4 - 0. 014 9 0( 0. 000 5) 0. 005 1( 0. 010 9) 0. 007 1
XGP 83 0. 650 6 0. 586 6 - 0. 100 5 0. 000 6( 0. 000 3) 0. 018 9( 0. 013 4) 0. 018 4
JM J 84 0. 571 4 0. 534 4 - 0. 057 5 0. 000 4( 0. 000 2) 0. 054 7( 0. 013 5) 0. 018 6
HPA 202 0. 635 1 0. 644 3 0. 015 9 0( 0. 000 1) 0. 032 9( 0. 010 1) 0. 011 8
2. 2　间接估算基因流距离
假设 De= D /2、De= D /4和 De= D /10,分别对具有空间遗传结构的 3个种群的邻群大小 Nb和基因扩
散距离eg进行估算 (中牛石种群没有显著空间遗传结构 ,估算无意义 ) ,结果见表 3。香菇棚、鸡麻捷以及和
平坳 3个种群的平均限制性回归斜率 bF分别为: - 0. 018 1(± 0. 011 5)、 - 0. 017 6(± 0. 002 2)和
- 0. 011 4(± 0. 004 8) ,可以间接地估算这 3个种群的邻群大小 N b分别为 54、 54和 85,以及基因流扩散距
离eg的范围分别为: 16～ 37 m、 21～ 47 m和 28～ 63 m。
表 3　资源冷杉大院种群的有效种群大小以及基因扩散距离估算
Tab. 3　 Estimation of gene diffusion distance and gene dif fusion distance for Abies ziyuanensis populat ion in
Dayuan,Hunan
种群 回归斜率
bF (± SE)
邻群大小
N b
基因流距离eg /m
D e= D /2 D e= D /4 De= D /10
ZNS - 0. 007 1( 0. 003 7) — — — —
XGP - 0. 018 1( 0. 011 5) 54 16. 33 23. 09 36. 52
JM J - 0. 017 6( 0. 002 2) 54 20. 82 29. 44 46. 56
HPA - 0. 011 4( 0. 004 8) 85 28. 32 40. 05 63. 33
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3　讨论
种群空间遗传结构往往与物种的繁育系统、种子散布方式等生殖生物学特性以及居群生境有着密切
联系 [25 ]。 本研究通过分析得到的 4个种群的 Sp统计量分别为: Sp
ZNS
= 0. 007 1、 Sp
XGP
= 0. 018 4、 Sp
JM J
=
0. 018 6、 SpHPA= 0. 011 8,均小于 Vekemans & Hardy研究的 7个混交型繁育系统物种的平均 Sp统计量 ( 0.
037 2) [9 ] ,这可能与资源冷杉的生物学特性相关 (资源冷杉种子有翅 ,花粉具有气囊 ,有利于基因流扩散 ,
造成资源冷杉空间遗传结构相对较弱 )。从 Sp统计量看 ,中牛石种群的空间遗传结构强度最弱 ,该种群分
布面积小 ,植株最少 ,且在尺度大于 8 m以后呈随机分布 [16 ] ,稳定状况最差 ,处于衰退状态 [7 ] ,这可能是该
种群空间遗传结构最弱的原因。
小尺度的空间遗传结构分析 ,可以通过成对个体的相关性系数 Fij ,以及它们间地理距离的自然对数 ln
(rij )回归得到的回归斜率bF ,来估算出邻群大小N b以及基因流距离eg。Yao等以此估算得到的基因流距离
与亲本分析得到的基因流距离是相似的 [26 ] ,表明小尺度空间遗传结构估算的基因流距离可以有效地用于
分析基因扩散的方式。对于自然分布的种群 ,基因流扩散的距离通常在De= D /2和De= D /10之间变化 [9 ] ,
具有空间遗传结构的 XGP、 JM J和 HPA种群的基因流扩散距离分别为: 16～ 37 m、 21～ 47 m和 28～ 63 m。
4　种质资源保育建议
植物由于受到物种的繁育系统、种子和花粉传播机制的影响 ,以及种群内的微环境异质性的影响 ,使
种群内的遗传变异在空间上并不完全呈随机分布 ,而是呈斑块状分布 ,产生了一定的空间分布格局 ,这就
是通常所指的种群空间遗传结构。本研究的 4个资源冷杉种群中 ,香菇棚、鸡麻捷以及和平坳种群具有一
定的空间遗传结构 ,对这 3个种群种质资源的迁地保护 ,我们建议: 3个种群内个体之间的取样距离应该分
别相隔 10 m、 10 m和 25 m以上 ,以减少所保存种质资源的遗传相似性 ,有利于更完善地保存濒危资源冷
杉种质资源。
参　考　文　献:
[ 1]　傅立国 .中国植物红皮书: 第 1册 [M ].北京: 科学出版社 , 1992: 62-63.
[ 2]　向巧萍 .中国的几种珍稀濒危冷杉属植物及其地理分布成因的探讨 [ J].广西植物 , 2001, 21( 2): 113-117.
[ 3]　傅立国 ,吕庸浚 ,莫新礼 .冷杉属植物在广西与湖南首次发现 [ J].植物分类学报 , 1980, 18( 2): 205-210.
[ 4]　刘起衔 .湖南产新植物 [ J].植物研究 , 1988, 8( 3): 85-86.
[ 5]　卢燕华 ,冯汝君 .最后的资源冷杉 [ J].广西林业 , 2012( 8): 38-43.
[ 6]　韦荣华 .银竹老山资源冷杉 [ J].森林与人类 , 2012( 9): 72-79.
[ 7 ]　刘燕华 ,刘招辉 ,张启伟 ,等 .湖南炎陵县大院濒危植物资源冷杉种群结构研究 [ J].广西师范大学学报:自然科学版 ,
2011, 29( 2): 88-93.
[ 8 ]　 WELLS G P, YOUNG A G. Effects o f seed dispersal on spatial genetic str uc tur e in popula tions of Rutidosis
leptorrhychoides with differ ent lev els of co rr ela ted paternity [ J]. Genetical Research, 2002, 79( 3): 219-226.
[ 9 ]　V EKEM ANS X , HARDY O J. New insigh ts from fine-sca le spatial g enetic str uctur e analyses in plant populations [ J].
Molecular Eco log y, 2004, 13( 4): 921-935.
[ 10 ]　阮咏梅 ,张金菊 ,姚小洪 ,等 .黄梅秤锤树孤立居群的遗传多样性及其小尺度空间遗传结构 [ J].生物多样性 , 2012, 20
( 4): 460-469.
[ 11 ]　苏何玲 ,唐绍清 .濒危植物资源冷杉遗传多样性研究 [ J].广西植物 , 2004, 24( 5): 414-417.
[ 12 ]　代文娟 ,唐绍清 ,刘燕华 .叶绿体微卫星分析濒危植物资源冷杉的遗传多样性 [ J].广西科学 , 2006, 13( 2): 151-155.
[ 13 ]　张玉荣 ,罗菊春 ,喻锦秀 .资源冷杉遗传多样性的 ISSR分析 [ J].北京林业大学学学报 , 2007, 29( 6): 41-46.
[ 14]　 T ANG Shao-qing , DAI Wen-juan, LI M ing-shun, et al. Genetic div ersity of relictua l and endange red plant Abies
ziyuanensis ( Pinaceae ) rev ealed by AFLP and SSR marker s [ J]. Genetica, 2008, 133( 1): 21-30.
[ 15 ]　韦范 ,唐绍清 .基于 nrDNA GapC基因内含子序列的资源冷杉遗传多样性研究 [ J].植物研究 , 2011, 31( 6): 729-734.
143第 4期　　　　　　　　　　 刘招辉等:资源冷杉大院种群的小尺度空间遗传结构分析　　　　　　　　　　
[ 16 ]　刘招辉 ,张建亮 ,刘燕华 ,等 .大院资源冷杉种群的空间分布格局分析 [ J].广西植物 , 2011, 31( 5): 614-619.
[ 17 ]　 DOYLE J J, DOYLE J L. A rapid DNA isolation pro cedure fo r sma ll quantities of fresh leaf tissue [ J]. Phy tochemical
Bulletin, 1987, 19( 1): 11-15.
[ 18 ]　 SAITO Y , L IAN Chun-lan, HOGET SU T , et al. Development and chara cteriza tion of mic rosa tellite markers in Abies
f irma and interspecific amplification in o ther Japanese Abies species [ J]. Mo lecula r Eco log y Notes, 2005, 5( 2): 234-
235.
[19]　 JOSSERAND S A , POT TER K M , JO HNSON G, et al. Iso la tion and cha racterization o f micro sa tellite markers in
Fraser fir (Abies f raseri ) [ J]. Molecular Eco lo g y Notes, 2006, 6( 1): 65-68.
[ 20]　 L IAN Chun-lan, GOTO S, HOGET SU T. M icro sa tellite marker s for Sachalin fir (Abies sachalinensis Master s) [ J].
Molecular Eco log y No tes, 2007, 7( 5): 896-898.
[ 21]　 PEAKALL R, SMOUSE P E. GENALEX6: g enetic analysis in Excel. Population genetic so ftw ar e fo r teaching and
resea rch [ J]. Mo lecula r Eeolog y No tes, 2006, 6( 1): 288-295.
[ 22 ]　 RAYM OND M, ROUSSET F. GENEPOP ( ver sion 1. 2): popula tion genetics so ftwa re fo r exac t tests and
ecumenicism [ J]. Journa l o f He redity , 1995, 86( 3): 248-249.
[ 23 ]　 HARDY O J, VEKEM AN S X. SPAGeDi: a v ersa tile computer prog r am to ana ly se spa tial g enetic st ructure at the
indiv idual or population lev els [ J]. Mo lecula r Eco log y No tes, 2002, 2( 4): 618- 620.
[ 24 ]　 HARDY O J, VEKEM AN S X. Isolation by distance in a continuous population: r econcilia tion betw een spa tial
autoco r rela tion analysis and population genetics models [ J]. He redity , 1999, 83( 2): 145-154.
[ 25]　刘亚令 ,李作洲 ,张鹏飞 ,等 .猕猴桃自然居群 SSR遗传变异的空间自相关分析 [ J].生物多样性 , 2006, 14( 5): 421-
434.
[ 26 ]　 YAO X, ZHANG J, YE Q , et al. Fine-scale spatia l g ene tic structure and gene flow in a small, fragmented population
of Sinojack ia rehderiana ( Sty racaceae) , an endange red tree species endemic to China [ J]. Plant Bio lo g y, 2011, 13( 2):
401-410.
Fine-scale Spatial Genetic Structure Analy sis of Abies z iyuanesis
Population in Dayuan, Hunan, China
LIU Zhao-hui
1, 2
, LU Yong-bin
1, 2
, ZHANGQi-wei
1, 2
, LIU Yan-hua
3
, TANG Shao-Qing
1, 2
( 1. Co llege o f Life Science, Guangxi No rmal Univ er sity , Guilin Guangxi 541004, China; 2. Ministr y o f Educa tion Key
Labo ra tor y fo r Ecolog y o f Ra re and Endanger ed Species and Env ironmental Pro tec tion, Guilin Guangxi 541004,
China; 3. The High School Affiliated to Guangxi No rmal Univ ersity , Guilin Guangx i 541001, China )
Abstract: Abies ziyuanesis is a critically endangered plant species endemic to China, and i ts popula tion in
Dayuan of Yanling County , Hunan Province, has the larg est size. In this research, the fine-scale spa tial
g enetic st ructure ( SGS) of four A. ziyuanesis popula tions in Dayuan w as analy zed by simple sequence
repea ts ( SSR) markers. Sp stati stics indicated that th e SGS intensi ty of four popula tions w ere as follow s:
JM J( 0. 018 6) > XGP( 0. 018 4) > HPA( 0. 011 8) > ZNS ( 0. 007 1) . Pair-w ise rela tedness coef ficients
betw een individuals in each population ( Fij ) indica ted that ZN S popula tion show ed random dist ribution
and others had a significantly SGS. Indirect estima tion fo r gene flow dif fusion distance in three
popula tions w hich had a significantly SGS w ere as follow s: X GP ( 16 to 37 m) , JM J ( 21 to 47 m ) and
HPA ( 28 to 63 m ) . The presence of a SGS in three popula tions implied that A. z iyuanesis germplasm
resources fo r ex si tu conserv ation should be co llected f rom trees at least 12 m , 10 m , 25 m ( fo r XGP, JM J
and HPA population, respectiv ely ) apa rt to reduce genetic similarity betw een neighbouring indiv iduals.
Key words: Abies ziyuanesis; SSR; fine-scale spa tial g enetic st ructure; g ene f low dispersal; conserv ation
(责任编辑　马殷华 )
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