全 文 ：收稿日期:2012-11-13 接受日期:2013-03-20
基金项目:苏州市科技支撑计划项目(SS201004)
* 通讯作者 Tel:86-512-65190599;E-mail:zhenlungu． 2003@ 163． com
天然产物研究与开发 Nat Prod Ｒes Dev 2013，25:967-971，948
文章编号:1001-6880(2013)7-0967-06
毛茛有效部位 D1 对人胃癌细胞 MGC803 细胞增
殖和凋亡的作用及其机制的初步研究
朱峰妍1，虞 迪2，成旭东1，曹志飞2，王薇丹1，鲍美美2，蒋小岗1，顾振纶1*
1 苏州大学 苏州中药研究所，苏州 215007;2苏州大学医学部，苏州 215123
摘 要:采用 AlamarBlue和瑞-姬氏染色方法检测毛茛有效部位 D1 对人胃癌细胞 MGC803 增殖的作用;PI染色
法观察 D1 对 MGC803 细胞周期的影响;半定量 ＲT-PCＲ法检测 D1 对 MGC803 细胞周期相关基因表达的作用;
用 DAPI染色方法和细胞色素 C免疫荧光法观察 D1 对胃癌细胞 MGC803 凋亡的影响。结果显示，毛茛有效部
位 D1 对胃癌细胞 MGC803 表现出较好的增殖抑制作用，且 24、48 和 72 h 的半数抑制浓度分别为 126． 89、
74. 81、68． 72 μg /mL;同时 D1 对细胞周期和周期相关基因的表达无明显影响，且 D1 能促使细胞色素 C 释放到
细胞胞浆诱导细胞凋亡。
关键词:毛茛;人胃癌细胞;MGC803;细胞色素 C;细胞凋亡
中图分类号:Ｒ284 文献标识码:A
Preliminary Study of Effect and Mechanisms of Ｒanunculus japonicus Component
D1 on Human Gastric Cancer Cell MGC803 Proliferation and Apoptosis
ZHU Feng-yan1，YU Di2，CHENG Xu-dong1，CAO Zhi-fei2，
WANG Wei-dan1，BAO Mei-mei2，JIANG Xiao-gang1，GU Zhen-lun1*
1Suzhou Institute of Chinese Materia Medica，Suzhou，215007，China;2Medical College of Soochow University，Suzhou，215123，China
Abstract:Alamar Blue assay and Wright-Giemsa assay were used to determine the effect of Ｒannunculus japonicas com-
ponent D1 on the proliferation of human gastric cancer cell MGC803． The effect of D1 on the cell cycle distribution of
MGC803 was observed by PI assay and semi-quantitative ＲT-PCＲ assay was used to detect the expression of cell cycle
related genes． The effect of D1 on cell apoptosis of MGC803 was observed by DAPI assay and Cytochrome C immunofluo-
rescence assay． The results showed that D1 obviously inhibited MGC803 proliferation and the IC50 values of 24，48 and
72 h were about 126． 89，74． 81 and 68． 72 μg /mL，respectively． However，D1 did not obviously induce MGC803 cell cy-
cle arrest and did not markedly affect the expression of cell cycle related genes． Furthermore，D1 induced cell apoptosis
by promoting cytochrome C releasing to cytoplasm．
Key words:Ｒanunculus japonicus;human gastric cancer cell;MGC803;cytochrome C;cell apoptosis
胃癌是最常见的恶性肿瘤，在全世界范围内是
发病率最高的癌症之一，仅次于肺癌。中国是胃癌
高发区，占世界胃癌患者的 42%［1-3］。而目前对于
胃癌的治疗主要包括手术治疗、化学治疗、放射治
疗、靶向治疗等，但目前已有的治疗方法均不甚理
想，治愈率低，治疗效果甚微［1］。最近，我们建立了
多种体内外肿瘤干细胞和肿瘤血管生成为主体的肿
瘤形成模型，并应用这些新的模型对 100 余种中草
药进行筛选工作，在体外试验中发现多种常用中药
的组分具有显著的抗癌作用［4，5］。其中，中草药毛
茛科的毛茛具有较好的抗肿瘤作用，经过一系列的
提取纯化我们得到了毛茛中抗癌有效部位 D1。本
研究将在此基础上进一步研究毛茛有效部位 D1 抗
人胃癌细胞 MGC803 细胞增殖和细胞凋亡的作用，
并初步探讨其作用机制。
1 实验材料
1． 1 细胞系
人胃癌细胞 MGC803，为本实验室保存，培养于
DMEM(高糖)培养基。置培养箱内 5% CO2、37 ℃
DOI:10.16333/j.1001-6880.2013.07.007
常规培养，2 d换液 1 次，3 ～ 4 d传代 1 次。
1． 2 主要实验药品
毛茛提取物 D1，用二甲基亚砜(DMSO)溶解，
用 DMEM(高糖)培养基稀释成所需浓度。
1． 3 主要试剂
DMEM(高糖)培养基，购自 HyClone 公司;胎牛
血清(GIBCO 公司) ;胰酶(Trypsin) ，BIOSHAＲP 公
司;瑞-姬氏染液(南京建成科技有限公司) ;DAPI 试
剂购自罗氏公司;ＲNase A:美国 Biomiga 公司;二甲
基亚枫(DMSO)、碘化丙锭(PI) ，购自美国 Sigma 公
司;Alamarblue试剂、Trizol试剂:购自美国 Invitrogen
公司;逆转录试剂盒(#K1622) :Fermentas，美国;
PCＲ试剂盒(DＲ001B) :大中国连宝生物工程有限
公司;GelＲed核酸凝胶染料(41003) :购自美国 Bo-
itium;引物由中国上海生工生物工程技术服务有限
公司合成。
2 实验方法
2． 1 毛茛有效部位 D1 的提取
取干燥的毛茛全草剪碎，分别用 10 倍、8 倍、6
倍重量的 85%乙醇回流提取三次，每次 1． 5 h，抽
滤，合并提取液，减压浓缩回收溶剂至无醇味，分别
用等体积的石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取若干次至有
机溶剂层为浅绿色。回收溶剂得石油醚萃取物、氯
仿萃取物、乙酸乙酯萃取物及下层(水层)。
毛茛氯仿部位上样于 200 ～ 300 目的硅胶柱，乙
酸乙酯-甲醇系统(9∶ 1→1∶ 1)梯度洗脱，收集乙酸乙
酯-甲醇(9∶ 1)流分，回收溶剂，蒸干得膏状物即毛茛
D1 组分。
2． 2 AlamarBlue法检测
96 孔板中每孔接种合适数量的人胃癌细胞
MGC803。培养 24 h 后，更换新鲜培养液，同时分别
加入不同浓度(1． 25 ～ 160 μg /mL)的 D1 组分，对照
组加入含 0． 16% DMSO 的培养基，放入 37 ℃ 5%
CO2 培养箱培养。培养 22、46、70 h后，以 10 μL /孔
加入 Alamarblue 试剂，继续培养 2 h 后在酶标仪上
测定荧光 OD560 /OD590 的比值，并按照文献报道
的方法［6］计算抑制率和半数抑制浓度，实验独立重
复 3 次。
2． 3 瑞-姬氏染色法测定
取对数生长期的人胃癌细胞 MGC803，调整细
胞浓度为 104 /孔，接种于 24 孔培养板内。24 h 后
分别加入含不同浓度 D1 的完全培养基，对照组加
入含 0． 16% DMSO的培养基。48 h后去除培养基，
依次加入瑞-姬氏染液 A 50 μL /孔，静置 1 min，再加
入 100 μL /孔染液 B，混匀后作用 5 min，吸弃染液，
PBS洗 2 次，OLYMPUS FSX-100 拍照，实验独立重
复 3 次。
2． 4 流式细胞仪检测细胞周期
将不同浓度的 D1 处理胃癌细胞 MGC803 24 h
后，收集细胞，PBS洗涤 2 次，加入体积分数为 70%
的乙醇，4 ℃固定过夜。离心洗涤后，加入 5 μL
ＲNase，37 ℃温育 30 min 后，再加入 10 mg /mL 2． 5
μLPI 染液混匀，置 4 ℃避光 30 min后上流式细胞仪
检测细胞周期分布，实验独立重复 3 次。
2． 5 ＲT-PCＲ法检测细胞周期相关 mＲNA的表达
采用 Trizol提取细胞总 ＲNA，逆转录合成 cDNA
(引物序列详见表 1)。PCＲ 反应体系为 25 μL，PCＲ
条件为 94 ℃预变性 3 min;94 ℃变性 30 s，55 ℃退
火 30 s，72 ℃延伸 1 min，22 ～ 35 个循环，72 ℃延伸
8 min。PCＲ产物经 1． 5%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成
像仪拍照，实验独立重复 3 次。
2． 6 DAPI染色
取对数生长期的 MGC803 细胞，接种于 24 孔培
养板内，每孔 1 mL。培养 24 h后，弃培养液，分别加
入含 D1 1． 25 ～ 160 μg /mL的完全培养液，对照组加
入含 0． 16% DMSO的培养基，作用 48 h后 3000 rpm
离心 5 min后用 1%多聚甲醛室温固定 20 min，PBS
洗涤 2 次，去除上清液，加入 1 μg /mL DAPI 溶液作
用 10 min。PBS 洗涤后，OLYMPUS FSX-100 拍照，
实验独立重复 3 次。
2． 7 细胞色素 C免疫荧光
将不同浓度的 D1 处理 MGC803 48 h 后，去除
培养基，用 2%多聚甲醛固定，PBS 洗涤三次后，加
0． 1% Triton X-100 室温通透化 15 min，再用 PBS 漂
洗三次，加 1%BSA封闭 1 h;加抗细胞色素 C一抗 4
℃孵育过夜;用 PBST 去除一抗;加二抗，室温孵育
1h;PBST洗三次，加入 1 μg /mL DAPI 室温作用 30
min;PBST洗三次，OLYMPUS FSX-100 拍照，实验独
立重复 3 次。
2． 8 统计学分析
实验数据以平均值 ± 标准差表示，采用 SPSS
16． 0 统计软件中 Oneway ANOVA进行分析，组间差
异采用 LSD检验。
3 实验结果
869 天然产物研究与开发 Vol. 25
3． 1 毛茛有效部位 D1 对人胃癌细胞 MGC803 增
殖的作用
如图 1 显示，毛茛有效部位 D1 对胃癌细胞
MGC803 表现出较好的增殖抑制作用，且随着药物
浓度的提高和时间的延长，其增殖抑制作用相应地
增强，分别给药 24、48 和 72 h，其对胃癌细胞
MGC803 的半数抑制浓度分别为 126． 89、74． 81 和
68． 72 μg /mL。
瑞-姬氏染色结果显示(图 2) ，D1 对胃癌细胞
MGC803 表现出较好的增殖抑制作用，且随着药物
浓度的提高，对肿瘤细胞增殖抑制作用相应地增强，
当药物浓度达到 20 μg /mL 时，细胞增殖得到显著
抑制。
图 1 毛茛有效部位 D1 对人胃癌细胞 MGC803 增殖的作
用(Alamar Blue方法)
Fig. 1 Effect of Ｒ． japonicus compontent D1 on human gas-
tric cancer cell MGC803 proliferation (Alamar Blue
assay)
图 2 毛茛有效部位 D1 对人胃癌细胞 MGC803 增殖的作用(瑞吉姆萨染色)
Fig. 2 Effect of Ｒ． japonicus compontent D1 on human gastric cancer cell MGC803 proliferation (Wright － Giemsa assay)
3． 2 毛茛有效部位 D1 对人胃癌细胞 MGC803 细
胞周期和周期相关基因表达的影响
流式细胞仪检测结果显示:随着 D1 浓度的增
高，MGC803 细胞周期并无变化，可见 D1 对
MGC803 细胞周期的影响不大(图 3)。为进一步验
证 D1 对人胃癌细胞 MGC803 细胞周期的影响，我
们采用 ＲT-PCＲ的方法检测了一系列细胞周期相关
基因的表达情况。如图 4 所示，毛茛有效部位 D1
对细胞周期相关基因 p21、p53、Cyclin D1、Cyclin D3
和 CDK4 的表达无明显影响。以上两个实验结果提
示毛茛有效部位 D1 对人胃癌细胞 MGC803 增殖的
抑制并不是通过抑制细胞周期的进程实现的。
3． 3 毛茛有效部位 D1 诱导人胃癌细胞 MGC803
凋亡的影响
如图 5 所示，随着 D1 浓度的增高，MGC803 细
胞凋亡的比例逐渐增加。免疫荧光结果显示(图
6) ，对照组人胃癌细胞 MGC803 中细胞色素 C 染色
呈现点状，表明其位于线粒体内，反映线粒体的分
布。给予 60 μg /mL毛茛有效部位 D1 作用 48 h后，
可以看到多数细胞呈现出弥漫的胞浆染色，提示毛
茛有效部位 D1 能促使细胞色素 C 从线粒体向胞浆
释放。
969Vol. 25 朱峰妍等:毛茛有效部位 D1 对人胃癌细胞 MGC803 细胞增殖和凋亡的作用及其机制的初步研究
图 3 毛茛有效部位 D1 对人胃癌细胞 MGC803 细胞周期的作用
Fig. 3 Effect of Ｒ． japonicus compontent D1 on human gastric cancer cell MGC803 cell cycle
图 4 毛茛有效部位 D1 对人胃癌细胞 MGC803 细
胞周期相关基因表达的作用
Fig. 4 Effect of Ｒ． japonicus compontent D1 on human gastric
cancer cell MGC803 cell cycle related genes
图 5 毛茛有效部位 D1 对人胃癌细胞 MGC803 细胞凋亡
的作用(DAPI染色，400 ×)
Fig. 5 Effect of Ｒ． japonicus compontent D1 on human gas-
tric cancer cell MGC803 cell apoptosis (DAPI stai-
ning，400 ×)
表 1 各目的基因的引物序列表
Table 1 Target gene sequences of the primers
基因
Gene
(mＲNA ID)
引物
Primers
引物序列(5-3)
Primer sequence(5-3)
PCＲ产物大小
PCＲ product size (bp)
β － actin 上游引物 AAGAGCTACGAGCTGCCTGACG 420
(NM_001101． 3) 下游引物 CGCCTAGAAGCATTTGCGGTGG
079 天然产物研究与开发 Vol. 25
p21 上游引物 CTGCCTTAGTCTCAGTTTGTGTGT 412
(NM_000389． 3) 下游引物 CAAAGTGCCATCTGTTTACTTCTC
p53 上游引物 GGGAGTAGGACATACCAGCTTAGAT 452
(NM_000546． 4) 下游引物 TTAGGTACTAAGGTTCACCAAGAGG
Cyclin D1 上游引物 CATCTCTGTACTTTGCTTGCTCAT 499
(NM_053056． 2) 下游引物 CGCTATTTCCTACACCTATTGGAC
Cyclin D3 上游引物 GGACAGAATTGGATACATACACCA 405
(NM_001136017． 2) 下游引物 CCCATTATGTCCTCTTAAAGTTGTG
CDK4 上游引物 CTTGATCTGAGAATGGCTACCTCT 409
(NM_000075． 2) 下游引物 CATGAAGGAAATCTAGGCCTCTTA
图 6 毛茛有效部位 D1 对人胃癌细胞 MGC803 细胞
色素 C转位的作用(400 ×)
Fig. 6 Effect of Ｒ． japonicus compontent D1 on human
gastric cancer cell MGC803 cytochrome C translo-
cation (400 ×)
4 讨论
目前我国每年新发胃癌患者 40 万人，死亡人数
高达 30 万。胃癌是仅次于肺癌的第二大常见恶性
肿瘤，我国胃癌死亡率占所有恶性肿瘤死亡率的
23． 2%［2，3］。因此，研发新型抗胃癌新药是目前治
疗该疾病的当务之急。近年来，人们采用最新科学
技术发掘中医药宝库，开展中药有效部位、有效组
份、有效成分的创新中药研究，并取得了可喜的进
展，给癌症患者带来了新的希望。
毛茛(Ｒ． japonicus Thumb)是多年生草本毛茛科
毛茛属植物，分布广泛。该植物及其提取物具有镇
痛、消炎、抗菌、增强记忆力等多种活性［7-10］。在民
间广泛用于治疗黄疸、结核、肝炎等病。但是，关于
毛茛的抗肿瘤作用目前尚未见报道。
在本研究中我们利用抗癌活性追踪法对毛茛中
的抗癌活性成分进行追踪，结果发现毛茛的氯仿有
效部位 D1 具有很好的抗癌作用。毛茛氯仿有效部
位 D1 能够明显地抑制人胃癌细胞 MGC803 细胞增
殖，进一步的研究显示毛茛氯仿有效部位 D1 能够
特异性地通过促进细胞色素 C 从线粒体释放到胞
浆而诱导细胞凋亡，但对细胞周期及细胞周期相关
基因的表达无明显抑制作用。
综上所述，毛茛氯仿提取物 D1 通过促使细胞
色素 C 释放到细胞胞浆而诱导细胞凋亡，从而抑制
人胃癌细胞 MGC803 增殖。由于毛茛属于天然药
物，毒副作用小，来源广泛，将其制成注射液、颗粒
剂、煎剂等使其用药方式多样化，克服现有抗肿瘤药
物的局限性。我们将对其做进一步深入研究，有可
能成为新一代抗肿瘤的有效药用前体。
参考文献
1 De Vita F，Giuliani F，Silvestris N，et al． Current status of
targeted therapies in advanced gastric cancer． Exp Opin Ther
Targets，2012，16(Suppl 2) :S29-34．
2 Zhang W(张雯)，Wang JW(王金万)． The epidemiology and
grouping of gastric cancer． Chin General Med:Doctors Ｒeaders
Ver (中国全科医学:医生读者版)，2010，11:16-17．
3 Wu B(吴波) ，Fu WZ(付文政)． A review of epidemiology
of gastric cancer in the east and west． Clin Misdiag Misther
(临床误诊误治) ，2007，20(3) :9-12．
4 Liu Ｒ，Cao Z，Tu J，et al． Lycorine hydrochloride inhibits me-
tastatic melanoma cell-dominant vasculogenic mimicry． Pig-
ment Cell Melanoma Ｒes，2012，25:630-638．
5 Feng Y，Zhang S，Tu J，et al． A novel function of scutellarin
in the inhibiting cell proliferation and inducing cell apoptosis
of human Burkitts lymphoma Namalwa cells． Leuk Lympho-
ma，2012，53:2456-2464．
(下转第 948 页)
179Vol. 25 朱峰妍等:毛茛有效部位 D1 对人胃癌细胞 MGC803 细胞增殖和凋亡的作用及其机制的初步研究
存在着较大的成本问题。
水代法作为一种传统的民间取油工艺在小磨麻
油中广泛应用，其原理是用水将油从松散的细胞体
系中取代出来，过程温和，对油的品质保存良好，同
时因将水作为提取的介质，故油品安全性高，但不足
的是该工艺提取率较低，只有 60% ～ 65%。本实验
表明，不同提取方法对油品理化性质的影响不同，在
折射率上几乎不变，但酸价、色泽、VE等指标差别较
大。原因可能为折射率为特征性常数，比较稳定;而
酸价、色泽和 VE等指标较不稳定，易受加工条件的
影响，当提取过程比较剧烈时则会引起酸价和色泽
的上升，以及敏感成分 VE的破坏，因此为了保持油
脂和蛋白质较好的品质应选用提取过程较为温和的
水代法进行提油。
4 结论
从油脂提取率上讲，萃取法显著高于压榨法和
水代法，但存在成本和安全问题;从油品质量和蛋白
变性程度来讲，水代法提油工艺不仅对油品质量保
存较好，而且对蛋白的性质影响较小，有利于资源的
高效综合利用，有进一步深入研究的价值。
参考文献
1 Qian XS(钱学射) ，Zhang WM(张卫明) ，Gu GP(顾龚
平) ，et al． Sliybum maruianum oil-a deserving development
resource． Chin Wild Plant Ｒes(中国野生植物资源) ，2006，
25(5) :13-16．
2 He WM(何维明) ，Xu MD(许牡丹) ，Yang J(杨菁) ，et al．
Nutritional compositions of Sliybum maruianum gaertn seed
oil and its hypolipdemic effect in rats． Acta Nutri Sin(营养
学报) ，1996，18:163-167．
3 Wang WM(王维敏) ，Liang X(梁霄) ，Liang ZS(梁宗锁) ，
et al． Ｒefining technology of Milk Thistle seed oil． J North-
west Forestry Univ(西北林学院学报) ，2012，27:143-148．
4 Gu YB(郭玉宝) ，Tang B(汤斌) ，Qiu AY(裘爱泳)． Tech-
nology for aqueous extraction of camellia seed oil． Trans
CSAE(农业工程学报) ，2008，24:249-252．
5 Shen XY(沈心妤) ，Xu SY(许时缨)． Supercritical CO2 ex-
traction of tomato seed oil． J Wuxi Univ Light Ind(无锡轻工
大学学报) ，2004，23:121-124．
6 Standardization administration of the People’s Ｒepublic of
China(国家标准化管理委员会)． Chinas Mandatory Na-
tional Standards Assembly(Food volume)． Beijing:China
Standard Publishing Press，2003． 18-22．
7 Chen XL(陈晓亮) ，Wang SP(王世平) ，Liu H(刘欢)．
Ｒapid analysis and evaluation of freshness of chilled pork
based on color difference． Food Sci(食品科学) ，2012，33:
204-208．
8 Wang LJ(王立君) ，Li LT(李里特) ，Zhang XF(张晓峰) ，
et al． Study on soybean protein heating denaturation by DSC．
J China Agric Univ(中国农业大学学报) ，2001，6(6) :93-
96．
9 Zhu ZB(朱振宝) ，Yi JH(易建华) ，Tian CＲ(田呈瑞)．
Effects of different extraction methods on properties of Wal-
nut oils． Food Ferment Ind(食品与发酵工业) ，2005，31:
櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵
137-140．
(上接第 971 页)
6 Zhao B(赵斌) ，Ge JF(葛金芳) ，Zhu JJ(朱娟娟) ，et al．
The calculating methods in measuring IC50 of cell prolifera-
tion inhibitory rate by MTT assay． Anhui Med Pharm J，
2007，11:834-836．
7 Qin ＲL(秦汝兰) ，Meng QS(孟庆双)． Effects of total sapo-
nins from Ｒanunculus japonicus thunb． on anti-hypoxia and
memory ability of mice． J Anhui Agric Sci (安徽农业科学) ，
2011，39:13404，13406．
8 Yang ZC(杨智承) ，Liu SJ(刘守钾) ，Liu Yuan( (刘苑) ，et
al． Effects of total glycosides total glycosides of Ｒanunculus
japonicus (TGＲJ)on the hemodynamics in anesthetic rats．
Pharmacol Clinics(中药药理与临床) ，2011，27(2) :81-84．
9 Su B(苏波)． A research on the extraction of saponin from
rnauneuusl and its preliminary bacteria functions． J Huaihua
Univ (怀化学院学报) ，2011，30(2) :53-56．
10 Wang ＲL(王榕乐) ，Tan YZ(谭毓治) ，Luo SB(罗绍宝)．
Anti-inflammatory and analgesic effect of total glycosides of
Ｒanunculus japonicus． Lishizhen Med Mater Med Ｒes(时珍国
医国药) ，2009，20:290-292．
849 天然产物研究与开发 Vol. 25