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毛茛有效部位D1对人胃癌细胞MGC803细胞增殖和凋亡的作用及其机制的初步研究



全 文 :收稿日期:2012-11-13 接受日期:2013-03-20
基金项目:苏州市科技支撑计划项目(SS201004)
* 通讯作者 Tel:86-512-65190599;E-mail:zhenlungu. 2003@ 163. com
天然产物研究与开发 Nat Prod Res Dev 2013,25:967-971,948
文章编号:1001-6880(2013)7-0967-06
毛茛有效部位 D1 对人胃癌细胞 MGC803 细胞增
殖和凋亡的作用及其机制的初步研究
朱峰妍1,虞 迪2,成旭东1,曹志飞2,王薇丹1,鲍美美2,蒋小岗1,顾振纶1*
1 苏州大学 苏州中药研究所,苏州 215007;2苏州大学医学部,苏州 215123
摘 要:采用 AlamarBlue和瑞-姬氏染色方法检测毛茛有效部位 D1 对人胃癌细胞 MGC803 增殖的作用;PI染色
法观察 D1 对 MGC803 细胞周期的影响;半定量 RT-PCR法检测 D1 对 MGC803 细胞周期相关基因表达的作用;
用 DAPI染色方法和细胞色素 C免疫荧光法观察 D1 对胃癌细胞 MGC803 凋亡的影响。结果显示,毛茛有效部
位 D1 对胃癌细胞 MGC803 表现出较好的增殖抑制作用,且 24、48 和 72 h 的半数抑制浓度分别为 126. 89、
74. 81、68. 72 μg /mL;同时 D1 对细胞周期和周期相关基因的表达无明显影响,且 D1 能促使细胞色素 C 释放到
细胞胞浆诱导细胞凋亡。
关键词:毛茛;人胃癌细胞;MGC803;细胞色素 C;细胞凋亡
中图分类号:R284 文献标识码:A
Preliminary Study of Effect and Mechanisms of Ranunculus japonicus Component
D1 on Human Gastric Cancer Cell MGC803 Proliferation and Apoptosis
ZHU Feng-yan1,YU Di2,CHENG Xu-dong1,CAO Zhi-fei2,
WANG Wei-dan1,BAO Mei-mei2,JIANG Xiao-gang1,GU Zhen-lun1*
1Suzhou Institute of Chinese Materia Medica,Suzhou,215007,China;2Medical College of Soochow University,Suzhou,215123,China
Abstract:Alamar Blue assay and Wright-Giemsa assay were used to determine the effect of Rannunculus japonicas com-
ponent D1 on the proliferation of human gastric cancer cell MGC803. The effect of D1 on the cell cycle distribution of
MGC803 was observed by PI assay and semi-quantitative RT-PCR assay was used to detect the expression of cell cycle
related genes. The effect of D1 on cell apoptosis of MGC803 was observed by DAPI assay and Cytochrome C immunofluo-
rescence assay. The results showed that D1 obviously inhibited MGC803 proliferation and the IC50 values of 24,48 and
72 h were about 126. 89,74. 81 and 68. 72 μg /mL,respectively. However,D1 did not obviously induce MGC803 cell cy-
cle arrest and did not markedly affect the expression of cell cycle related genes. Furthermore,D1 induced cell apoptosis
by promoting cytochrome C releasing to cytoplasm.
Key words:Ranunculus japonicus;human gastric cancer cell;MGC803;cytochrome C;cell apoptosis
胃癌是最常见的恶性肿瘤,在全世界范围内是
发病率最高的癌症之一,仅次于肺癌。中国是胃癌
高发区,占世界胃癌患者的 42%[1-3]。而目前对于
胃癌的治疗主要包括手术治疗、化学治疗、放射治
疗、靶向治疗等,但目前已有的治疗方法均不甚理
想,治愈率低,治疗效果甚微[1]。最近,我们建立了
多种体内外肿瘤干细胞和肿瘤血管生成为主体的肿
瘤形成模型,并应用这些新的模型对 100 余种中草
药进行筛选工作,在体外试验中发现多种常用中药
的组分具有显著的抗癌作用[4,5]。其中,中草药毛
茛科的毛茛具有较好的抗肿瘤作用,经过一系列的
提取纯化我们得到了毛茛中抗癌有效部位 D1。本
研究将在此基础上进一步研究毛茛有效部位 D1 抗
人胃癌细胞 MGC803 细胞增殖和细胞凋亡的作用,
并初步探讨其作用机制。
1 实验材料
1. 1 细胞系
人胃癌细胞 MGC803,为本实验室保存,培养于
DMEM(高糖)培养基。置培养箱内 5% CO2、37 ℃
DOI:10.16333/j.1001-6880.2013.07.007
常规培养,2 d换液 1 次,3 ~ 4 d传代 1 次。
1. 2 主要实验药品
毛茛提取物 D1,用二甲基亚砜(DMSO)溶解,
用 DMEM(高糖)培养基稀释成所需浓度。
1. 3 主要试剂
DMEM(高糖)培养基,购自 HyClone 公司;胎牛
血清(GIBCO 公司) ;胰酶(Trypsin) ,BIOSHARP 公
司;瑞-姬氏染液(南京建成科技有限公司) ;DAPI 试
剂购自罗氏公司;RNase A:美国 Biomiga 公司;二甲
基亚枫(DMSO)、碘化丙锭(PI) ,购自美国 Sigma 公
司;Alamarblue试剂、Trizol试剂:购自美国 Invitrogen
公司;逆转录试剂盒(#K1622) :Fermentas,美国;
PCR试剂盒(DR001B) :大中国连宝生物工程有限
公司;GelRed核酸凝胶染料(41003) :购自美国 Bo-
itium;引物由中国上海生工生物工程技术服务有限
公司合成。
2 实验方法
2. 1 毛茛有效部位 D1 的提取
取干燥的毛茛全草剪碎,分别用 10 倍、8 倍、6
倍重量的 85%乙醇回流提取三次,每次 1. 5 h,抽
滤,合并提取液,减压浓缩回收溶剂至无醇味,分别
用等体积的石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取若干次至有
机溶剂层为浅绿色。回收溶剂得石油醚萃取物、氯
仿萃取物、乙酸乙酯萃取物及下层(水层)。
毛茛氯仿部位上样于 200 ~ 300 目的硅胶柱,乙
酸乙酯-甲醇系统(9∶ 1→1∶ 1)梯度洗脱,收集乙酸乙
酯-甲醇(9∶ 1)流分,回收溶剂,蒸干得膏状物即毛茛
D1 组分。
2. 2 AlamarBlue法检测
96 孔板中每孔接种合适数量的人胃癌细胞
MGC803。培养 24 h 后,更换新鲜培养液,同时分别
加入不同浓度(1. 25 ~ 160 μg /mL)的 D1 组分,对照
组加入含 0. 16% DMSO 的培养基,放入 37 ℃ 5%
CO2 培养箱培养。培养 22、46、70 h后,以 10 μL /孔
加入 Alamarblue 试剂,继续培养 2 h 后在酶标仪上
测定荧光 OD560 /OD590 的比值,并按照文献报道
的方法[6]计算抑制率和半数抑制浓度,实验独立重
复 3 次。
2. 3 瑞-姬氏染色法测定
取对数生长期的人胃癌细胞 MGC803,调整细
胞浓度为 104 /孔,接种于 24 孔培养板内。24 h 后
分别加入含不同浓度 D1 的完全培养基,对照组加
入含 0. 16% DMSO的培养基。48 h后去除培养基,
依次加入瑞-姬氏染液 A 50 μL /孔,静置 1 min,再加
入 100 μL /孔染液 B,混匀后作用 5 min,吸弃染液,
PBS洗 2 次,OLYMPUS FSX-100 拍照,实验独立重
复 3 次。
2. 4 流式细胞仪检测细胞周期
将不同浓度的 D1 处理胃癌细胞 MGC803 24 h
后,收集细胞,PBS洗涤 2 次,加入体积分数为 70%
的乙醇,4 ℃固定过夜。离心洗涤后,加入 5 μL
RNase,37 ℃温育 30 min 后,再加入 10 mg /mL 2. 5
μLPI 染液混匀,置 4 ℃避光 30 min后上流式细胞仪
检测细胞周期分布,实验独立重复 3 次。
2. 5 RT-PCR法检测细胞周期相关 mRNA的表达
采用 Trizol提取细胞总 RNA,逆转录合成 cDNA
(引物序列详见表 1)。PCR 反应体系为 25 μL,PCR
条件为 94 ℃预变性 3 min;94 ℃变性 30 s,55 ℃退
火 30 s,72 ℃延伸 1 min,22 ~ 35 个循环,72 ℃延伸
8 min。PCR产物经 1. 5%琼脂糖凝胶电泳,凝胶成
像仪拍照,实验独立重复 3 次。
2. 6 DAPI染色
取对数生长期的 MGC803 细胞,接种于 24 孔培
养板内,每孔 1 mL。培养 24 h后,弃培养液,分别加
入含 D1 1. 25 ~ 160 μg /mL的完全培养液,对照组加
入含 0. 16% DMSO的培养基,作用 48 h后 3000 rpm
离心 5 min后用 1%多聚甲醛室温固定 20 min,PBS
洗涤 2 次,去除上清液,加入 1 μg /mL DAPI 溶液作
用 10 min。PBS 洗涤后,OLYMPUS FSX-100 拍照,
实验独立重复 3 次。
2. 7 细胞色素 C免疫荧光
将不同浓度的 D1 处理 MGC803 48 h 后,去除
培养基,用 2%多聚甲醛固定,PBS 洗涤三次后,加
0. 1% Triton X-100 室温通透化 15 min,再用 PBS 漂
洗三次,加 1%BSA封闭 1 h;加抗细胞色素 C一抗 4
℃孵育过夜;用 PBST 去除一抗;加二抗,室温孵育
1h;PBST洗三次,加入 1 μg /mL DAPI 室温作用 30
min;PBST洗三次,OLYMPUS FSX-100 拍照,实验独
立重复 3 次。
2. 8 统计学分析
实验数据以平均值 ± 标准差表示,采用 SPSS
16. 0 统计软件中 Oneway ANOVA进行分析,组间差
异采用 LSD检验。
3 实验结果
869 天然产物研究与开发 Vol. 25
3. 1 毛茛有效部位 D1 对人胃癌细胞 MGC803 增
殖的作用
如图 1 显示,毛茛有效部位 D1 对胃癌细胞
MGC803 表现出较好的增殖抑制作用,且随着药物
浓度的提高和时间的延长,其增殖抑制作用相应地
增强,分别给药 24、48 和 72 h,其对胃癌细胞
MGC803 的半数抑制浓度分别为 126. 89、74. 81 和
68. 72 μg /mL。
瑞-姬氏染色结果显示(图 2) ,D1 对胃癌细胞
MGC803 表现出较好的增殖抑制作用,且随着药物
浓度的提高,对肿瘤细胞增殖抑制作用相应地增强,
当药物浓度达到 20 μg /mL 时,细胞增殖得到显著
抑制。
图 1 毛茛有效部位 D1 对人胃癌细胞 MGC803 增殖的作
用(Alamar Blue方法)
Fig. 1 Effect of R. japonicus compontent D1 on human gas-
tric cancer cell MGC803 proliferation (Alamar Blue
assay)
图 2 毛茛有效部位 D1 对人胃癌细胞 MGC803 增殖的作用(瑞吉姆萨染色)
Fig. 2 Effect of R. japonicus compontent D1 on human gastric cancer cell MGC803 proliferation (Wright - Giemsa assay)
3. 2 毛茛有效部位 D1 对人胃癌细胞 MGC803 细
胞周期和周期相关基因表达的影响
流式细胞仪检测结果显示:随着 D1 浓度的增
高,MGC803 细胞周期并无变化,可见 D1 对
MGC803 细胞周期的影响不大(图 3)。为进一步验
证 D1 对人胃癌细胞 MGC803 细胞周期的影响,我
们采用 RT-PCR的方法检测了一系列细胞周期相关
基因的表达情况。如图 4 所示,毛茛有效部位 D1
对细胞周期相关基因 p21、p53、Cyclin D1、Cyclin D3
和 CDK4 的表达无明显影响。以上两个实验结果提
示毛茛有效部位 D1 对人胃癌细胞 MGC803 增殖的
抑制并不是通过抑制细胞周期的进程实现的。
3. 3 毛茛有效部位 D1 诱导人胃癌细胞 MGC803
凋亡的影响
如图 5 所示,随着 D1 浓度的增高,MGC803 细
胞凋亡的比例逐渐增加。免疫荧光结果显示(图
6) ,对照组人胃癌细胞 MGC803 中细胞色素 C 染色
呈现点状,表明其位于线粒体内,反映线粒体的分
布。给予 60 μg /mL毛茛有效部位 D1 作用 48 h后,
可以看到多数细胞呈现出弥漫的胞浆染色,提示毛
茛有效部位 D1 能促使细胞色素 C 从线粒体向胞浆
释放。
969Vol. 25 朱峰妍等:毛茛有效部位 D1 对人胃癌细胞 MGC803 细胞增殖和凋亡的作用及其机制的初步研究
图 3 毛茛有效部位 D1 对人胃癌细胞 MGC803 细胞周期的作用
Fig. 3 Effect of R. japonicus compontent D1 on human gastric cancer cell MGC803 cell cycle
图 4 毛茛有效部位 D1 对人胃癌细胞 MGC803 细
胞周期相关基因表达的作用
Fig. 4 Effect of R. japonicus compontent D1 on human gastric
cancer cell MGC803 cell cycle related genes
图 5 毛茛有效部位 D1 对人胃癌细胞 MGC803 细胞凋亡
的作用(DAPI染色,400 ×)
Fig. 5 Effect of R. japonicus compontent D1 on human gas-
tric cancer cell MGC803 cell apoptosis (DAPI stai-
ning,400 ×)
表 1 各目的基因的引物序列表
Table 1 Target gene sequences of the primers
基因
Gene
(mRNA ID)
引物
Primers
引物序列(5-3)
Primer sequence(5-3)
PCR产物大小
PCR product size (bp)
β - actin 上游引物 AAGAGCTACGAGCTGCCTGACG 420
(NM_001101. 3) 下游引物 CGCCTAGAAGCATTTGCGGTGG
079 天然产物研究与开发 Vol. 25
p21 上游引物 CTGCCTTAGTCTCAGTTTGTGTGT 412
(NM_000389. 3) 下游引物 CAAAGTGCCATCTGTTTACTTCTC
p53 上游引物 GGGAGTAGGACATACCAGCTTAGAT 452
(NM_000546. 4) 下游引物 TTAGGTACTAAGGTTCACCAAGAGG
Cyclin D1 上游引物 CATCTCTGTACTTTGCTTGCTCAT 499
(NM_053056. 2) 下游引物 CGCTATTTCCTACACCTATTGGAC
Cyclin D3 上游引物 GGACAGAATTGGATACATACACCA 405
(NM_001136017. 2) 下游引物 CCCATTATGTCCTCTTAAAGTTGTG
CDK4 上游引物 CTTGATCTGAGAATGGCTACCTCT 409
(NM_000075. 2) 下游引物 CATGAAGGAAATCTAGGCCTCTTA
图 6 毛茛有效部位 D1 对人胃癌细胞 MGC803 细胞
色素 C转位的作用(400 ×)
Fig. 6 Effect of R. japonicus compontent D1 on human
gastric cancer cell MGC803 cytochrome C translo-
cation (400 ×)
4 讨论
目前我国每年新发胃癌患者 40 万人,死亡人数
高达 30 万。胃癌是仅次于肺癌的第二大常见恶性
肿瘤,我国胃癌死亡率占所有恶性肿瘤死亡率的
23. 2%[2,3]。因此,研发新型抗胃癌新药是目前治
疗该疾病的当务之急。近年来,人们采用最新科学
技术发掘中医药宝库,开展中药有效部位、有效组
份、有效成分的创新中药研究,并取得了可喜的进
展,给癌症患者带来了新的希望。
毛茛(R. japonicus Thumb)是多年生草本毛茛科
毛茛属植物,分布广泛。该植物及其提取物具有镇
痛、消炎、抗菌、增强记忆力等多种活性[7-10]。在民
间广泛用于治疗黄疸、结核、肝炎等病。但是,关于
毛茛的抗肿瘤作用目前尚未见报道。
在本研究中我们利用抗癌活性追踪法对毛茛中
的抗癌活性成分进行追踪,结果发现毛茛的氯仿有
效部位 D1 具有很好的抗癌作用。毛茛氯仿有效部
位 D1 能够明显地抑制人胃癌细胞 MGC803 细胞增
殖,进一步的研究显示毛茛氯仿有效部位 D1 能够
特异性地通过促进细胞色素 C 从线粒体释放到胞
浆而诱导细胞凋亡,但对细胞周期及细胞周期相关
基因的表达无明显抑制作用。
综上所述,毛茛氯仿提取物 D1 通过促使细胞
色素 C 释放到细胞胞浆而诱导细胞凋亡,从而抑制
人胃癌细胞 MGC803 增殖。由于毛茛属于天然药
物,毒副作用小,来源广泛,将其制成注射液、颗粒
剂、煎剂等使其用药方式多样化,克服现有抗肿瘤药
物的局限性。我们将对其做进一步深入研究,有可
能成为新一代抗肿瘤的有效药用前体。
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179Vol. 25 朱峰妍等:毛茛有效部位 D1 对人胃癌细胞 MGC803 细胞增殖和凋亡的作用及其机制的初步研究
存在着较大的成本问题。
水代法作为一种传统的民间取油工艺在小磨麻
油中广泛应用,其原理是用水将油从松散的细胞体
系中取代出来,过程温和,对油的品质保存良好,同
时因将水作为提取的介质,故油品安全性高,但不足
的是该工艺提取率较低,只有 60% ~ 65%。本实验
表明,不同提取方法对油品理化性质的影响不同,在
折射率上几乎不变,但酸价、色泽、VE等指标差别较
大。原因可能为折射率为特征性常数,比较稳定;而
酸价、色泽和 VE等指标较不稳定,易受加工条件的
影响,当提取过程比较剧烈时则会引起酸价和色泽
的上升,以及敏感成分 VE的破坏,因此为了保持油
脂和蛋白质较好的品质应选用提取过程较为温和的
水代法进行提油。
4 结论
从油脂提取率上讲,萃取法显著高于压榨法和
水代法,但存在成本和安全问题;从油品质量和蛋白
变性程度来讲,水代法提油工艺不仅对油品质量保
存较好,而且对蛋白的性质影响较小,有利于资源的
高效综合利用,有进一步深入研究的价值。
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