全 文 ：3 8 0 药学学报 A o t a P h a rm a o e u t i ( a S i n i e a 2 0 04 , 3 9 ( 5 ) : 38 0 一 3 84
西红柿凝集素修饰脂质体对小鼠口服吸收胰岛素的促进作用
张 娜 ’ .2 , 平其能 ’ 关 , 徐文方 2
( 1
. 中国药科大学 , 江苏 南京 21 0 0 0 9 ; 2 . 山东大学 , 山东 济南 25 0 12)
摘要 : 目的 研究 西红柿凝集素修饰 的胰 岛素脂质体在小 鼠胃肠道 吸收作用 方法 采用碳二 亚胺交联法 制
备西红柿凝集素 f T )L 修饰 的磷脂酞 乙醇胺 ( P )E , 将 rI 一 P E 掺人胰岛素脂质体中制成凝集素修饰脂质体并证 实 IT 凝
集活性不受影响 。 分别对 正常小 鼠及糖尿病模 型小 鼠灌胃给予 350 , l · k吕一 ’胰岛素的修饰脂质体溶液 , 用葡萄糖酶试
剂盒测定小 鼠血糖 , 并 与同剂量普通胰岛素脂质体 比较 。 结果 : E常小 鼠中 , 西 红柿凝集素修饰脂质体在 4 h 血糖
降至初始水平的 ( 85 士 5) % , s h 降至 ( 54 士 1 1) % , 12 h 为 (57 士 6) % 。 胰岛素普通脂质体几乎没有降糖作用 , 与生理盐
水对照组相 当 一 _ 糖尿病模 型小 鼠中 , 西红柿凝集素修饰脂质体在 4 h 血糖降至初始水平的 ( 38 土 13) % , s h 降至 (50 士
! 5) %
,
12 } 1 为 ( 5( ) 士 16) % 。 结论 西红柿凝集素修饰 的脂质体可能通过 与细胞表 面特异性受体的结合作用促进大
分子药物的 胃肠吸收
关键词 : 胰 岛素 ; 西红柿凝集素 ; 脂质体 ; 血糖
中图分类号 : R 94 3 4 文献标 识码 : A 文章编号 : 0 5 1 3 一 4 87 0 ( 2朋 4 ) 0 5 一 0 3 80 一 0 5
T h e e n h a n c i n g e fe
c t o f t o m a t o l e c it n m o d i if e d IIP o s o m e s
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( 1
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bi o l o g ie a l a e t iv i t i e s aft
e r s y n th e s i s a n d in e o印o ar t io n . Wh e n T I m o d i if e d l i P o s o m e s w e er a d m i n i s t ar t e d o ar l l y t o
th e n o r m沮 m ie e o r d ia b e t i e m i( e a t i n s u l in d o 、 e o f 3 5 o u · k g 一 ’ , th e h y p o g l y e e m i e e fe ( : t w a s d e t e mr i n a t e d
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o t h e b lo o d g l u e o s e l e v e l
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. 几 e g lu e o s e l e v e ls w e r e ( 8 5 土 5 ) % a t 4 h , ( 54 士 川 % a t s h , ( 5 7 士 6 ) % a t 12 h
p o s t do s e e o m p a er d w i th t h e g l u e o s e ] e v e ls p ir o r t o o ar l a d m in i s tar t i o n er s p e e t iv e l y
.
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Th e b l o o d g l u e o s e l e v e l s o f th e di a be t i e m i e e w e er o bv i o u s l y
er d u e e d b y T L m o d iif e d l i p o s o m e s
, th e g l u e ( ) 、 e l e v e l s w e er ( 3 8 士 13 )% a t 4 h
,
( 5 0 士 15 ) % a t s h
,
( 50 土
16 ) %
a t 12 h er s p e e t i v e l y
.
C o cn lus i o n T l m
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.
K e y w o r d s : i n s u li n ; t o m a t o l e e t i n ; l i p o 、 o m e s ; b l o o d gl
u e o s e
凝集素 ( le d in) 是 自然界广泛存 在的一类蛋 白
质或糖蛋白 。 大量研究已确证凝集素可选择性识别
收稿 日期 : 2 00 3一 0 7一 14 .
基金项 目 : 国家 自然科学基金资助重点项 目 ( 3 993 0 20 少.
’ 通讯作者 孔一: 86 一 2 5 一 犯7 13 2 1 . E 一m a i l : p i n g q n @ 〔: p u . e d u
细胞膜糖脂或糖蛋白糖链 的糖基 。 肠细胞表面抗原
决定簇大多 由多糖或寡糖链表达 ,凝集素可特异识
别并与之结合 , 因此凝集素可用作定位因子与药物
或载体结合而达到靶 向作用 〔’ } 。 与高分子粘附在胃
肠粘液层不同 ,凝集素结合在细胞表面 ,可引起或增
DOI : 10. 16438 /j . 0513 -4870. 2004. 05. 015
张 娜等 :西红柿凝集素修饰脂质体对小 鼠口服吸收胰岛素的促进作用
强细胞内吞作用或细胞间转运 〔’ 〕 , 脂质体因其与细
胞膜的亲和性 、 无毒性等优点而作 为凝集素介导的
微粒载体之一 〔’ 〕 。
西红柿凝集素 ( T )L 来 源于西 红柿的植物凝集
素 ,无毒 、无免疫原性 ,一般人可耐受长期生食西红
柿而 无任何 不 良反应 。 T L 特异 识别 小肠 上皮 细
胞冈 , 可抵抗消化道的酸和酶 ,与小肠绒毛结合而无
任何毒性 , 因而 T L 在生物粘附给药系统研究中倍受
关注 。 T L 介导的给药系统可靶 向小肠上皮细胞 , 延
长给药系统 在吸收部 位 的停 留时间 , 增 加浓 度梯
度 5[] 。 本文以胰岛素为模拟药物 , 制备西红柿凝集
素修饰的胰 岛素脂质体 , 研究小鼠灌 胃给予该脂质
体后的降血糖作用 ,探讨凝集素修饰脂质体作为生
物大分子药物 口服给药系统的可能性 , 并初步验证
小肠上皮细胞在微粒转运中的作用 。
材料与方法
仪器 JY一 9 2 H 型超声波细胞粉碎机 (宁波新芝
科器研究所 ) ; A g i l e n t l 一0 0 HPL C 系统 (包括 D A D 一二
级阵列检测器 、 四元梯度泵 、 1 10 0 数据工作站 ,美 国
安捷 伦 ) ; uL n a e l s 色 谱 柱 ( 4 . 6 m m x 2 5 0 m m , 配
S e c u ir t y G u a dr T M 3 m m 保 护柱 ,美 国 外 e n o m e n e x 公
司 ) : Z e t a s i z e r 3 0 0 0 S H 激光测粒仪 ( M a lv e rn I n s t ur m e n t s
tL d
.
)
。
试剂 西红柿凝集 素 ( T L , iS gam ) ; 磷脂 酞乙醇
胺 ( P E , iS gm a ) ;l 一乙 基一 3 一 ( 3 ` 一二 甲氨基丙基 )碳化 一二
亚胺 ( E D C , F lu k a ) ; 2 , 4 , 6一三 硝 基 苯 磺 酸 ( TN B S ,
s i gm a ) : 血型糖蛋白 ( g l y e o p h o ir n e , S ig m a ) ; 胰岛素 (徐
州生化制药厂 ,批号 02 08 05 ,效价 28 u · m g 一 ’ ;) 注射
用大豆磷脂 (上海浦江磷脂有限公司 ,批号 0 2 0 527 ) ;
葡萄糖酶测 定试剂盒 (上海荣 盛生物技术 有 限公
司 ) ,其他试剂皆为分析纯 。
动物 昆明种小鼠 , 重 20 ~ 2 9 , 由山东大学实
验动物中 、自提供 。
西红 柿 凝 集 素 一磷 脂 酞 乙 醇 胺 ( T L P E )的 合
成 6[] P (E 60 m g )溶于氯仿 中 , 加人过量戊二酸醉室
温反应 s h 。 反应液过硅胶 柱 , 氯仿 一甲醇 ( 9 : l) 洗
脱 ,收集 戊 二 酞 磷脂 酞 乙 醇 胺 ( N 一 g lut 一 P E ) , 收 率
92 %
。
N
一
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一
p E 10 m g 加 D M S O 25 0 胖L 和 0 . 15
m o l
·
L
一 `氯化钠 x m L ,超声 15 5 ,调 p H 3 . 5 ,加 ED C 15
哪 , 8 0 m g · m L 一 ’ T L 的 T ir s 一 H C I溶液 1 m L , 冰浴搅拌
反应 24 h 。 薄层色谱监测反应进程 ,展开剂 : 丁醇 -
乙酸 一水 ( 4 : 1 : 1 ) ,碘蒸气显色 。 反应液过硅胶柱 ,洗
脱液 : 丁醇 一乙 酸 一水 ( 4 : 1 : 1 ) , 收集 产物 。 用流动去
离子水透析过夜 , 继用 P B S缓 冲液透析 48 h ,收集透
析内液 , 冻干即得纯化的 T L 一 P E 。
T L
.
P E 修饰程度的测定 T N B S 法测定修饰程
度 。 精 密量取 0 . 25 9 · L 一 ` T L 的 P B s 溶液 。 , 0 . 2 ,
0 4
,
0
.
8
,
1
.
2
,
1
.
6 和 2 . 0 m L ,分别加人 1 m o l · L 一 ’ 硼
酸钠缓 冲液 ( p H 9 . 3 )各 2 . 0 , 1 . 5 , 一 6 , 1 . 2 , 0 . 5 , 0 . 4
和 o m L ,混匀 , 依次加人 0 . o 3 mo l · L 一 ’ TN BS 2 5 胖L ,
混合放置 30 m in ,测定 4 20 n m 吸光度 ,得标准曲线 :
A 二 3 . 24 1 S C + 0 . 0 0 9 1 ( ; = 0
.
9 99 2 )
。 取 0 . 2 5
g’ L 一 ` T L一 P E 的 P B s 溶液 1 . 6 m L , 同法测定 , 根据吸
光度计算 T L一 P E 游离氨基 占 T L 游离氨基百分数 ,计
算 T L一 P E 修饰程度 。
凝集素修饰胰岛素脂质体的制备 逆相蒸发法
制备胰岛素脂质体 。 将一定量磷脂和胆固醇溶于 乙
醚中 ,加人胰岛素 P B S 溶液 ( p H 7 . 0) ,使胰岛素含量
为 1 . 0 g’ L 一 ’ 。 浴式超声 s m in ,蒸除溶剂 ,探针式超
声 1 m in , 得胰岛素脂质体 。 脂质体 3 m L 加人 T L一 P E
的 p BS 溶液 (含 T L 12 m g , p E 1 . 5 m g ) 3 m L , o 一 4 ℃
反应 Z h ,得 T L 修饰胰岛素脂质体 6[, , { 。 透射电镜观
察脂质体形态 , ez at is ez r 测定粒径 。
糖结合活性测定 体外凝集实验检测脂质体表
面 T L 的 糖 结 合 活 性 。 T L 的 底 物 血 型 糖 蛋 白
( g l y
e o
p h o ir n e )用磷酸盐缓冲液 ( p H 7 . 0 )配成不同浓
度 ( o 一 , 0 . 2 , 0 . 3 , 0 . 4 9 · L 一 ` ) ,取 2 0 0 拌L 加至修饰脂
质体 (相当于磷脂 : 0 . 3 9 · L 一 ’ , T L : 0 . 02 9 · L 一 ’ )中 ,
总体积 为 10 m L , 充分混合 , 25 ℃反应 巧 m in ,测定
浊度 (注4 5。 ) 。
脂 质 体 中胰 岛素 含 量 测 定 采用 H P L c 方
法 sl[ 。 用 or g · L 一 ’ 胆酸钠破坏胰岛素脂质体和修饰
胰岛素脂质体 ,氯仿提除脂质 ,取上清液测定 。
包封 率测定 柱 色谱条 件 : 凝胶 柱 s即h ad ex -
G s o ( 20 。 m x 2
.
5 c m )
,分别上样胰岛素脂质体和修
饰胰岛素脂质体 1 m L , P B S缓冲液 ( p H 7 . 0 )洗脱 , 流
速 0 . 5 m D m i n 一 ` 。 用 H P LC 分别测定游离药物和脂
质体 中包封 药 物量 。 包 封率 二 w (/ w + w rF e e ) /
10 0 %
。
w 表示脂质体 中包封药物量 , w erF 。表示游离
药物量 。
体外酶解实验 9[] 分别比较 T L 修饰脂质体和
普通脂质体在 胃蛋白酶 ( 0 . 05 g’ L 一 ’ , p H 2 T isr 一 HCI
缓冲液配制 )和胰蛋白酶 ( 3 . 6 9 · L 一 ` , p H 7 . 4 磷酸盐
缓冲液配制 )中的稳定性 。 1 . 5 m L 酶和 1 . s m L 脂质
体混合物于试管中 , 37 ℃振荡 , 于不同时间取样 2 0
拼L ,立即用 0 . 0 5 mo l · L 一 ’ N a o H 10 0 拼L 破坏胃酶 、 0 . 1
mo 卜 L 一 ’ HCI 10 0 拜L 破坏胰酶 。 HPL C 测定脂质体 中
药学学报 A e ta P hartn 二e u t i e a s , n i e a 2 0 0 4
,
3 9 ( 5 )
: 3 8 0 一 3 84
令
今
令
今
令
rl卜.
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L
.
ILse申,一00八ù6确勺1
` .
0nnU
0叭,贾
残余胰岛素 。
正常小鼠降血糖实验 正常小鼠 30 只 ,均分为
5 组 。 每只小鼠分别 oP o . s m L 。 第 1组为生理盐水
对照组 ,第 2 组为胰 岛素溶液组 (相 当于胰 岛素 3 50
u
·
kg
一 ’体重 ) ,第 3 组 为胰岛素脂质体组 (相当于胰
岛素 35 0 u’ kg 一 `体重 ) ,第 4 组为空白脂质体 与胰 岛
素溶液混合物组 (相 当于胰岛素 3 50 u’ k g 一 ’ 体重 ) ,
第 5 组 为 T L 修 饰脂 质 体组 (相 当于胰 岛素 3 50
u
·
kg
一 ’体重 , T L 50 m g · k g 一 `体重 ) 。 分别于 oP 前后
0
.
5
,
l
,
2
,
4
,
6
,
8
, 一2 和 24 h 于眼底静脉丛取血 , 离
心 ,取血清 20 刃J 用葡萄糖酶测定试剂盒测定血糖 。
以零时刻 为 10 % , 计 算各 时间点血糖 的百 分率 。
实验前小鼠不禁食 , 并于 p 。 4 h 后恢复正常饮食 。
糖尿病模型小鼠降血糖实验 正常小 鼠空腹
12 h 后 i p 四 氧嚓吮 160 m g · k g 一 ’ , 7 2 h 后测空腹血
糖 , 以血糖值 〕 10 . 08 m m ol · L 一 ’ 者为糖尿病模型 小
鼠 。 恢复正常饮食 12 h 后将 18 只糖尿病小鼠分为
3 组 。 第 1 组为阴性对照组 , 每只小 鼠分别 oP o . 5
m L 生理盐水 。 第 2 组为阳性对照组 ,每只小 鼠分别
i p 胰岛素 3 50 u’ k g 一 ’ 体重 ,第 3 组为实验组 , 每只小
鼠分别 p 。 0 . 5 m L T L 修饰脂 质体 (相 当于胰 岛素
35 0 u
·
k g
一 ’体重 , T L 50 m g · k g 一 ’ 体重 ) 。 按上述方法
测定血糖 ,计算各时间点血糖的百分率 。
0扩咒汀州右一肩份前广猫犷写 ,6
S u b s t r a t e e o n e e n t r a t io n 澎 g · L 一 I
F i即re 1 T h e tu rb i d it y i n e re a s e o f t o m a t o l e e t in ( T L )
m o d i if e d l i p o s o m e 叭 e r i n e u b a t e d w it h s u b s t ra re
结果与讨论
1 T L
.
PE 合成
薄层色谱检查结果表明 T L 一 P E , N 一 gl ut 一 P E 与 T L
有不同的 fR 值 , N 一 gl ut 一 PE fR 值为 0 . 93 , T L fR 值 为
0
.
2 9
,
IT
一
P E fR 值 为 0 . 54 。 T L P E 收率 以 T L 计 为
75 % ( n 二 3 ) ; T L
一
P E 修饰率约为 5 5 一 6 5 % ( n 二 3 ) 。
2 T L 修饰脂质体的形态和大小
T I
J修饰脂质体在电镜下可观测到断续的指纹
状螺旋 , 与普通脂质体有明显的指纹状螺旋不同 ,表
明修饰后脂质体的指纹状螺旋被干扰 。 修饰前后脂
质体的粒径稍有变化 ,分别为 ( 62 士 17 ) n m 和 ( 69 士
19 ) n m
o
3 糖结合活性测定结果
体外凝集实验浊度测定结果见图 1。 由于底物
上存在有多个与 T L 结合 的位点 , 因而会在 T L 修饰
脂质体间 “ 架桥 ” 。 底物溶液与修饰脂质体孵化 15
m in 后 ,修饰脂质体即发生凝集 ,修饰脂质体的凝集
可用浊度的增加定量说明 ,底物浓度高 ,浊度随之增
力口。
4 脂质体中胰岛素的含量及包封率
方法专一性考察结果表明 ,脂质体及溶剂等不
干扰胰岛素的含量测定 。 胰岛素峰面积 A 与药物
浓度 c ( m g · L 一 ’ )成线性关系 , 回归方程 : A 二 39 8 40 c
一 1 04 3
.
8 2
, r 二 o , 9 99 6 。 线性范围 5 一 l o m g · L 一 ` 。
脂质体中胰 岛素含量 (l . 07 士 0 . 1 1 ) g · L 一 ’ ( 。 = 3 ) 。
采用 s即h ad ex 一G 50 凝胶柱可成功分离胰岛素普通脂
质体 ,脂质体出峰体积在 28 一 42 mL , 游离胰岛素出
峰体积在 48 一 75 m L 。 胰岛素脂质体包封率为 ( 30 . 3
土 2 . 8) % ( n 二 3 ) ; 修饰脂质体包封 率为 ( 82 士 6) %
( n 二 3 )
。 修饰脂质体包封率较普通胰岛素脂质体
明显增加 。 分别取 空 白脂 质体与胰岛素 P B S 溶液
( p H 7
.
0)
,或 T L 修饰空 白脂质体与胰岛素 P B S 溶液
水合 ,结果表明 , 空 白脂质体与胰岛素 P B S 溶液水
合后 , 只有 6 . 09 % 胰岛素被包封 , 而 T L 修饰空 白脂
质体 和胰 岛 素 P BS 溶 液 水 合 则 包 封 率 增 加 到
47
.
0 %
。 胰岛素等电点为 5 , T L 等电点为 10 , 在 p H
7
.
0 的 P BS 环境 中胰岛素带负电 , LT 带正 电 , T L 与
胰岛素的电性结合可能是更多胰岛素被包封的原
因 。 同样 ,在 T L 一 P E 掺人脂质体时 ,有部分胰岛素和
T L
一
P E 正负电荷结合 ,增加了修饰脂质体包封率 。
5 体外酶解实验结果
体外酶解实验结果见表 l , 2 。 T L 修饰脂质体较
普通脂质体对酶 的降解有一定的抵抗作用 ,抗酶机
制也不同于普通脂质体 。 普通脂质体的保护作用缘
于磷脂双分子层对药物 的包裹 , 而修饰脂质体 由于
有耐酶的 T L 缠绕 , 损失 的药物仅为与 IT 电性结合
胰岛素中暴露在脂质体及 T L 分子链外的部分 ,包裹
在 T L 分子链及脂质体内的药物没有受到酶降解 。
6 正常小鼠体 内降血糖效果
正常小鼠降血糖试验结果见图 2 。 T L 修饰脂质
体在 4 h 血糖降至初始水平 的 ( 85 土 5) % , s h 降至
( 5 4 士 2 1 ) %
, 一Z h 为 ( 5 7 士 6 ) % 。 胰岛素脂质体组 、
胰岛素溶液组与生理盐水对照组相似 , 均没有降糖
张 娜等 :西红柿 凝集素修饰脂 质体对小 鼠 口服吸收胰岛素的促进作用
T a b le 1 D ig e s it o n o f tw o kl n sd o f i sn ul i n
li Po s o m e s 初 t h ep Psi n
R e m a i n a n ol u n之 o f i n s u li n / %
T im e / m i n——T L一 li Po s o me s Co n v e n tio n al l i Po s o me s0 10 0 1佃〕0 . 5 97 . 2 0 99 . 0 01 9 0 . 7 8 8 0 . 0 82 8 8 0 0 7 6 . 4 15 89 . 06 7 4 . 071 0 8 1 . 7 9 67 . 89
15 7 9
.
2 0 59
.
3 3
3 0 7 8
.
7 0 5 1
.
15
作用 , 且血糖水平较初始水平高 。 这主要是 由于反
复眼底静脉丛取血造成的小 鼠应激反应 。 血糖升高
是应激反 应 的一部分 , 是肌体 自我 保护 的机制之
一 〔’ o〕 。 本实验表明 , 与未修饰脂质体相 比 , T L 修饰
脂质体显著地促进了胰岛素 的胃肠吸收 ,证实 了 T L
的靶向作用 , T L 对肠细胞的靶向性增加 了载药脂质
体与肠吸收细胞的接触和转运时间 。
7 糖尿病模型小鼠降血糖效果
糖尿病模型小鼠降血糖试验结果见图 3 。 西红
柿凝集素修饰脂 质体在 4 h 血糖 降至初始水平 的
(3 8 士 13 ) %
,
s h 降至 ( 5 0 士 15 ) % , 12 h 为 ( 5 0 土
16 )%
。
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岁/的工。奋.1on一助日二óas
T a b le 2 D i g e s it o n o f t w o ik n ds o f i n s ul i n
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R e m a i n a m o u n t o f i n
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T lm e / h——T L一 l i Po s o m e s C o n v e n t i o n a l l i P o s o m e s0 1 {卫 ) 1 (M)0 . 25 】03 . 10 9 6 . 9 70 . 5 96 . 】3 9 2 . 9 81 93 2 3 9 0 . 9 81 . 5 8 8 . 30 8 7 . 0 22 8 7 . 7 6 80 . 0 9
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口一口 5 0一i n e s o l u t i o n , 19 : 0 一之) In s u l i n s o l u t i o n 35o u · k g 一 l , 19 :一今
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研究表明 , T L 与肠上皮细胞膜结合 ; 另有研究
表明 T L 可识别脑 内皮上 P 一糖蛋 白家族 中一个 180
k u 的糖复合物 〔’ ` 〕 。 这表明 T L 的特异识别并结合作
用发生在细胞表面并与细胞转运有关 。 T L 可被 胃
肠道吸收 , 因而 T L 介导的发生在细胞表面的特异结
合可促进药物吸收 。
T L 与特异受体的结合不被单糖抑制 ,其特异抑
制物为寡糖 ( G l e N A e )。 和 ( G le N A C ) 4 , 本实验也证实
了单糖 N 一乙酞氨基葡糖不能抑制 T L 与底物 的凝集
反应 。 由于食物中极少有 T L 的特异抑制物 , 因而食
物不会影响 T L 对肠细胞 的靶向性 ,所 以 LT 作为药
物载体较为适合 。
由于 T L 仅识别并特异结合小肠上皮细胞 ,本实
验结果也证明了在微粒转运中小肠上皮细胞发挥了
一定作用 。
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第三届国际人类蛋白质组大会即将于 2 0 0 4 年 10 月召 开
由国际人类蛋白质组组织 ( HU PO )发起的国际人类蛋白质组大会是国际蛋 白质组领域中规模最大 、影响最广 、水平最高的
年度世界性会议 。 2 0 0 4 年 10 月 25 日至 27 日 , 第 三届 国际人类蛋 白质组 大会将在 北京 召开 。 本届 大会 的主题是 “ 蛋白质组
— 解析基因组 ” 预计将有若干诺贝尔奖获得者及国际蛋白质组研究领域著名专家等 3 (x 〕0 余名代表出席 。 有关本次大会的详细信息请查 阅大会专门网站 :~ . huP oZ o 04 . 。 n 。联系人 : 陈
通信地址 :
宁 电话 : 5 6一 。 一 5 2 3 2 7 6 4 4 传真 : 8 6 一 10 一 s 2 8 0 2 5 15 E一 m a i l : B e i zin g2 004 @ n e w life . 。嗯 . 。 n
北京市海淀 区学院路 38 号北京大学 医学部会议中心一层 第二届 国际人类蛋白质组大会筹备组
邮编 : l以 X 18 3