全 文 ：参考文献
［1］ 王鸿祥，陈斌．特发性男性不育症的药物治疗进展［J］．
医药导报，2011，30(12) :1625 － 1628．
［2］ 宾彬，姚重华，强精煎治疗少弱精子症 62 例疗效观察
［J］．辽宁中医杂志，2007，34(11) :1586 － 1587．
［3］ 宾彬，王杰，陈定雄，等． 强精煎治疗少弱精子症临床疗
效及安全性研究［J］．西部中医药，2012，25(4) :5 － 6．
［4］ 姚重华，宾彬，赵霞，等． 强精煎对模型小鼠睾丸病理损
伤的影响［J］．时珍国医国药，2007，18(6) :1369 － 1370．
［5］ 熊芬，李高，庞雪冰，等． 奥硝唑对雄性大鼠生育功能的
影响［J］．生殖与避孕，2006，26(2) :81 － 85．
［6］ MCCLAIN R M，DOWNING J C． The effect of ornidazoleon
fertility and epididymal sperm funct ion in rats［J］． Toxicol
App l Pharmacol，1988，92(3) :488 － 496．
［7］ MCCLAIN R M，DOWNING J C． Reproduction studies in
rats treated with ornidazole［J］． Toxicol Appl Pharmacol
1988，92(3) :480 － 487．
［8］ OBERLANDER G，YEUNG C H，COOPER T G． Induction
of reversible infertility in male rats by oral ornidazole and its
effects on sperm motility and epididymal secretions［J］． J
Reprod Ferti，1994，100(2) :551 － 559．
［9］ DE LAMIRANDE E，JIANG H，ZINI A，et al． Reactive oxy-
gen species and sperm physiology［J］． Rev Reprod，1997，2
(1) :48 － 54．
［10］ KOKSAL I T，USTA M，ORHAN I，et al． Potential role of re-
active oxygen species on testicular pathology associated with
in fertility［J］． Asian J Androl，2003，5(1) :95 － 99．
DOI 10． 3870 /yydb． 2013． 03． 002
白子菜水提液对胰岛素抵抗
HepG2 细胞关键酶活性的影响*
韦乃球，杨柯，冼寒梅，郝永靖，柳俊辉，黄旭
(广西中医药大学中药学教研室，南宁 530001)
摘 要 目的 探讨白子菜水提液对胰岛素抵抗 HepG2 细胞关键酶活性的影响。方法 采用葡萄糖临床检测试剂
盒、肝糖原测定试剂盒检测白子菜水提液对胰岛素抵抗 HepG2 细胞葡萄糖消耗和 HepG2 细胞的糖原含量的影响;采用葡
萄糖-6-磷酸脱氢酶耦联比色法、乳酸脱氢酶耦联比色法及钼酸铵定磷法测定葡萄糖激酶( GK) 、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶
( PEPCK) 和葡萄糖-6-磷酸酶( G-6-Pase)的活性。结果 白子菜水提液能够促进胰岛素抵抗 HepG2 细胞的葡萄糖消耗，使
G-6-Pase及 PEPCK活性分别降低 71． 41%，82． 14%，使 GK活性和糖原含量分别提高 28． 77%，96． 73%。结论 白子菜水
提液可降低胰岛素抵抗 HepG2细胞 G-6-Pase和 PEPCK的活性，抑制糖异生作用，从而减少细胞内源性葡萄糖的产生。此
外，白子菜水提液还提高 GK活性，加快糖酵解的进行，增加糖原含量，减轻 HepG2细胞的胰岛素抵抗状态。
关键词 白子菜水提液; HepG2 细胞;胰岛素抵抗; 关键酶
中图分类号 R282． 71; R285． 5 文献标识码 A 文章编号 1004 － 0781( 2013) 03 － 0281 － 04
Effect of Aqueous Extracts from Shirako on Key Enzyme Activity in Insulin-Resistant
HepG2 Cell Line
WEI Nai-qiu，YANG Ke，XIAN Han-mei，HAO Yong-jing，LIU Jun-hui，HUANG Xu ( Teaching and Re-
search Section for TCM of Guangxi Traditional Chinese Medical University，Nanning 530001，China)
ABSTRACT Objective To explore the effect of aqueous extracts from shirako on key enzyme activity in insulin-resistant
HepG2 cells． Methods Glucose consumption and glycogen content of insulin-resistant HepG2 were detected by glucose clinic
test kit and hepatic glycogen test kit after treatment with water extracts of shirako． Activities of glucokinase ( GK) ，phosphoenol-
pyruvate carboxylase kinase ( PEPCK) ，and glucose-6-phosphatase ( G-6-Pase) were assayed by the glucose 6-phosphate dehy-
drogenase coupling colorimetric，lactate dehydrogenase coupling colorimetric and ammonium molybdate constant phosphorus meth-
ods． Results The aqueous extracts of shirako enhanced glucose consumption，lowered the activity of G-6-Pase and PEPCK
( 71． 41%，82． 14% ) ，increased the activity of GK and glycogen content of insulin-resistant HepG2 ( 28． 77%，96． 73% ) ．
Conclusion Aqueous extracts of shirako plays a role in lowering PEPCK and G-6-Pase activities and inhibiting glucogenesis，re-
sulting in the reduction of endogenous glucose in the cell． In addition，it also can augment the activity of GK，accelerate the
process of glucolysis，increase the glycogen content，and alleviate insulin resistance of HepG2．
KEY WORDS Aqueous extracts from shirako; HepG2 cell; Insulin resistance; Key enzyme
·182·医药导报 2013 年 3 月第 32 卷第 3 期
白子菜［Gynura divaricata(L．)DC．］为菊科多年
生草本植物白子菜的全草，系广西民间常用中草
药［1］，其味甘，性凉;具有清热解毒、续筋接骨、凉血止
血、散瘀消肿之功效;主治胃病、高血压、高脂血症及糖
尿病等［2-4］。但在细胞水平研究白子菜水提液通过关
键酶改善胰岛素抵抗(insulin resistance，IR)的作用笔
者未见文献报道。笔者前期实验结果表明白子菜水提
液能够改善胰岛素抵抗 HepG2 细胞(IR-HepG2)的 IR
状态［5］，并推测其机制可能在于干预糖酵解的过程和
糖异生关键酶的活性。笔者在本实验中拟模仿机体
IR的发病机制及其病理生理学特点建立 IR-HepG2 模
型，探讨白子菜水提液对 IR-HepG2 关键酶活性的影
响，为白子菜改善 IR作用提供理论依据。
1 材料与方法
1． 1 材料 人肝癌细胞株(HepG2 细胞)由中国医学
科学院基础医学研究所提供;实验药材(采于广西壮
族自治区隆安县)经广西中医学院中药鉴定教研室蔡
毅教授鉴定为菊科植物白子菜的全草(取白子菜粗粉
1 kg，粉碎，加 12 倍量的水，浸泡 1 h 后回流提取
1． 5 h，趁热过滤，药渣加 10 倍量水回流提取 1． 0 h，趁
热过滤，然后将两次滤液混合并且摇匀，浓缩药液，制
成相当于生药 2 g·mL －1的浸膏，置 4 ℃冰箱中备
用) ;盐酸二甲双胍片购自北京京丰制药有限公司(批
号:081211) ;罗格列酮片购自成都恒瑞制药有限公司
(批号:080802) ;葡萄糖临床检测试剂盒(批号:
20081207)购自上海荣盛生物技术有限公司;低糖达尔
伯克必需基本培养基(Dulbecco ＇s minimum essential
medium，DMEM)购自 Gibco 公司(批号:1120708) ;胰
蛋白酶购自 Gibco公司(批号:BE2189) ;噻唑蓝(thia-
zolyl blue，MTT)为 Sigma公司产品(批号:080609) ;胰
岛素购自上海第一生化制药有限公司 (批号:
080505) ;胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有
限公司(批号:081128) ;肝糖原测定试剂盒购自南京
建成生物研究所(批号:20090514) ;葡萄糖-6-磷酸脱
氢酶(glucose-6- phosphate dehydrogenase，G-6-PD，Sig
收稿日期 2012 － 05 － 31 修回日期 2012 － 10 － 15
基金项目 * 广西科技基础条件平台建设项目“中药药效
研究重点实验室”(桂科能 0907006)
作者简介 韦乃球(1980 －) ，男，壮族，广西都安人，讲师，
硕士，从事中药基础与理论研究。电话: (0)13977163405，
E-mail:593164965@ qq． com。
通讯作者 杨柯 (1975 －) ，男，侗族，广西三江人，副教
授，硕士，从事中草药药理学研究。电话: (0)13481020102，E-
mail:kyang_11@ 126． com。
ma分装) ;丙酮酸羧激酶(Sigma 分装) ;乳酸脱氢酶
(Sigma分装) ;二辛可酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋
白浓度测定试剂盒购自碧云天生物技术研究所(批
号:P0010S) ;无机磷测定试剂盒(批号:20090520)。
其余试剂均为国产分析纯。
1． 2 主要仪器 SW-CJ-IF超净工作台(苏州安泰空气
技术有限公司) ;Thermo Forma381CO2恒温培养箱(美国
Thermo Forma公司) ;莱卡 DMIL倒置显微镜(德国 Lei-
ca 公司) ;SLX800 酶标仪(奥地利 DIALAB 公司) ;
EL204电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司) ;UB-7
精密 pH计(上海民仪电子有限公司) ;海尔 DW-86L386
超低温冰箱(青岛海尔特种电器有限公司) ;TGL-16M
低温离心机(湖南赛特湘仪有限公司) ;TU-1901 紫外分
光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)。
1． 3 IR-HepG2 模型的建立 将 HepG2 细胞用含
15%胎牛血清的 DMEM 培养基调整细胞密度为
105个·mL －1，按每孔 800 μL转入 24 孔板中。待细胞
单层贴壁后，更换无血清的 DMEM 培养液继续孵育
12 h。待细胞适应无血清的环境后再将培养基移出，
加入新配制的含有 10 －8 mol·L －1胰岛素的培养液，并
设无胰岛素的空白孔，于 37 ℃、5%二氧化碳(CO2)培
养箱中孵育 36 h［6］。检测培养基上清液的葡萄糖含
量，并计算各组细胞的葡萄糖消耗量。
1． 4 药物干预 将 HepG2 细胞弃去培养液，用磷酸
盐缓冲液洗涤 2 次，然后分别设空白组、模型组、二甲
双胍组(终浓度为 10 －3 mol·L －1)、罗格列酮组(终浓
度为 10 －5 mol·L －1)和白子菜水提液处理组(根据前
期实验确定最佳终浓度为 1． 0 mg·mL －1，且该药物浓
度对 HepG2 细胞增殖无影响［5］) ，每组 6 个复孔。药
物处理 24 h后停止药物作用，继续以下实验。
1． 5 对 IR-HepG2 糖原含量的影响 按肝糖原测定
试剂盒方法检测。
1． 6 对 IR-HepG2 葡萄糖激酶( glucokinase，GK) 活性
的影响 将 HepG2 细胞制成匀浆，粗匀浆于高速离心
机上 12 000 r·min －1、4 ℃离心 15 min，上清液用于酶
活性测定［7］。
反 应 体 系 (三 羟 甲 基 氨 基 甲 烷-盐 酸
100 mmol·L －1、氧 化 后 的 还 原 型 辅 酶 Ⅱ
0． 2 mmol·L －1、三 磷 腺 苷 5 mmol · L －1、氯 化 镁
5 mmol·L －1、G-6PD 0． 2 U，pH为 7． 5)充分混匀 37 ℃
水浴5 min后，加入 HepG2细胞上清液 50 μL进行反应。
用纯化水调零，在波长 340 nm处测吸光度，每30 s记录
一次，连续记录3 min，测出每分钟光密度的增加值。并
从高糖管(葡萄糖终浓度为100 mmol·L －1)测得值中减
·282· Herald of Medicine Vol. 32 No. 3 March 2013
去低糖管(葡萄糖终浓度为0． 5 mmol·L －1)测得值，两
者之差值为 GK活性。用 BCA法测定上清液的蛋白质
含量，并计算酶的比活性。
1． 7 对 IR-HepG2 磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶( phos-
phoenolpyruvate carboxykinase，PEPCK) 活性的影响
将 HepG2 细胞制成匀浆，粗匀浆于高速离心机上
12 000 r·min －1、4 ℃离心 15 min，上清液用于酶活性
测定［8］。
选定 340 nm 波长，用纯化水调零，分别读取空白
管(纯化水 50 μL，加入基质缓冲液 1 mL，置 37 ℃水浴
孵育 5 min后，加入 1． 5 mmol·L －1草酰乙酸 50 μL，充
分混匀)和测定管吸光度值(HepG2 细胞上清液
50 μL，加入基质缓冲液 1 mL，置 37 ℃ 水浴孵育
5 min，加入 1． 5 mmol·L －1草酰乙酸 50 μL，充分混
匀) ，每30 s记录 1 次，连续记录 3 min，用空白管的吸
光度值减去测定管得到吸光度的减少值。用 BCA 法
测定上清液的蛋白质含量，并计算酶的比活性。
1． 8 对 IR-HepG2 G-6-P活性的影响 将 HepG2 细胞
制成匀浆，粗匀浆于高速离心机上 12 000 r·min －1、
4 ℃离心 30 min，上清液用于酶活性测定［9］。
将适 量 待 测 上 清 液 加 入 反 应 体 系 (包 括
0． 25 mol·L －1 蔗 糖、1 mol · L －1 依 地 酸 二 钠、
0． 1 mol·L －1葡萄糖-6-磷酸二钠盐、0． 1 mol·L －1二
甲砷酸钠缓冲液)37 ℃孵育 5 min。反应终止时加入
10%三氯乙酸2 mL，冰浴冷却，3 000 × g 离心 10 min
去除沉淀，再取上清液 0． 5 mL 测定无机磷含量(钼酸
铵法) ，根据酶活性单位定义计算 G-6-P活性。酶活性
单位定义:100 mL酶上清液在 37 ℃，5 min 水解产生
无机磷 1 mg为 1 个酶活性单位(U)。用 BCA 法测定
上清液的蛋白质含量，并计算酶的比活性。
1． 9 统计学方法 所有数据采用 SPSS13． 0 进行统计
学处理，计量资料用均数 ±标准差(x ± s)表示，两组之
间均数比较采用 t检验，以 P ＜ 0． 05 为差异有统计学
意义。
2 结果
2． 1 对 IR-HepG2 糖原含量的影响 见表 1。与空白
组相比，模型组细胞的糖原含量降低 49． 14% (P ＜
0． 01)。药物作用 24 h后，与模型组相比，白子菜水提
液 1． 0 mg·mL －1剂量能够使 IR-HepG2 细胞的糖原含
量增加 96． 73%(P ＜ 0． 01) ，而二甲双胍作用后能使糖
原含量增加 110． 80%(P ＜ 0． 01) ，罗格列酮则使糖原
含量增加 98． 00%(P ＜ 0． 01)。
2． 2 对 IR-HepG2 GK 活性的影响 见表 2。与空白
组相比，模型组细胞的 GK活性下降了 64． 48% (P ＜
表 1 9 组细胞 IR-HepG2 糖原含量比较
Tab． 1 Comparison of IR-HepG2 glycogen content a-
mong 9 groups of cells μg·mg －1，x ± s，n = 6
组别 剂量 糖原
白子菜水提液组 1． 0 mg·mL －1 9． 138 ± 1． 063* 1
0． 5 mg·mL －1 4． 797 ± 0． 785
0． 25 mg·mL －1 4． 682 ± 0． 406
0． 125 mg·mL －1 4． 649 ± 0． 901
0． 062 5 mg·mL －1 4． 382 ± 0． 918
二甲双胍组 10 －3 mol·L －1 9． 792 ± 1． 062* 1
罗格列酮组 10 －5 mol·L －1 9． 197 ± 2． 027* 1
模型组 … 4． 645 ± 0． 895* 2
空白组 … 9． 133 ± 1． 802
与模型组比较，* 1P ＜ 0． 01; 与空白组比较，* 2P ＜ 0． 01
Compared with model group，* 1P ＜ 0． 01; compared with blank
control group，* 2P ＜ 0． 01
0． 01)。在药物作用 24 h后，与模型组相比，白子菜水
提液能够使胰岛素抵抗 HepG2 细胞的 GK 活性升高
28． 77% (P ＜ 0． 05) ;而二甲双胍作用后能使 GK活性
升高97． 57%(P ＜ 0． 01) ;罗格列酮则使 GK 活性升高
99． 49% (P ＜ 0． 01)。
2． 3 对 IR-HepG2 PEPCK活性的影响 见表 2。与空
白组相比，模型组细胞的 PEPCK 活性升高 216． 90%
(P ＜ 0． 01)。在药物作用 24 h 后，与模型组相比，白
子菜水提液能够使 IR-HepG2 细胞 PEPCK 活性下降
82． 14%(P ＜ 0． 01) ;而二甲双胍作用后能使 PEPCK
活性下降 102． 94%(P ＜ 0． 05) ;罗格列酮则使 PEPCK
活性下降 104． 87%(P ＜ 0． 01)。
2． 4 对 IR-HepG2 G-6-Pase活性的影响 见表 2。与
空白组相比，模型组细胞的 G-6-Pase 活性升高
272． 21%(P ＜ 0． 01)。在药物作用 24 h 后，与模型组
相比，白子菜水提液能够使 IR-HepG2 细胞的 G-6-Pase
活性下降 71． 41%(P ＜ 0． 01) ;而二甲双胍作用后能使
G-6-Pase活性下降 66． 71% (P ＜ 0． 01) ;罗格列酮则
使 G-6-Pase活性下降 61． 17%(P ＜ 0． 01)。
3 讨论
IR在细胞水平的定义是由于胰岛素受体和(或)
受体后缺陷，一定浓度的胰岛素不能使细胞达到其相
应代谢水平［10］。肝脏及外周组织是胰岛素作用的靶
组织，是 IR产生的主要部位。肝脏对葡萄糖代谢起着
重要的作用，糖异生增加和糖酵解减少引起的肝糖生
成增多，可导致 2 型糖尿病患者空腹高血糖。G-6-P
和 PEPCK是肝糖异生的限速酶，G-6-P 催化糖异生和
糖原分解的最后一步反应，而 PEPCK 在催化丙酮酸、
成糖氨基酸和三羧酸循环的中间产物异生为糖的生化
·382·医药导报 2013 年 3 月第 32 卷第 3 期
表 2 5 组细胞 IR-HepG2 GK、PEPCK 和 G-6-Pase 活性比较
Tab． 2 Comparison of the activities of IR-HepG2 GK，PEPCK and G-6-Pase among 5 groups of cells x ± s，n = 6
组别 剂量
GK PEPCK
(U·min －1·mg －1)
G-6-Pase /
(U·mg －1)
白子菜水提液组 1． 0 mg·mL －1 2． 270 ± 0． 107* 1 15． 863 ± 1． 094* 2 10． 636 ± 1． 213* 2
二甲双胍组 10 －3 mol·L －1 3． 390 ± 0． 230* 2 18． 112 ± 1． 108* 2 12． 386 ± 1． 367* 2
罗格列酮组 10 －5 mol·L －1 3． 626 ± 0． 378* 2 19． 610 ± 1． 831* 2 14． 447 ± 1． 222* 2
模型组 … 1． 798 ± 0． 366* 3 29． 431 ± 2． 689* 3 37． 202 ± 3． 866* 3
空白组 … 5． 325 ± 0． 761 9． 144 ± 1． 020 9． 995 ± 1． 252
与模型组比较，* 1P ＜ 0． 05，* 2P ＜ 0． 01; 与空白组比较，* 3P ＜ 0． 01
Compared with model group，* 1P ＜ 0． 05，* 2P ＜ 0． 01; compared with blank control group，* 3P ＜ 0． 01
过程中起着重要作用［11］。GK是糖酵解的第一个关键
酶，催化葡萄糖转变为葡萄糖-6-磷酸，促进细胞对葡萄
糖的利用［12］。由于人体试验的局限性，往往不便于对
IR的发生机制进行深入研究。因此，建立 IR 的细胞
模型，不仅可广泛用于在细胞水平探讨 IR形成的机制
和葡萄糖代谢障碍的病理生理学环节，而且便于筛选
改善 IR的药物。HepG2 细胞来源于肝细胞，是一种表
型与肝细胞极为相似的肝胚胎瘤细胞株，保留了肝细
胞的许多生物学特性［13］，故本实验选择 HepG2 细胞建
立 IR 的细胞模型［14-15］，探讨白子菜水提液对 IR-
HepG2 关键酶活性的影响。
本实验结果表明，白子菜水提液能够促进 IR-
HepG2的葡萄糖消耗，降低 G-6-P 及 PEPCK活性，提高
葡萄糖激酶活性和糖原含量。首先，白子菜水提液降低
G-6-P和 PEPCK的活性，避免葡萄糖-6-磷酸水解生成葡
萄糖，减少糖异生前体物质向丙酮酸转变，从而抑制
HepG2细胞的糖异生作用，减少细胞内源性葡萄糖的产
生。其次，白子菜水提液增强 GK活性，促使葡萄糖转变
为葡萄糖-6-磷酸，加快糖酵解的进行，促进细胞对葡萄
糖的利用。两方面的共同作用使细胞内葡萄糖-6-磷酸
水平升高，增加糖原含量，有效减轻 IR-HepG2 的 IR 状
态。此外，由于本实验的研究对象是白子菜的粗提液，
故剂量上与阳性药相差略大应属正常，若进一步分离纯
化白子菜的活性成分，相信可明显降低其用药剂量。
近年来，中草药治疗 IR的研究也取得了一些可喜
的成绩，但由于 IR机制复杂、临床表现多样，许多深层
次的机制还有待进一步研究。笔者认为应在现有研究
的基础上，充分利用细胞生物学、分子生物学技术等现
代研究方法，深入探讨中医药改善 IR 的作用机制，以
为 IR患者提供更安全有效的治疗。
参考文献
［1］ 广西壮族自治区革委会卫生局． 广西本草选编［M］． 南
宁:广西人民出版社，1974:1826．
［2］ 马正东，陈磊，宋洪涛，等． 白背三七水提取物对 2 型糖
尿病大鼠的降血糖作用及其机制［J］． 中草药，2010，4
(41) :623 － 626．
［3］ 黄开珍，郝永靖，曾春晖，等． 白子菜水提物对自发性高
血压大鼠降血压作用的实验研究［J］． 中成药，2009，10
(31) :1505 － 1508．
［4］ 冼寒梅，周蓉，韦乃球． 壮药神仙草的性状及民间应用
［J］．亚太传统医药，2007，3(9) :29 － 30．
［5］ 韦乃球，冼寒梅，杨柯，等．白子菜对 HepG2 细胞胰岛素
抵抗改善作用的实验研究［J］．时珍国医国药，2011，22
(6) :1395 － 1396．
［6］ 李长贵，宁光，陈家伦．胰岛素抵抗 HepG2 细胞模型的建
立及鉴定［J］．中国糖尿病杂志，1999，7(4) :198 － 200．
［7］ 叶应妩，王毓三，申子瑜．全国临床检验操作规程［M］． 3
版．南京:东南大学出版社，2006:175 － 179，431．
［8］ 刘晓海，董志，傅洁民，等． 倍他福林对胰岛素抵抗
HepG2 细胞模型的作用及其初步机制［J］．中国新药杂
志，2008，17(12) :1026 － 1029．
［9］ 韩向晖，季光．肝脏糖异生的分子机制研究进展［J］．世
界华人消化杂志，2008，16(32) :3659 － 3665．
［10］ BALTRUSCH S，TIEDGE M． Glucokinase regulatory net-
work in pancreatic β-cells and liver［J］． Diabetes，2006，55
(1) :55 － 64．
［11］ 吴勉云，王西明，陈培楠，等． 花生四烯酸显著预防软脂
酸诱导 HepG2 细胞胰岛素抵抗［J］． 中国现代医学杂
志，2007，17(17) :2054 － 2056．
［12］ 方飞，吴新荣，罗明俐，等． HepG2 细胞胰岛素抵抗模型
的建立及在筛选桑叶有效部位中的应用［J］．医药导报，
2012，31 (6) :691 － 694．
［13］ 张汝学，贾正平，李茂星，等． 体外胰岛素抵抗细胞模型
的建立及在药物筛选中的应用［J］． 中国药理学通报，
2008，24(17) :971 － 976．
［14］ 陈梦云，江国荣．胰岛素抵抗细胞模型研究进展［J］．安
徽医药，2012，16 (2) :141 － 143．
［15］ 刘颖，陆付耳，黄光英．丹参对 HepG2 细胞胰岛素抵抗状
态的影响［J］．医药导报，2008，27 (3) :265 － 267．
DOI 10． 3870 /yydb． 2013． 03． 003
·482· Herald of Medicine Vol. 32 No. 3 March 2013