全 文 ：　　　　 天然产物研究与开发　 　　　　　
　　　　　　　　　　 NAT URAL PRODUCT RESEARCH AND DEVELOPMENT　 2004　Vol.16　No.5
　
　
　
　
　　收稿日期:2003-12-22　　　接受日期:2004-03-01
　　基金项目:国家 973项目(2001CB51008)
　＊通讯作者 Tel:86-010-82627066;E-mai l:fudexian@yahoo.com
芙蓉菊寡糖的分离纯化及其生物活性的研究
车今智　傅德贤＊　欧阳藩
(中国科学院过程工程所生化工程国家重点实验室　北京　100080)
摘　要　采用多级提取的方式从菊科植物芙蓉菊枝和叶中分离得到芙蓉菊多糖 ,脱色 、除蛋白后 ,部分酸水解
该多糖 , 将水解得到的寡糖经过活性炭柱层析得到四个洗脱组分。然后应用糖尿病药物筛选模型 ,考察这四
个洗脱组分对于小鼠胰岛组织的胰岛素分泌水平的影响 。正常胰岛细胞分泌中空白组胰岛素含量为 7.694;
芙蓉菊寡糖水洗脱组分的胰岛素含量为 8.506;5%乙醇洗脱组分的胰岛素含量为 9.689。结果表明 , 芙蓉菊
寡糖水 、5%乙醇洗脱组分有一定的促进胰岛素分泌的作用。
关键词　芙蓉菊寡糖;分离纯化;胰岛素分泌
STUDYON THE ISOLATION , PURIFICATION AND BIOLOGICAL
ACTIVITIES OFOLIGOSACCHARIDE FROM
CROSSOSTEPHIUM CHINENSE
CHE Jin-zhi ,FU De-xian＊ ,OUYANG Fan
(National Lab.of Biochemical Engineering , Institute of Process Engineering ,
Chinese Academy of Sciences , Beijing　100080 , China)
Abstract　One kind of poly saccharide was isolated f rom the dried Chinese herbs—Crossostephium
chinense by fractional preparation , af ter decolorization an eliminating protein , it was hydrolyzed by
acid incompletely .The activated carbo column chromatog raphy w as used to separate this and four
kinds of oligosaccharid ex tracts w ere obtained by different elution liquid.Using cell-based model
for dru screening , test the level of insulin secretion promoted by these four oligosaccharid ex tracts.
The blank insulin secretion of normal islets w as 7.694 , oligosaccharid aqueous ex tract w as 8.506
and oligosaccharide 5%ethanol ext ract was 9.689.The results indicated that Crossostephium chi-
nense oligosaccharide aqueous ex tract an 5% ethanol ex tract could promo te insulin secretion.
Key words　Crossostephium chinense oligosaccharide;isolation;purif icat ion;insulin secretion
　　糖尿病是由于体内胰岛素分泌的绝对或相对不
足而引起的人体糖 、脂代谢紊乱[ 1] 。糖尿病发生过
程中 ,环境葡萄糖浓度是诱发胰岛 β 细胞功能衰退
的重要原因 。目前用于糖尿病治疗的药物各有特
色 ,但是有的药物价格高 ,有的药物用药途径不方
便 ,有的药物毒副作用明显 ,这就需要找到一种价格
低 、用药方便 、副作用小 、符合糖尿病这样一种终身
用药的疾病的药物或保健食品。
芙蓉菊(Crossostephium chinense(L.)Makino)
是菊科芙蓉菊属单种属植物 ,又名玉芙蓉 、蕲艾 、千
年艾 、香菊[ 2] 。我国古代医药学家认为芙蓉菊有广
泛的治疗效果 ,是祛风除湿 ,散结消肿 ,镇惊解毒的
重要药物[ 3] 。在岭南地区民间有用水煎服芙蓉菊
治疗糖尿病的传统 。芙蓉菊药用成分的研究很少 ,
芙蓉菊多糖及寡糖的研究还未见报道 。
本文系统的开展了对芙蓉菊寡糖的研究 ,制备
了芙蓉菊寡糖 ,对芙蓉菊寡糖促胰岛素分泌水平进
行了研究 ,深入的生化性质研究及结构研究工作正
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DOI :10.16333/j.1001-6880.2004.05.023
在进行当中。
1　材料与方法
1.1　材料
青霉素钠 、硫酸链霉素 ,华北制药股份有限公
司;Hepes 、透明质酸酶 ,Sigma Chemical Co.;RPM I-
1640 培养基 、胶原酶 Ⅳ型 , Gibco BRL products;
DNase-Ⅰ , Roche Co.;胎牛血清 ,北京鼎国生物技术
发展中心;胰岛素放免检测试剂盒 ,中国原子能科学
研究院;γ-计数仪(FT-630),北京核仪器厂;三周
龄 ICR小鼠 ,购于北京大学医学部实验动物中心;
1.2　方法
1.2.1　芙蓉菊多糖的提取
称取芙蓉菊茎枝部分共5.587 kg ,剪碎 ,三倍体
积的 95%乙醇室温浸泡两个月 , 之后四层纱布过
滤 ,过滤后的残渣水煮提三次 ,合并水煮提液 ,真空
蒸发浓缩后再次乙醇沉淀 ,沉淀离心后取上清真空
蒸发浓缩后得芙蓉菊粗多糖液 。芙蓉菊粗多糖液经
30%H2O2 脱色[ 4](多糖液调 pH 至 9.0 ,滴加 30%
H2O2于 50 ℃恒温 2 h),调 pH 至 7.0备用 。脱色
后三氯乙酸[ 5]法除蛋白 ,离心去除变性蛋白。经脱
色与除蛋白的芙蓉菊粗多糖液再次经由 95%酒精
沉淀 ,静置过夜 ,离心后 ,去除沉淀 ,浓缩上清液 ,烘
箱干燥后研磨称重 ,得到 114.9 g 干品(该干燥品溶
解后经苯酚-硫酸法检测显色 ,推测为芙蓉菊多糖
干品)。
1.2.2　芙蓉菊多糖的水解
采用部分酸水解法[ 6] ,用芙蓉菊多糖干品 20
mg 与50 mM 的H2SO4溶液5 mL 封管加热 ,100 ℃
4 h ,后用 Ba(OH)2 中和水解液至 pH 为 7.0 ,离心去
除不溶物;离心后上清添加 95%乙醇 ,静置过夜 ,离
心得沉淀烘箱干燥后称重备用 。本实验采用上述方
法等比例扩大操作。
1.2.3　芙蓉菊寡糖片断的分离[ 6]
粉末状活性炭经 150 ℃、 2 h 烘箱干燥后 ,经
20%恒沸盐酸煮沸 30 min ,趁热过滤并用热水洗涤
至中性 。将 1∶1的活性炭与硅藻土用水调匀 ,倾入
柱中(3×30 cm),待其自然沉降 。碳层上下均衬一
层玻璃棉 ,水淋洗至碳面不再下降时进样。取芙蓉
菊水解后寡糖溶于蒸馏水中 ,微热使其完全溶解 ,上
清液过柱 。蒸馏水 、5%、10%、20%乙醇液洗脱 ,流
速1 mL/min ,分部收集器收集 ,每管 10 mL ,苯酚-
硫酸法检测洗脱物 ,合并含糖洗脱液 ,洗脱液真空蒸
发后烘箱干燥。
1.2.4　胰岛细胞的原代培养
取三周龄 ICR小鼠 ,引颈处死后解剖小鼠并钝
性分离胰腺 ,D-Hanks平衡盐溶液清洗胰腺三次后
用剪剪碎胰腺至 1 mm 以下 , Hanks平衡盐溶液再
清洗胰腺碎片三次 ,加入 0.1%胶原酶Ⅳ型 、0.1%
透明质酸酶和 0.1%DNase-Ⅰ(其用量分别为组织
碎片体积的 4 、2和 1倍),试管封盖后于 4 ℃冷消化
2 h ,然后 37 ℃热消化 5 min。消化终了后马上加入
冷的 Hanks液 ,略吹打后过 400 μm 筛。收集滤液
在 600 rpm离心 1 min ,去上清 ,再次用 Hanks液洗
涤并略吹打 ,如此反复离心 、洗涤 、吹打三次 ,分离到
的胰岛以 RPM I-1640为培养基 , 37 ℃, 5%CO2 培
养箱中培养(在稳定分泌期内 ,可取出胰岛组织用来
实验测定)。
1.2.5　胰岛素分泌水平测定
根据本实验室已建立的糖尿病药物筛选模
型[ 7] ,对芙蓉菊寡糖 4 种洗脱组分促胰岛素分泌水
平进行检测。采用浓度为 5—160 mIU/L 的胰岛素
标准品 ,用放射免疫法[ 8] 测定不同胰岛素浓度时结
合型抗原-抗体复合物的沉淀读数 ,绘制放免检测
胰岛素的标准曲线 。待测样按同样的操作反应后 ,
于标准曲线上得到相应的胰岛素含量 。
2　结果与讨论
2.1　芙蓉菊寡糖柱分离结果
由硫酸-苯酚显色法检测芙蓉菊寡糖各洗脱
液 ,当洗脱液不与苯酚-硫酸显色时 ,说明这一洗脱
液内不含糖 ,换下一洗脱液 。2 g 水解后芙蓉菊干
燥寡糖的各级洗脱液用量及产物量为:蒸馏水 2000
mL;5%乙醇 1800 mL , 111.6 mg;10%乙醇 2000
mL ,86.5 mg;20%乙醇 1900 mL ,89.6 mg 。
可以看出 ,通过乙醇梯度洗脱可实现寡糖片段
的分离 ,但洗脱速度较慢 ,洗脱效率低 。原因可能是
由于芙蓉菊寡糖由水解得到 ,水解过程中得到的寡
糖片段不均一 ,分子量较大的片段占大多数 ,其与活
性炭的吸附作用较强 ,不易洗脱 。
2.2　胰岛细胞原代培养结果分析
在本研究中对消化所采用的酶类和消化时间进
行了优化 ,其中 DNase-Ⅰ的引入可剔除消化过程中
因部分细胞破损而泄露的遗传物质。由于胰岛是分
散排布在胰腺内分泌部的 ,实验中在 10 min 、37 ℃
热消化过程之前先进行了 2 h 、4 ℃的冷消化处理 ,
4592004　Vol.16　No.5 车今智等:芙蓉菊寡糖的分离纯化及其生物活性的研究 　　　　　　　　　
该过程有利于酶分子扩散进入组织块内部 ,以实现
组织块内外的同步消化 。结果表明 ,该方法可使活
性胰岛的收获率提高 10%,胰岛原代培养物可在体
外存活6周 ,维持稳定分泌胰岛素 10 d ,适应糖尿病
药物筛选的初步要求 。
2.3　芙蓉菊寡糖各组分对于胰岛分泌的影响
芙蓉菊寡糖各洗脱组分对于正常胰岛分泌功能
的影响如表 1所示。实验采用胰岛在 5.5 mM 葡萄
糖/芙蓉菊寡糖洗脱组分培养 2 h ,检测上清胰岛素
含量 ,对照值为 5.5 mM 葡萄糖培养 2 h 的胰岛素
分泌值。
表 1　芙蓉菊寡糖各洗脱组分对正常胰岛分泌功能的影响
　Table 1　The effect of crossostephium chinense oligosaccha-
ride extracts on insulin secretion of normal islets
组分
Ext ract s
A B C D Cont rol
胰岛素
Insulin(mI U/ L)
8.506±
1.162　 9.689±1.320　 7.534±1.077　 6.824±1.338　 7.694±1.177　
　1)A , B, C , D 分别表示芙蓉菊寡糖经过柱层析的水相 、5%乙醇相 、
10%乙醇相 、20%乙醇相 ,各组用量均为 1.0 mg/mL , 该数据为三次
独立实验的结果。本文后续芙蓉菊寡糖各组分含量及标记均沿用此
法。
芙蓉菊寡糖各洗脱组分在高糖损伤环境中对胰
岛分泌功能的影响如表 2 所示 。实验采用胰岛在
22.2 mM 葡萄糖/芙蓉菊寡糖洗脱组分培养 48 h ,
检测上清胰岛素含量 ,对照值为 22.2 mM 葡萄糖培
养 48 h的胰岛素分泌值。
　表 2　芙蓉菊寡糖各洗脱组分对高糖损伤胰岛分泌功能
的影响
　Table 2　The effect of crossostephium chinense oligosaccha-
ride ex tracts on secretion function of high-glucose
impaired islets
组分
Ext ract s
A B C D Contol
胰岛素
Insulin(mI U/ L)
6.353±
1.120　 9.762±1.237　 8.709±1.115　 6.699±1.032　 8.907±1.392　
　　由表 1 、表 2数据显示芙蓉菊寡糖水洗脱组分 、
5%乙醇洗脱组分在 1.0 mg/mL 剂量下对于正常胰
岛素的分泌水平有不同程度的促进作用 ,芙蓉菊寡
糖 5%乙醇洗脱组分对于高糖损伤胰岛细胞也有一
定的促进分泌作用 ,10%、20%乙醇洗脱组分对于胰
岛素的分泌功能影响不大。初步认为 ,用蒸馏水洗
脱得到的为无机盐 、单糖或是分子量较低的寡糖 ,而
用 10%、20%乙醇洗脱得到的则是较大片断的寡糖
或是未水解完全的多糖片断 。因为多糖的生物活性
往往在于不断重复的寡糖片断 ,因此推测芙蓉菊寡
糖水 、5%乙醇洗脱组分是芙蓉菊降血糖的活性寡糖
比较集中的洗脱相 ,这两相的物质详细组成 、化学结
构和分子作用原理有待深入研究 。
总之 ,经过上面的初步检测认为芙蓉菊寡糖的
4种洗脱组分中 ,水 、5%乙醇洗脱组分在促进胰岛
素分泌方面有潜在价值 ,值得做深入的生物学和化
学方面探讨 。
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