全 文 ：第 25卷第 1期 浙江师范大学学报(自然科学版) Vol.25 , No.1
2002年 2月 JOURNAL OF ZHEJIANG NORMAL UNIVERS ITY(Nat.S ci.) Feb.2002
文章编号:1001-5051-(2002)01-0062-04
毛茛属两种植物的过氧化物酶同工酶
和酯酶同工酶的研究
徐根娣 , 刘 鹏 , 钱 丽
(浙江师范大学 生命与环境科学学院 ,浙江 金华 321004)
摘 要:用聚丙烯酰胺凝胶电泳法对毛茛属的毛茛(Ranunculus japonicusscus Thunb.)和扬子毛茛(Ranuncu-
lus siebodii Miq.)在不同生境中的叶 、茎 、果实进行了过氧化物酶同工酶及酯酶同工酶的分析 , 2 个种的各组织
器官均存在相似的酶谱 ,其中过氧化物酶的分离效果较酯酶的分离效果好 ,茎 、果的酶带较叶的酶带多且分离
效果好.结果表明 , 不同种之间 、同一种类在不同生境中及同一种类不同组织器官中的同工酶谱有差异.
关键词:毛茛;过氧化物酶;酯酶;同工酶;凝胶电泳
中图分类号:Q942;Q945 文献标识码:A
毛茛科有 40余属 、1 500余种 ,主要分布于北
温带 ,我国有 38属 、近 600 种 ,各地均有分布[ 1] .
该科植物含有较多的粗蛋白及少量的纤维素 ,营
养价值较高 ,绝大多数种有毒 ,可入药.
同工酶分析是从分子水平上进行植物遗传多
态性研究的重要手段.在高等植物中 ,过氧化物酶
广泛而大量地存在着 ,并且是高度多型的[ 2] .酯
酶非特异性地存在于一切植物中.为获得清晰稳
定的电泳酶谱 ,笔者选取不同的毛茛材料 ,系统地
对两种毛茛的叶 、茎 、果的过氧化物酶及酯酶同工
酶进行了分析 ,从分子水平上研究了不同生长环
境对毛茛的影响 ,为毛茛的分类鉴定提供了依据 ,
并且对探讨毛茛的分化 、生态分布有一定的价值.
1 材料与方法
1.1 材 料
采用不同生境中的毛茛(Ranunculus japoni-
cusscus Thunb.)和扬子毛茛(Ranunculus siebodi i
M iq.)的叶 、茎 、果 3个不同组织部位.样品采样
地及形态特征见表 1.
表 1 植物样品采样地及类型
植物名称 编号 外部形态特征 采样地
毛茛
A 1
A 2
茎直立 ,中空
茎直立 ,中空
金华北山
(海拔 700 m 以上)
浙江师范大学校园
(海拔 30 m ～ 40 m)
扬子毛茛
B1
B2
果对叶单生 ,茎铺散,
细弱 ,叶片小
果对叶单生 ,茎不铺散 ,
粗壮 ,长势好 ,叶片大
浙江师范大学校园
刚收割完的油菜地
(海拔 30 m ～ 40 m)
1.2 样品处理
分别取生长良好的植株叶 、茎 、果实各2 g ,在
冰浴中研磨 ,各加入 pH 8.3的 Tris-甘氨酸电极
缓冲液(1.5 g Tris 和 7.05 g 甘氨酸定容1 000
mL)2 mL 、2 mL 和 4 mL ,装入离心管 ,平衡后离
心(12 000 r/min ,15 min),取上清液 ,分别加入等
量的 ρ(蔗糖)为0.4 g/mL 的蔗糖溶液 ,再加入一
滴溴酚蓝指示液 ,摇匀放入冰箱中保存待用.
1.3 电泳及染色
采用垂直平板聚丙烯酰胺凝胶电泳 ,浓缩胶
收文日期:2001-04-05;修订日期:2001-11-02
基金项目:浙江省大型仪器测试基金资助项目(0067).
作者简介:徐根娣(1957-), 女(汉族), 浙江余姚人 ,浙江师范大学生命与环境科学学院高级实验师.研究方向:植物生理生化;
植物遗传;植物营养学.
ρ(丙烯酰胺)为 0.035 g/mL ,pH 值 6.7;分离胶
ρ(丙烯酰胺)为 0.075 g/mL ,pH 8.9.过氧化物酶
测定的点样量为每孔 20 μL ,酯酶测定的点样量
为每孔 15μL.10 ℃～ 16 ℃电泳 ,电压先调至100
V 稳压 ,当溴酚蓝到达浓缩胶与分离胶界面时调
至 200 V ,当溴酚蓝接近胶底线时停止电泳.
过氧化物酶染色:0.2 g 联苯胺加 1.5 mL 冰
醋酸 60 ℃溶解 ,再加入8.5 mL 双蒸水摇匀 ,取6
mL;ρ(NH4Cl)为 0.04 g/mL NH4Cl溶液 6 mL;
ρ(EDTA-Na2)为 0.05 g/mL 的 EDTA-Na2 溶液
6 mL;φ(H2O2)为 0.3%的 H2O2 溶液 6 mL ,加50
mL 双蒸水配成染液 ,室温下染 5 min ～ 10 min ,
即呈现蓝色的过氧化物酶酶谱 ,取出自来水冲洗
后放入去离子水中保存.
酯酶染色:称 0.05 g 醋酸-α-萘酸和 0.05 g
坚牢蓝 RR盐分别溶于 2.5 mL 丙酮 ,加入 6.625
mL 0.2 mol/L Na2HPO4 溶液 、18.375 mL 0.2
mol/L NaH2PO4 溶液及 25 mL 双蒸水配成染液 ,
室温下染色 5 min ～ 10 min ,即得到棕褐色酯酶酶
谱 ,取出自来水冲洗后保存于 φ(HAc)为7%的
HAc溶液中.
图 1 不同生境 2种毛茛各器官的过氧化物酶酶谱及酶谱示意图
2 结果与讨论
2.1 过氧化物酶
由图 1(a)、(b)可见 ,供试材料的过氧化物酶
共显出 17条 Rf值不同的酶带 ,从负极到正极分
布于慢(Rf<0.200)、中(0.200≤Rf≤0.500)、快
(0.500
慢区的 2 条酶带POD-2 、POD-3(Rf 分别为0.042
和0.115)在 2种毛茛的各部位出现频率均较高 ,
分别为 0.917 和 1.000;处在中 区的 POD-8 、
POD-11(Rf分别为0.321和0.396)出现频率分别
为1.000和0.917 ,很可能这 4条酶带是 2种毛茛
各组织器官的特征酶谱.在快区只显示出茎 、果的
酶带 , 2 种毛茛的茎有 2 条相似的酶带 , Rf 为
0.813和0.885;2 种毛茛的果则显示了一条相异
的酶带 ,毛茛 Rf 为0.781 ,扬子毛茛 Rf为0.531.
总的看来 ,各组织中果实和茎显示的强带较叶多;
不同种之间 ,毛茛的茎果强带比扬子毛茛多;同种
之间各酶带也显示出差异性.
表 2 不同生境 2 种毛茛各器官的过氧化物酶谱带数
类型 叶 茎 果 总数
A1 8 11 12 31
A2 6 11 9 26
B1 9 10 9 28
B2 8 10 9 27
同种毛茛在不同生境中过氧化物酶的数量有
变化(见表 2).从茎 、叶 、果 3 部分共显示的酶带
来看 ,A1比 A2多 5条 ,且强度也相对要强;B1 比
B2多 1条 ,但强度不及后者.这说明环境条件不
同易造成同工酶谱的差异 ,很可能由于环境的差
异 ,同种毛茛已开始出现分化.A1 地处海拔 700
多米 ,昼夜温差大 ,环境波动比校园内要大 ,所处
环境的营养 、水分等条件不及 A2 所处的环境稳
定.为适应生存 ,逆境中的植株就会表现出更多的
63 第 1期 徐根娣 ,等:毛茛属两种植物的过氧化物酶同工酶和酯酶同工酶的研究
过氧化物同工酶参与代谢 , 这与中性突变学说
(neutral mutation hypothesis)[ 3]的观点还是比较
一致的 ,同时对“在周围环境波动大的条件下生活
的有机体 ,将比生活在环境比较稳定的有机体 ,或
者内环境比较稳定的有机体需要更多的遗传变
异”[ 4]这一预言也给予了一定的支持.当然 ,由于
生境的不同 ,取材不可能完全在同一生长阶段.B2
长势好 ,而发育比B1 慢 ,这也可能是导致B2 比B1
酶谱带数少的另一原因.因为总的情况是下部老
组织比上部幼嫩组织显示的谱带数多[ 5] .
从不同组织器官来看 ,叶 、茎 、果各组织均存
有相似的酶带 ,但更多的是相异酶带 ,数量和强度
都有差异.这表明同工酶在不同部位显示了各自
的特异性 ,这与各组织器官的生理功能和代谢类
型的不同有密切的关系.本实验中虽加样量都为
20 μL ,但果样溶液质量浓度比茎 、叶溶液的质量
浓度低一倍 ,表明果实中酶活性较强.过氧化物酶
是植物体内的保护酶之一 ,酶活性的高低可反映
植物生长发育及内在代谢情况.说明植物花期过
后果实正处在不断生长发育之中 ,代谢活动特别
旺盛 ,因而酶活性相对比叶 、茎要强.
A1与 A2 同属于毛茛种 ,从叶 、茎 、果各组织
共显示的酶带数来看 ,A1 比 A2 多;同样 B1 比 B2
多.根据 Garva 和 Tsunwaki 等提出的“同工酶越
多 ,品系越进化”[ 3]的理论 , 则 A1 比 A2进化 , B1
比 B2进化.这也暗示了编码同工酶的基因在种内
居群间存在一定差异 ,呈现遗传上的多样性 ,表明
物种在不同的生境中正在逐步分化.
从图 1(a)、(b)中还可以看出 ,过氧化物酶同
工酶的种间差异明显大于种内群居间的差异.这
表明不同种的遗传组成有很大差别 ,很可能是造
成物种分化的一个原因.这为上述 2 种毛茛种类
的鉴别和亲缘关系的比较提供了生化资料 ,与形
态学分类资料也基本吻合.
以上对过氧化物酶同工酶的分析表明 ,植物
过氧化物酶同工酶的多与少 、有与无 ,与植物的不
同种类 、不同生长环境 、不同生长阶段及不同组
织器官等均有密切关系.
图 2 不同生境 2种毛茛果实的酯酶酶谱及酶谱示意图
2.2 酯酶同工酶
酯酶是多种碳酸酶的水解酶 ,底物特异性不
强 ,所以可能参与毛茛中烷类化合物的生物合成
和转化.本实验酯酶同工酶的分离效果不及过氧
化物酶好 ,并且各组织中仅果实显示了较清晰的
酶带 ,叶 、茎没能显示出酶带[图 2(a)、(b)] .本实
验各组织加样量均为 15 μL ,但叶 、茎 、果的溶液
质量浓度不同 ,且果实溶液的质量浓度是叶 、茎的
一半 ,表明果实中的酯酶含量多于茎 、叶 ,也说明
了同工酶在不同组织中有特异性.
不同生境中的同种毛茛 ,果实显示出的酯酶
带数差异很大.A1显示 13条 ,A2 显示 6条 ,B1 显
示 9条 ,B2 显示 7条.A2 显示的酶带 A1 都有 ,B2
有的酶带 B1 都有 ,这同样说明环境的差异易造成
同工酶的变化 ,同种植物处在不同的生境中正逐
步开始分化.不同种之间的差异更明显 ,毛茛的酶
带主要集中在 Rf为0.330 ～ 0.553之间 ,扬子毛茛
的酶带主要集中在 Rf 0.282 ～ 0.427之间.
64 浙江师范大学学报(自然科学版) 2002年
总之 ,两种毛茛不同生境的各组织过氧化物
酶和酯酶都有一定的差异 ,因而同工酶研究可用
于探讨植物各居群的生态分化和适应 ,为植物种
类的鉴别和系统演化提供生化资料.
参考文献:
[ 1] 新疆八一农学院主编.植物学分类[ M] .北京:农学出版社, 1980.76.
[ 2] 胡能书 ,万贤国编.同工酶技术及其应用[ M] .长沙:湖南科学技术出版社 , 1985.104-105.
[ 3] 赖德 C C ,泰勒 C B著;范培昌译.生物学研究概说———同工酶[ M] .北京:科学出版社 , 1987.26.
[ 4] Selander R W , Kanfman D W.Codominant isoenzymes alleles as markers of genetic diversi ty correlated w ith hetersis in maize(Zea mays)
[ J] .Thero And Appl Genet , 1975 , 46(3):4-97.
[ 5] 何忠效 ,张树政.电泳.第 2版[ M] .北京:科学出版社 , 1999.258-312.
The study of peroxidase isoenzyme and esterase isoenzyme
in two species of Ranunculus
XU Gen-di , LIU Peng , Q IAN Li
(Academy o f Li fe and En vironment S cience , Zhejiang Normal Universi ty , Jinhua Zhejiang 321004 , Ch ina)
Abstract:Leaves , stems and fruits of tw o species of Ranunculus(Ranunculus japonicusscus Thunb.and
Ranunculus siebodii Miq.)were studied on POD isoenzyme and EST isoenzyme by PAGE.The result
showed that there were different POD and EST in dif ferent species and tissues.Same species in dif ferent en-
vironment showed the same case.On the spearation effect , POD was bet ter than ES T , stems and frui ts
w ere bet ter than leaves.
Key words:Ranunculus;POD;EST ;isoenzyme;PAGE;elect rophoresis
(责任编辑 薛 荣)
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