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莴笋多酚氧化酶、过氧化物酶的
特性及抑制作用研究
周向军，杨金龙，路宛如
(天水师范学院生命科学与化学学院，甘肃天水 741001)
收稿日期:2014－07－08
作者简介:周向军(1980－) ，男，硕士研究生，讲师，研究方向:食品酶学。
摘 要:采用分光光度法测定莴笋多酚氧化酶(PPO)和过氧化物酶(POD)的活性，研究酶的稳定性、温度、pH、底物浓
度及几种抑制剂对其活性的影响，建立相应酶促动力学方程，利用正交实验探讨最佳抑制条件。结果表明，PPO 和
POD最适温度分别为 50℃和 40℃，最适 pH分别为 6.0 和 6.5，随温度不断升高，PPO和 POD活性逐渐下降。动力学方
程分别为 V =342.566［S］/(5.9 × 10 －3 +［S］)和 V = 3403.008［S］/(6.88 × 10 －4 +［S］)。对 PPO 抑制强弱为:VC ＞
L－Cys ＞ NaHSO3 ＞柠檬酸 ＞ EDTA ＞苯甲酸 ＞琥珀酸，对 POD 抑制强弱为:EDTA ＞ VC ＞ L－Cys ＞柠檬酸 ＞ NaHSO3 ＞
琥珀酸 ＞苯甲酸。正交实验表明，对 PPO最佳抑制条件为:NaHSO39mmol /L、L－Cys 5mmol /L及 VC 5mmol /L。对 POD
最佳抑制条件为:VC 0.2mmol /L、EDTA 0.2mmol /L及 L－Cys 1.4mmol /L。
关键词:莴笋，多酚氧化酶，过氧化物酶，特性，抑制
Properties and inhibitions of polyphenoloxidase and
peroxidase from Asparagusplettuce
ZHOU Xiang－jun，YANG Jin－ long，LU Wan－ru
(College of life science and chemistry，Tianshui Normal University，Tianshui 741001，China)
Abstract:The activities of polyphenoloxidase (PPO)and peroxidase (POD)from Asparagusplettuce were
determined by spectrophotometer.Enzyme stabilities，the effects of temperature，pH，substrate concentration and
several inhibitors on PPO and POD，and their corresponding reaction kinetics equation were studied.Orthogonal
experiments were used to optimize inhibition technology.The results showed that the optimum temperature and pH
of PPO and POD were 50℃ and 40℃，pH6.0 and pH6.5，respectively.Activities of PPO and POD decreased with
increasing temperature.Kinetic equation for PPO and POD were V = 342.566［S］/(5.9 × 10 －3 +［S］)and V =
3403.008［S］/(6.88 × 10 －4 +［S］)，respectively.Inhibition effects were as follows:VC ＞ L－Cys ＞ NaHSO3 ＞ citric acid
＞ EDTA ＞ benzoicacid ＞ succinic acid for PPO，EDTA ＞ VC ＞ L－ Cys ＞ citric acid ＞ NaHSO3 ＞ succinic acid ＞
benzoic acid for POD.Orthogonal experiments showed that the optimum inhibition conditions were as follows:
NaHSO39mmol /L，L － Cys 5mmol /L and VC 5mmol /L for PPO，VC 0.2mmol /L，EDTA 0.2mmol /L and L － Cys
1.4mmol /L for POD，respectively.
Key words:Asparagusplettuce;polyphenoloxidase;peroxidase;properties;inhibition
中图分类号:TS255.3 文献标识码:A 文 章 编 号:1002－0306(2015)05－0166－06
doi:10． 13386 / j． issn1002 － 0306． 2015． 05． 026
莴笋(Asparagusplettuce)为菊科草本植物，在我
国各地普遍栽培。莴笋适合鲜切或速冻等加工，但
在加 工 过 程 中 极 易 发 生 褐 变。多 酚 氧 化 酶
(polyphenol oxidase，PPO)和过氧化物酶(peroxidase，
POD)是引起果蔬褐变的关键酶，当氧气存在时，前
者能催化内源酚氧化生成醌，醌与氨基酸(或蛋白
质)作用生成高分子络合物，从而导致褐色素的生
成，色素分子量愈高，颜色愈暗［1－2］，后者是 H2O2 在
POD作用下，生成强氧化性的新生态氧，将酚类化合
物氧化，生成各种自由基，随后通过分子间聚合生成
聚合物［3］。果蔬褐变将影响其感官品质、市场和营养
价值［4－5］。控制酶促褐变的方法较多，物理法如漂
烫，易导致果蔬质地变软［6］，热处理易影响果汁风味，
有一定局限性，因而目前化学法使用较多。王国英［7］
研究西葫芦 PPO 的特性，并比较了几种抑制剂的抑
制强弱。范腾［8］研究胡萝卜的 POD 和苯丙氨酸解氨
酶的特性和抑制条件。李晓莉［9］研究几种抑制剂对
山药 PPO的抑制强弱为:L－抗坏血酸 ＞柠檬酸 ＞苹
果酸。孔维宝［10］研究表明，L－cys并不是通过对 PPO
活性中心的结构性修饰，或是发生共价结合来抑制
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其活性，而是直接与其酶促反应产物醌类物质结合
生成无色的硫氢化合物，从而抑制褐变的发生。本
实验研究莴笋 PPO和 POD特性，探讨了几种抑制剂
对其活性的影响，为深入明确莴笋褐变的机理、控制
褐变提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
新鲜莴笋除去叶和纤维化不可食用部分，低温
储存;VC sigma产品;L－Cys 国药集团化学试剂有
限公司;NaHSO3 天津市凯信化学工业有限公司;柠
檬酸，EDTA 天津德县化学试剂有限公司;苯甲
酸 中国新中化学厂;琥珀酸 化学试剂厂，均为分
析纯;反应混合液:100mmol /L pH 6.0 磷酸缓冲液
50mL，愈创木酚 28μL，磁力搅拌溶解，加入 30%H2O2
19μL，混匀备用。
722 型可见分光光度计 上海欣茂有限公司;
PHS－ 3D 雷磁 pH 计 上海精密科学有限公司;
TGL－20M型高速台式冷冻离心机 长沙湘仪离心机
仪器有限公司;AL204 型电子天平 梅特勒 －托
利多。
1.2 实验方法
1.2.1 酶液的制备及活性测定 称 5.0g 新鲜莴笋，
置于研钵中，加少许石英沙，5.0mL 磷酸缓冲液，冰浴
研磨成匀浆，4℃，12000r /min 离心 15min，收集上清
液，定至 25mL［11］。PPO 活性测定:试管中加入
50mmol /L pH5.5 乙酸 －乙酸钠缓冲溶液 4.0mL 和
50mmol /L邻苯二酚溶液 1.0mL，最后加入 100μL 酶
液，立即开始计时，420nm 测吸光值。POD 活性测
定:试管中加入 3mL，25mmol /L 反应混合液和 0.1mL
酶液，0.2mL 0.5mol /L H2O2，迅速混合，470nm 测定。
以吸光值变化表示酶活。定义:吸光值每分钟变化
0.01 所需的酶量定义为一个活力单位(U)。
1.2.2 反应进程曲线 在 0 ～ 15min 范围内，每隔
1min，测定 PPO 吸光值。在 0 ～ 8min 范围内，每隔
30s，测定 POD 吸光值。以时间为横坐标，吸光值为
纵坐标，制作反应进程曲线，确定 PPO 和 POD 测定
时间。
1.2.3 温度对酶活性的影响和稳定性实验 pH5.5
乙酸－乙酸钠缓冲液 3.0mL 在 35、40、45、50、55、60、
65℃下保温 10min，加入 50mmol /L 邻苯二酚 1.0mL，
0.1mL 酶液，混匀，测定 OD420。酶在 50、60、70、80、
90℃下分别预热一定时间，探讨 PPO 稳定性。反应
混合液 3.0mL，在 35、40、45、50、55、60℃ 下保温
10min，加入 0.5mL酶液，测定 OD470。酶在 40、50、60、
70、80、90℃下分别预热一定时间，探讨 POD稳定性。
1.2.4 pH 对酶活性的影响 pH5.0，5.5，6.0，6.5，7.0
乙酸－乙酸钠缓冲液 3.0mL，保温 10min，加入 1mL邻
苯二酚溶液和 0.1mL 酶液，测定 OD420，确定 PPO 最
适 pH。pH4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0 和 7.5 的反应混合
液 3.0mL，保温 5min，加入 0.5mL 酶液，摇匀，测定
OD470，确定 POD最适 pH。
1.2.5 不同底物浓度对酶活性的影响 50℃、pH6.0
条件下，测定邻苯二酚分别为 0.001、0.002、0.004、
0.005、0.008、0.01mol /L时吸光值，制作底物浓度随时
间的变化曲线，并拟合各直线斜率，计算 PPO 的 Vmax
和 Km
［12］。40℃、pH6.5 条件下，测定愈创木酚分别为
0.002、0.004、0.006、0.008、0.01、0.012mol /L 时吸光
值，制作底物浓度随时间的变化曲线，并拟合各直
线，计算 POD的 Vmax和 Km。
1.2.6 不同抑制剂对酶活性的影响 以乙酸－乙酸
钠缓冲液为对照，加入终浓度分别为 0、2、4、6、8、
10mmol /L 的 L－ Cys、VC、NaHSO3，0、20、40、60、80、
100mmol /L的 EDTA、柠檬酸、苯甲酸和琥珀酸，测定
PPO吸光值，计算相对剩余酶活。0、0.04、0.08、0.12、
0.16、0.2mmol /L 的 EDTA、VC，0、0.2、0.4、0.6、0.8、
1mmol /L 的 L － Cys，0、4、6、8、10、12mmol /L 的
NaHSO3，0、40、60、80、100、120mmol /L 的柠檬酸、苯甲
酸和琥珀酸，测定 POD吸光值，计算相对剩余酶活。
相对剩余酶活(%)=测定管酶活性 × 100 /对照
管酶活性
1.2.7 正交实验 根据单因素实验结果，选择抑制
作用较强的几种抑制剂进行正交设计，见表 1 和 2。
表 1 PPO正交实验设计
Table 1 Orthogonal experiment of PPO
水平
因素(mmol /L)
A NaHSO3 B L－Cys C VC
1 8 5 5
2 9 6 6
3 10 7 7
表 2 POD正交实验设计
Table 2 Orthogonal experiment of POD
水平
因素(mmol /L)
A VC B EDTA C L－Cys
1 0.2 0.16 1
2 0.24 0.2 1.2
3 0.28 0.24 1.4
1.3 数据统计分析
利用 origin7.5 作图，单因素方差分析采用 Excel
2003(p ＜ 0.05)，正交分析采用 SPSS 16，数据以平均
值 ±标准差(珋x ± s)表示。
2 结果与分析
2.1 酶促反应进程曲线的确定
由图 1a可知，2min内 PPO的反应速率随时间变
化成线性增长，随后反应速率逐渐降低并趋于平缓。
由图 1b 可知，3min 内 POD 的反应速率随时间的变
化呈线性增加，随后曲线趋于平坦，反应速率下降。
反应速率随时间延长降低的原因是底物浓度逐渐下
降;产物增加加速了逆反应的进行;随时间延长酶本
身部分失活等，因此，酶活测定应选择反应初速率，
避免上述因素的干扰［13］，本实验 PPO和 POD测定时
间分别 2min和 3min。
2.2 PPO和 POD的最适温度及稳定性
PPO吸光值随温度的变化见图 2a，在 30～ 50℃
范围内，随温度升高，吸光值逐渐增大，50℃时达到
168
图 1 酶促反应进程曲线
Fig.1 Standard curve of enzyme catalysis
注:a:PPO反应进程曲线;b:POD反应进程曲线。
图 2 温度对酶活性及稳定性的影响
Fig.2 Effect of temperature on enzyme and stabilities
注:a，c分别表示温度对 PPO和 POD活性的影响;
b，d分别表示 PPO和 POD对温度的稳定性。
最大值，随后迅速下降，故最适温度为 50℃，这是因
为随温度增加，底物分子动能增大，反应速率增加，
当温度高于 50℃时，随着温度增加，蛋白质分子的热
运动增大，导致蛋白变性［14］。由图 2b 可知，随温度
升高，酶活力逐渐下降，90℃时几乎没有活性。由图
2c可知，POD最适温度为 40℃，40℃以下时，POD 活
性随温度的升高而逐渐增加，褐变程度加深，当温度
大于 50℃时，酶活性迅速下降。由图 2d 可知，随温
度不断升高，POD 活性逐渐下降，80℃时几乎没有
活性。
2.3 pH对莴笋 PPO和 POD活性的影响
由图 3a可知，随 pH 升高，PPO 速率上升，pH6.0
时达最大值，故最适 pH 为 6.0，继续增大 pH，PPO
活性迅速下降，这可能与多酚氧化酶的活性部位含
有组氨酸基团(pK = 6.0)有关［15］。由图 3b 可知，
pH5.5 时出现一个肩峰，这可能是由于反应液中存
在同工酶的缘故。过酸或过碱均不利于 POD 活
性。pH大于 6.5 时，酶活性开始降低，故 POD 最适
pH为 6.5。
图 3 pH对酶活性的影响
Fig.3 Effect of pH on enzyme
注:a，b分别表示 pH对 PPO和 POD活性的影响。
2.4 不同底物浓度对莴笋 PPO 和 POD 活性的
影响
底物浓度对 PPO的影响及其双倒数作图见图 4a
和 图 4b，PPO 的 Km = 0.0059mol /L，Vmax =
342.566U /min·g，V = 342.566［S］/(0.0059 +［S］)。
底物浓度对 POD 的影响及其双倒数作图见图 4(c)
和(d)，求得 POD 的 Km = 6.817 × 10
－4 mol /L，Vmax =
3403.008U /min·g，V = 3403.008［S］/(6.817 × 10 －4 +
［S］)。
2.5 不同抑制剂对莴笋 PPO和 POD活性的影响
各抑制剂对莴笋 PPO 及 POD 活性的影响见图
5a～图 5d，IC50计算结果见表 3。L－Cys可与反应所产
169
图 4 底物浓度对酶活性的影响
Fig.4 Effect of substrate concentration on enzyme
注:a，b分别表示 PPO的 v－t曲线和 1 /V－1 /S曲线;
c，d分别表示 POD的 v－t曲线和 1 /V－1 /S曲线。
生的醌结合，形成一种稳定的无色化合物，同时其结
构中的－ COOH 螯合金属离子作用很强，可作用于
PPO中的 Cu2 +［16］。VC 可作为酶分子中 Cu
2 +的螯合
剂，抑制酶促褐变的发生，另外 VC 既可作为醌的还
原剂，将体系中原有的醌类还原为无色物质，甚至其
可被 PPO直接氧化，起到竞争性抑制剂的作用［17－18］。
NaHSO3 与醌不可逆的生成无色产物，与此同时降低
了酶作用于一元酚和二羟基酚的活力，同时 NaHSO3
具有漂白和抑制微生物作用［19］。柠檬酸对 PPO的抑
制机制是由于柠檬酸分子中的 －COOH对 PPO 中的
Cu2 +有较强的螯合作用［20］。苯甲酸和琥珀酸主要是
提供酸性环境，使 PPO 偏离最适 pH。EDTA 提供碱
性环境，并具有螯合金属离子的作用［21］。
图 5 不同抑制剂对 PPO和 POD的影响
Fig.5 Effect of different inhibitors on PPO and POD
注:a:L－Cys、VC 及 NaHSO3 对 PPO活性的影响;
b:柠檬酸、琥珀酸、苯甲酸及 EDTA对 PPO活性的影响;
c:EDTA、VC 及 L－Cys对 POD活性的影响;
d:NaHSO3、柠檬酸、苯甲酸及琥珀酸对 POD活性的影响。
表 3 不同抑制剂对 PPO和 POD的 IC50
Table 3 IC50 of PPO and POD for different inhibitors
抑制剂
对 PPO的 IC50
(mmol /L)
对 POD的 IC50
(mmol /L)
VC 1.774 0.100
L－Cys 3.428 0.700
NaHSO3 5.019 9.712
柠檬酸 21.776 6.218
EDTA 25.196 0.064
苯甲酸 30.802 48.562
琥珀酸 54.070 32.210
170
2.6 正交实验
由表 4 可知，对 PPO抑制的最佳组合为 A2B1C1，
即 NaHSO3 9mmol /L，L－Cys 5mmol /L，VC 5mmol /L，由
表 5 可知，A(NaHSO3)和 C(VC)对 PPO 的抑制达到
极显著(p ＜ 0.05)，B(L－ Cys)的影响不显著(p ＞
0.05)。最佳条件下重复 3 次，对 PPO 抑制率为
(35.96 ± 0.88)%。由表 6 可知，对 POD 抑制的最佳
组合为 A1B2C3，即 VC 0.2mmol /L，EDTA 0.2mmol /L，
L－Cys 1.4mmol /L，由表 7 可知，A(VC)对 POD 的抑
制达到极显著(p ＜ 0.05) ，B(EDTA)和 C(L－Cys)的
影响不显著(p ＞ 0.05)。最佳条件下重复 3 次，对
POD抑制率为(34.97 ± 0.31)%。
表 4 对 PPO抑制的正交结果
Table 4 Ｒesults of orthogonal experiment for PPO
序号 A B C 抑制率(%)
1 1 1 1 29.733
2 1 2 2 34.467
3 1 3 3 21.000
4 2 1 2 32.133
5 2 2 3 22.633
6 2 3 1 26.167
7 3 1 3 14.467
8 3 2 1 18.567
9 3 3 2 24.633
K1 24.822 25.556 28.289
K2 30.411 25.111 27.089
K3 19.367 23.933 19.222
Ｒ 11.044 1.623 9.067
表 5 PPO方差分析
Table 5 Analysis of variance for PPO
方差
来源
离均差
平方和
自由度 均方差 F p
A 548.936 2 274.468 136.318 0.000
B 12.649 2 6.324 3.141 0.065
C 436.587 2 218.293 108.418 0.000
误差 40.269 20 2.013
表 6 对 POD抑制的正交结果
Table 6 Ｒesults of orthogonal experiment for POD
序号 A B C 抑制率(%)
1 1 1 1 29.560
2 1 2 2 32.673
3 1 3 3 32.430
4 2 1 2 26.790
5 2 2 3 26.120
6 2 3 1 26.177
7 3 1 3 17.363
8 3 2 1 16.803
9 3 3 2 14.343
K1 31.554 24.571 24.18
K2 26.362 25.199 24.602
K3 16.17 24.317 25.304
Ｒ 15.384 0.882 1.124
表 7 POD方差分析
Table 7 Analysis of variance for POD
方差
来源
离均差
平方和
自由度 均方差 F p
A 1102.565 2 551.283 199.454 0.000
B 3.711 2 1.856 0.671 0.522
C 5.807 2 2.904 1.051 0.368
误差 57.279 20 2.764
3 结论
莴笋 PPO和 POD最适温度分别为 50℃和 40℃，
最适 pH为 6.0 和 6.5。随温度不断升高，PPO和 POD
活性逐渐下降。莴笋 PPO 的 Km = 5.9 × 10
－3 mol /L，
Vmax = 342.566U /min·g，V = 342.566［S］/(5.9 × 10
－3
+［S］)。POD 的 Km = 6.817 × 10
－4 mol /L，Vmax =
3403.008U /min·g，V = 3403.008［S］/(6.817 × 10 －4 +
［S］)。对 PPO抑制强弱为:VC ＞ L－Cys ＞ NaHSO3 ＞
柠檬酸 ＞ EDTA ＞苯甲酸 ＞琥珀酸。对 POD 抑制强
弱为:EDTA ＞ VC ＞ L－Cys ＞柠檬酸 ＞ NaHSO3 ＞琥珀
酸 ＞苯甲酸。
参考文献
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174
报道。Pichia galeiformis、Kazachstania exigua 是泡菜
中主要的酵母菌，这与 Ho－Won Chang［4］、敖晓琳［5］、
曾骏［17］等的研究结果一致。而从泡菜中分离出
Sporisoriu spp.、Ｒhodotorula spp.未见报道，可能是由于
它们不是泡菜中的主要酵母菌，其出现的时间较短
所致。
2.3.2 酵母菌动态分析 实验分离所得的五株菌在
泡菜发酵过程中进行动态分析，泡制后立即取样分
离到 Y－2、Y－3、Y－4、Y－5 四株菌，24h 后 Y－3、Y－4
迅速消失，同时在老泡菜水发酵泡菜中出现 Y－1，且
出现后随即消失。这可能是因为发酵启动后乳酸菌
为主要的发酵优势菌，其大量产生有机酸使得微生
物体系整体处于酸性环境中，Y－3、Y－4 耐酸性差，因
而死亡消失;在老泡菜水发酵过程中 Y－2 始终可以
检出，这说明 Y－2 不是原料本身携带，而是来自老泡
菜水，且稳定存在于老泡菜水中;自然发酵泡萝卜发
酵第 3d泡菜水中未检测到酵母菌，第 4d Y－5 出现，
直至发酵结束都能检测到 Y－5。对于自然发酵过程
中酵母菌消失又出现的原因目前还不清楚，有待于
进一步的研究。Y－5 又出现说明其耐酸，且可能与
乳酸菌之间形成稳定的相互作用。
3 结论
实验从两种不同发酵方式泡制泡菜发酵过程中
分离到五种酵母菌，分别为清酒假丝酵母菌
(Candida sake)、毕赤酵母属 galeiformis (Pichia
galeiformis)、掷孢酵母(Sporisoriu camicdor)、胶红酵
母(Ｒhodotorula mucilaginosa)、酒酵母(Kazachstania
exigua)。其中毕赤酵母属 galeiformis、酒酵母为传统
发酵泡菜中主要的酵母菌。此外，两种不同发酵方
式发酵过程中出现的酵母菌种类不同，但动态变化
趋势大致相同。
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