全 文 ：洋桔梗离体快繁技术研究
龚明霞 1, 2, 3 ,陈小凤 1, 2, 3 ,陈丽梅 1 ＊,罗 坤 2 ,李昆志 1 ,方锋学 3　(1.云南省昆明理工大学生物工程技术研究中心 ,云南昆
明 650224;2.云南昆明味知农产品开发有限公司 ,云南昆明 650011;3.广西农业科学院蔬菜研究中心 ,广西南宁 530007)
摘要　[目的 ]建立洋桔梗高效的快速繁殖体系 ,为工厂化生产提供可行的操作程序。 [方法]以国外进口的洋桔梗 F1代种子(品种名
称为Polestaryelow)无菌苗的叶片为外植体 ,对不定芽的诱导、单芽增殖、无菌苗生根等进行了研究。 [结果]结果表明:6-BA和 IBA组
合对洋桔梗叶片不定芽的诱导效果较 6-BA和NAA组合好 ,叶片最佳的分化培养基为 MS+ 6-BA0.6mg/L+IBA0.04mg/L, 1个月
内正常芽平均分化数为 8.3;最佳的单芽增殖培养基为MS+6-BA0.8mg/L+NAA0.04mg/L, 1个月内正常芽的增殖倍数为 7.4;无菌苗在
含有IBA0.25mg/L的 1/2MS培养基上 ,生根率、平均每苗的根数均最大。 [结论]该结果为洋桔梗的工厂化生产奠定了基础。
关键词　洋桔梗;种子;叶片;离体培养
中图分类号　S682.1+9　　文献标识码　A　　文章编号　0517-6611(2008)29-12582-03
StudyonRapidPropagationTechnologyofEustomagrandifloruminvitro
GONGMing-xiaetal　(BiotechnologyResearchCenter, KunmingUniversityofScienceandTechnology, Kunming, Yunnan650224)
Abstract　[ Objective] ThisstudyaimedtoestablishafeasiblemanipulationprocedureforrapidpropagationofanewEustomagrandiflorum
speciesinafactory.[ Method] UsingtheasepticseedlingleavesofanewlyimportedEustomagrandiflorumspecies(Polestaryelow)asex-
plants, inductionoftheadventitiousbuds, proliferationofsinglebudsandrootregenerationofseedlingswerestudied.[ Result] Theresults
showedthat, fortheinductionefectoftheadventitiousbudsfromleaves, thecombinationof6-BAandIBAwasbeterthanthatof6-BAand
NAA.ThebestbudinductionmediumforPolestaryelowwasMS+6-BA0.6mg/L+IBA0.04mg/L, andthemeannumberofthenormal
inducedbudswas8.3permonth.ThebestproliferationmediumwasMS+ 6-BA0.8mg/L+NAA0.04mg/L, andtheproliferationmulti-
pleofthenormalbudswas7.4permonth.On1/2MSmediumwithIBA0.25mg/L, boththerootregenerationrateandthemeanrootnum-
beroftheplantletswerehighest.[ Conclulsion] TheseresultsestablishedabasisforfactoryproductionofthenewEustomagrandiflorumspe-
cies, Polestaryelow
Keywords　Eustomagrandiflorum;Seed;Leaf;Invitroculture
基金项目　国家自然科学基金项目(30670163);教育部留学回国人员
科研启动基金(2005-55);云南省中青年学术与技术带头人
培养费(2004PY01-5);昆明理工大学人才培养费;云南昆明
味知农产品开发有限公司资助。
作者简介　龚明霞(1979-),女 ,湖北黄冈人 , 硕士 ,实习研究员 ,从事
植物组织培养方面的研究。 ＊通讯作者 , 教授 , E-mail:chen-
limeikm@yahoo.com.cn。
鸣　　谢　感谢昆明理工大学生物工程技术研究中心的陈红梅和何毅敏同
学在培养基配制和植物组织培养过程中所给予的帮助。
收稿日期　 2008-07-28
　　洋桔梗(Eustomagrandiflorum)是龙胆科 、龙胆属草本花
卉 。洋桔梗原是一种普通的野花 ,经过漫长的演变 ,现已成
为一种妩媚多姿的花卉 ,已经跻身于荷兰花卉拍卖市场十大
切花之列。我国栽培的洋桔梗种源均是进口的 F1代杂交种
子 ,价格十分昂贵 ,种子萌发十分缓慢 ,幼苗期对环境要求严
格 ,且幼苗又有 4 ～ 6个月的停滞期 ,导致洋桔梗种苗生产成
本较高。利用组织培养技术不但可以节约生产成本 ,而且可
以使洋桔梗种苗的生长 、发育避免受到外界环境的影响 。国
内已有用茎段 、侧芽 、种子 、试管苗等进行洋桔梗组织培养的
报道 [ 1-2] ,但以叶片为材料进行组培快繁技术的研究尚不详
细 [ 3-4] ,限制了组培快繁技术在洋桔梗种苗生产上的应用 。
为此 ,笔者以洋桔梗的叶片为材料 ,研究并建立其再生体系 ,
旨在为洋桔梗快速繁殖的工厂化生产提供技术资料 ,以满足
市场对洋桔梗种苗的需求 。
1　材料与方法
1.1　材料　从国外进口的洋桔梗 F1代种子 ,品种名称为
“Polestaryelow”。
1.2　方法　洋桔梗种子的 3种消毒方法分别为 Ⅰ:75%乙醇
浸泡 30s后 ,用 0.1%HgCl2浸泡 6min,无菌水洗涤 5 ～ 6次;
Ⅱ:用稀释 200倍的除菌剂 Sporetexnase浸泡过夜后 ,用 1%
SDS+5% NaClO消毒液浸泡 30min;Ⅲ:75%乙醇浸泡 30 s
后 ,用 1%十二烷基磺酸钠(SDS)+5% NaClO浸泡 30 min。
洋桔梗种子经不同的方法消毒后 ,接种至 MS培养基上进行
无菌萌发 ,获得无菌苗。切取无菌苗从顶端往下数的第 2对
叶 ,由叶中央的主脉纵向切成 2半 ,每半再横向 4等分切开 ,
然后正面朝上接进各种诱导分化培养基中。每瓶培养基接 1
片叶(8小块),每种培养基接种 4瓶。诱导分化出的芽在
MS上壮苗 ,从中挑选具 3 ～ 4对叶的单芽 ,接进各种增殖培
养基 ,每瓶接种 4株。从 MS壮苗培养的苗中 ,选取大小相对
一致的无根苗 ,接种至各种生根培养基中 ,每瓶 5 ～ 6株。叶
片诱导和单芽增殖培养以 MS为基本培养基 ,附加 3%蔗糖;
生根以 1/2MS为基本培养基 ,附加 2%蔗糖 ,另外添加 1%琼
脂 , pH值为 6.1, 温度为 (20 ±1)℃, 光强为 20 ～ 25
μmol/(m2·s),光照时间为 12 h。
2　结果与分析
2.1　不同消毒方法的效果比较　消毒后的洋桔梗种子在 15
d后大部分都能萌发(图 1), 30 d后观察消毒结果 ,如表 1所
示。从表 1可以看出 ,用这 3种消毒方法处理洋桔梗种子 ,
图 1　无菌萌发的种子
Fig.1　Thegerminatingasepticseeds
责任编辑　姜丽　责任校对　傅真治安徽农业科学 , JournalofAnhuiAgri.Sci.2008, 36(29):12582-12584, 12586
表 1　3种消毒方法的消毒效果比较
　　Table1　Comparisonofthedisinfectionefectsofthreesteriliza-
tionmethods
消毒方法
Sterilization
method
播种粒数
Sowing
seeds
萌发粒数
Numberofger-
minatingseeds
萌发率∥%
Germination
rate
污染率∥%
Contamination
rate
Ⅰ 60 1 1.67 0
Ⅱ 60 48 80.00 0
Ⅲ 58 46 79.31 0
　注:萌发率(%)=萌发粒数 /播种粒数 ×100。
　Note:Germinationrate(%)=numberofgerminatingseeds/sowingseeds
×100.
污染率都为 0,说明 3种方法消毒都很彻底。但种子的萌发
率却有所不同 ,用方法Ⅰ消毒 ,洋桔梗种子的萌发率最低 ,为
1.67%,而用方法Ⅱ、Ⅲ消毒 ,种子的萌发率都较高 ,且两者之
间的差异不大。因此综合考虑 ,方法Ⅲ应该是洋桔梗种子消
毒的最经济 、最方便的方法。
2.2　不同种类激素组合对叶片不定芽诱导的影响
2.2.1　6-BA和 NAA组合对叶片不定芽诱导的影响。在
6-BA和 NAA各种组合的诱导分化培养基上 , 10 d后叶片切
口边缘膨大 ,有的形成肉眼可见的黄绿色的愈伤组织 , 19 d
后长出不定芽 ,有的直接从叶片边缘冒出芽点 ,不形成愈伤
组织也没诱导出芽的叶块在统计时已变黄死亡。 30 d后统
计的诱导结果如表 2所示。从表 2可以看出 ,洋桔梗叶片在
含 6-BA0.8mg/L+NAA0.04 mg/L的 MS培养基上正常芽
平均分化数最高 ,为 5.1个 /块 ,但芽诱导率为 56.25%,玻璃
化率为 4.17%。
表 2　6-BA和 NAA组合对叶片不定芽诱导的影响
Table2　Efectsof6-BAandNAAcombinationsontheinductionofadventitiousbudsfromleaves
激素 Hormone∥mg/L
6-BA NAA
芽诱导率∥%Inducingrateofbuds
平均芽分化数∥个 /块Averagenumberofdifferentiatedbuds
正常芽平均分化数∥个/块Averagenumberofnormaldifferentiatedbuds
玻璃化率∥%Rateofvitrificationbuds
0.3 0.04 28.13 1.0 1.0 0
0.3 0.10 9.38 2.0 1.7 16.67
0.6 0.04 62.50 3.5 3.4 1.45
0.6 0.10 75.00 3.0 2.5 18.06
0.8 0.04 56.25 5.3 5.1 4.17
0.8 0.10 78.13 4.9 3.2 35.77
　注:芽诱导率(%)=有芽的叶块数 /总叶块数 ×100;平均芽分化数 =总芽数 /有芽的叶块数;正常芽平均分化数=(总芽数 -玻璃化芽数)/有芽的
叶块数;玻璃化率(%)=玻璃化芽数 /总芽数×100。表 3同。
Note:Inducingrateofbuds(%)=numberofleafpieceswithbuds/totalnumberofleafpieces×100, averagenumberofdiferentiatedbuds=totalbudnum-
ber/numberofleafpieceswithbuds, averagenumberofnormaldiferentiatedbuds=(totalbudnumber-numberofvitrificationbuds)/ numberofleaf
pieceswithbuds, rateofvitrificationbuds(%)=numberofvitrificationbuds/ totalbudnumber×100.ThesameasTable3.
2.2.2　6-BA和 IBA组合对叶片不定芽诱导的影响。在 6-
BA和 IBA组合的培养基上 ,洋桔梗叶块在培养 12 d时变厚
(图 2), 18d时大部分叶片在上 、下横向切口处形成不定芽
(图 3), 30d后统计不定芽诱导结果 ,如表 3所示 ,从表 3可
图 2　诱导过程中的叶块
Fig.2　Leafpiecesduringinduction
以看出 ,在含 6-BA0.6mg/L+IBA0.04mg/L的 MS培养基
上正常芽平均分化数最高 ,为 8.3个 /块 ,芽诱导率为
78.13%,诱导不定芽分化的效果最好 ,且诱导出的不定芽嫩
绿色 ,叶片自然舒展 ,形态端正 ,芽与芽之间较松疏 ,易于分
离接种。
　　无论是在添加 6-BA和 NAA组合还是在添加 6-BA和
IBA组合的培养基上 ,洋桔梗叶片均随着 6-BA浓度的升高
不定芽分化频率逐渐增大 ,平均芽分化数也增大 ,玻璃化程
图 3　从叶块上诱导出的不定芽
Fig.3　Adventitiousbudsinducedfromleafpieces
度也愈严重 ,说明 6-BA具有促进叶片不定芽分化和导致不
定芽玻璃化的双重作用。但是洋桔梗易发生玻璃化 ,即使在
低浓度 6-BA的培养基上 ,也有少量的愈伤组织呈水浸状 ,同
时分化出呈玻璃化的不定芽 。
2.3　6-BA和 NAA组合对单芽增殖的影响　将洋桔梗单芽
在 MS基本培养基上进行壮苗培养后 ,再进行增殖培养 ,培养
30 d后统计和观察增殖结果(图 4)。在各种增殖培养基上
洋桔梗单芽的叶腋处产生新芽 ,且单芽的基部膨大形成愈伤
组织 ,从其上能分化出不定芽 ,有的还能分化出不定根。从
表 4可以看出 ,洋桔梗单芽在含 6-BA0.6 mg/L+NAA0.1
mg/L的 MS培养基上 ,芽增殖倍数最大 ,为 8.7倍 ,但由于
发生较严重的玻璃化 ,最后正常芽增殖倍数为 6.1倍;而在
1258336卷 29期　　　　　　　　　　　　　　　　　　　龚明霞等　洋桔梗离体快繁技术研究
表 3　6-BA和IBA组合对叶片诱导不定芽的影响
Table3　Effectsof6-BAandIBAcombinationsontheinductionofadventitiousbudsfromleaves
激素 Hormone∥mg/L
6-BA IBA
芽诱导率∥%Inducingrateofbuds
平均芽分化数∥个 /块Averagenumberofdifferentiatedbuds
正常芽平均分化数∥个/块Averagenumberofnormaldiferentiatedbuds
玻璃化率∥%Rateofvitrificationbuds
0.3 0.04 56.25 2.3 2.0 12.20
0.3 0.10 59.38 6.5 5.3 18.70
0.6 0.04 78.13 10.1 8.3 18.18
0.6 0.10 75.00 8.2 6.0 26.90
0.8 0.04 78.13 8.5 5.8 31.13
0.8 0.10 87.50 7.8 3.8 51.38
6-BA0.8 mg/L+NAA0.04mg/L的以培养基上的正常芽增
殖倍数最大 ,为 7.4。所以后者为洋桔梗单芽增殖最适宜的
培养基。另外 ,在所有的培养基上 ,洋桔梗都发生不同程度
的玻璃化。
表 4　6-BA和 NAA组合对单芽增殖的影响
　　Table4　Effectsof6-BAandNAAcombinationsonproliferations
ofthesinglebud
激素∥mg/LHormone
6-BA NAA
总增殖倍数∥倍Totalproliferationmultiples
正常芽增殖倍数∥倍Proliferationmultiplesofnormalbuds
玻璃化率∥%Rateofvitrification
0.3 0.04 6.2 5.3 14.29
0.3 0.10 5.0 3.6 28.89
0.6 0.04 6.5 4.9 24.36
0.6 0.10 8.7 6.1 29.49
0.8 0.04 8.3 7.4 10.61
0.8 0.10 6.2 4.4 28.57
　注:总增殖倍数=增殖后的总芽数/增殖前总芽数;正常芽增殖倍数 =
(增殖后总芽数 -玻璃化芽数)/增殖前总芽数。
　Note:Totalproliferationmultiples=numberoftotalbudsafterprolifera-
tion/numberoftotalbudsbeforeproliferation, proliferationmulti-
pleofnormalbuds=(numberoftotalbudsafterproliferation-
numberofvitrificationbuds)/numberoftotalbudsbeforeprolifera-
tion.
图 4　增殖中的单芽
Fig.4　Singlebudsduringproliferation
2.4　IBA和 NAA组合对无菌苗生根的影响　将洋桔梗无
根植株接进 6种生根培养基中 , 8d后都能生根 ,培养 20 d后
最长的根达 1 cm(图 5),统计生根结果如表 5所示。从表 5
可以看出 ,幼苗在不含激素的 1/2 MS培养基(对照)上能生
根 ,但生根率低 ,根数量少。在含 IBA0.25 mg/L的 1/2 MS
培养基上 ,洋桔梗的生根效果最好 ,生根率最高 ,为 70.83%,
平均每苗的根数为 5.40根 ,且根黄绿色 ,根长而粗壮 ,侧根
的数量多 ,而对照的根则细长 ,说明 IBA0.25mg/L是洋桔梗
较适宜的生根培养基。
表 5　培养基对无菌苗生根的影响
　　Table5　Effectsofculturemediumsonrootingoftheasepticseed-
ling
激素Hormone∥mg/L
IBA NAA
生根率∥%
Rootingrate
平均根数∥条/株
Averagenumberofroots
0 0 41.67 3.4
0.25 0 89.50 5.4
0.25 0.08 56.67 5.8
0.50 0 62.50 3.8
0.50 0.08 48.00 3.8
1.00 0.08 65.00 3.8
1.00 0.08 52.00 3.6
　注:生根率(%)=生根苗数 /无菌苗总数 ×100;平均根数 =总根数 /
生根苗数。
　Note:Rootingrate(%)=rootingseedlings/totalnumberofasepticseed-
lings×100;averagenumberofroots=numberoftotalroots/ roo-
tingseedlings.
图 5　生根的无菌苗
Fig.5　Rootingasepticseedlings
2.5　试管苗的移栽结果　将带 5 ～ 6片叶的生根试管苗取
出培养瓶 ,洗净基部的培养基 ,移栽至腐殖土∶珍珠岩 =1∶1
的基质中 ,用塑料薄膜覆盖 1周左右 ,然后逐渐揭去薄膜 ,定
期肥水管理 ,长势良好 ,成活率可达 95%以上 。
3　结论与讨论
以洋桔梗种子无菌苗叶片为材料建立的再生体系 ,由于
取材范围广泛且方便 ,繁殖系数大大提高 ,是洋桔梗工厂化
快速繁殖的有效途径。洋桔梗叶片不定芽的诱导与细胞分
裂素和生长素的种类 、浓度及两者之间的配比有关。该研究
表明 , 6-BA与 IBA组合对叶片不定芽的诱导效果优于 6-BA
与 NAA组合 ,这与毛元荣等 [ 4]的研究结果一致 。由于洋桔
(下转第 12586页)
12584 　　　　　　　　　　安徽农业科学　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　2008年
图 2　PG和 IBA对钙果生根的影响
Fig.2　EfectsofPGandIBAontherootingofC.humilis
图 3　钙果不定芽生根情况
Fig.3　AdventitiousbudrootingofC.humilis
2.3　PG、IBA和 NAA互作对钙果生根的影响　利用 5.0
mg/L的 PG,再添加不同浓度的 IBA和 NAA,钙果的生根率
较没有添加 PG时明显提高 ,以 1/2 MS+PG5.0mg/L+IBA
1.5 mg/L+NAA0.05 mg/L培养基生根率最高 ,为 87.5%
(图 4),但与不添加 NAA的培养基相比 ,生根苗基部愈伤组
织较多 ,根系基部偶有肿胀现象 。
3　结论与讨论
有关钙果生根的报道均利用 IBA或 NAA诱导。国外利
用 1/2MS固体培养基添加不同浓度的 IBA或 NAA,诱导不
同品种欧李的生根率最高 ,可达 88.0%[ 5-6 , 8] 。王德政等利
用 2/3MS+IAA0.5 mg/L诱导欧李的生根率为 72.0%[ 9] ;
张志勇等利用 1/2MS+IBA1.0mg/L诱导钙果的生根率为
89.3%[ 3] 。孙新政等研究发现 , 1/2MS+IBA1.0mg/L+KT
0.02 mg/L培养基可使钙果 4号的生根率达 100.0%[ 4] 。笔
者利用 1 /2MS培养基添加不同浓度的IBA或NAA均未获
注:各处理均加入PG5.0mg/L。
Note:PG5.0mg/Lwasaddedintoeachtreatment.
图 4　PG、IBA和 NAA对钙果生根的影响
Fig.4　EfectsofPG,IBAandNAAontherootingofC.humi-
lis
得理想的生根效果 ,可能与品种有关 [10] 。适宜浓度的 PG配
合 IBA和 NAA使用 ,则使钙果的生根率明显增加 ,其中以
1/2MS+PG5.0 mg/L+IBA1.5 mg/L+NAA0.5 mg/L培
养基生根效果最好。
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(上接第 12584页)
梗莲座化产生的内在机制到目前还没有弄清楚 ,从已经发生
莲座化的植株叶片再生出来的组织苗是否能解除莲座化有
待于进一步研究。在洋桔梗的组培快繁技术研究中 ,最主要
的问题是再生芽的玻璃化。从该试验结果中分析其主要原
因是洋桔梗对培养基中的 6-BA太敏感 ,即使是在很低浓度
的 6-BA培养基上 ,也有少量玻璃化苗的出现 ,这与达克东
等 [ 5]的研究结果相似;其次是光照强度不够 ,通过增强自然
光照可以减轻玻璃化现象 。另外 ,在洋桔梗的组织培养研究
中还发现 ,洋桔梗再生植株常出现叶片形态的变异 ,且玻璃
化植株较正常植株更易发生这种变异 ,这也可能与培养基中
的 6-BA浓度有关。所以要实现洋桔梗组培苗的工厂化生
产 ,还有许多实际的问题需要解决 。
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12586 　　　　　　　　　　安徽农业科学　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　2008年