全 文 ：书ｈｔｔｐ：／／ＸＢＹＺ．ｃｂｐｔ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ
·中药及天然药物·
响应面法优化超声提取灯心草中去氢厄弗酚的工艺
付　茜，王勤辉，孙　璐，江美芳，黄建梅＊（北京中医药大学中药学院，北京　１００１０２）
摘要：目的　以甲醇为提取溶剂，用超声法从灯心草中提取去氢厄弗酚。方法　以单因素实验为基础，分别考察超声提取时间、
超声提取功率、甲醇体积分数对去氢厄弗酚提取率的影响，确定各因素的适宜水平。在此基础上，利用Ｂｏｘ－ｂｅｈｎｋｅｎ中心组合设
计法设计响应面分析甲醇体积分数、超声时间和超声功率３个因素对去氢厄弗酚提取率的影响，建立二次回归方程，分析最佳提
取工艺。结果　灯心草中去氢厄弗酚超声提取的最佳工艺为：甲醇体积分数为８０．４％，超声时间为４０ｍｉｎ，超声功率为４０％Ｐ
（Ｐ＝４００Ｗ），在此条件下，去氢厄弗酚提取量达到１．００３　０ｍｇ·ｇ－１。结论　Ｂｏｘ－ｂｅｈｎｋｅｎ设计结合响应面分析法操作简单，可
以更好地对灯心草中去氢厄弗酚的超声提取工艺进行优化。
关键词：灯心草；去氢厄弗酚；响应面分析；超声提取
ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００４－２４０７．２０１５．０４．００１
中图分类号：Ｒ２８４　　　文献标志码：Ａ　　　文章编号：１００４－２４０７（２０１５）０４－０３３１－０４
Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ－ａｓｓｉｓｔｅｄ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　ｄｅｈｙｄｒｏｅｆｆｕｓｏｌ　ｆｒｏｍＪｕｎｃｕｓ　ｅｆ－
ｆｕｓｕｓ　ｂｙ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｓｕｒｆａｃｅ　ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ
ＦＵ　Ｑｉａｎ，ＷＡＮＧ　Ｑｉｎｈｕｉ，ＳＵＮ　Ｌｕ，ＪＩＡＮＧ　Ｍｅｉｆａｎｇ，ＨＵＡＮＧ　Ｊｉａｎｍｅｉ＊（Ｓｃｈｏｏｌ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｂｅｉｊｉｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，
Ｂｅｉｊｉｎｇ　１００１０２，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ｔｈｅ　ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ－ａｓｓｉｓｔｅｄ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　ｄｅｈｙｄｒｏｅｆｆｕｓｏｌ　ｆｒｏｍＪｕｎｃｕｓ　ｅｆｆｕｓｕｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｔｈｅ
ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｍｅｔｈａｎｏｌ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｔｉｍｅ，ａｎｄ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｐｏｗｅｒ　ｗｅｒｅ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ．Ａ　１７－ｒｕｎ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｓｕｒｆａｃｅ　ｄｅｓｉｇｎ　ｉｎ－
ｖｏｌｖｉｎｇ　ｔｈｒｅｅ　ｆａｃｔｏｒｓ　ａｔ　ｔｈｒｅｅ　ｌｅｖｅｌｓ　ｗａｓ　ｇｅｎｅｒａｔｅｄ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｄｅｓｉｇｎ－ｅｘｐｅｒｔ　ｓｏｆｔｗａｒｅ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｄａｔａ　ｏｂｔａｉｎｅｄ　ｗｅｒｅ　ｓｕｂｊｅｃｔｅｄ
ｔｏ　ｑｕａｄｒａｔｉｃ　ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎａｌｙｓｉｓ，ａｎｄ　ｔｏ　ｃｒｅａｔｅ　ａ　ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ　ｍｏｄｅｌ　ｄｅｓｃｒｉｂｉｎｇ　ｔｈｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｅｆｆｕｓｏｌ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍａｌ
ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ－ａｓｓｉｓｔｅｄ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｗｅｒｅ　ａｓ　ｆｏｌｏｗｓ：ｍｅｔｈａｎｏｌ　ｖｏｌｕｍｅ　ｆｒａｃｔｉｏｎ　８０．４％ａｎｄ　ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ　ｐｏｗｅｒ　４０％Ｐ（Ｐ＝４００Ｗ）ｆｏｒ
４０ｍｉｎ．Ｕｎｄｅｒ　ｔｈｅｓｅ　ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，ｔｈｅ　ｙｉｅｌｄ　ｏｆ　ｄｅｈｙｄｒｏｅｆｆｕｓｏｌ　ｗａｓ　１．００３　０ｍｇ·ｇ－１．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｔｈｅ　Ｂｏｘ－ｂｅｈｎｋｅｎ　ｄｅｓｉｇｎ
ａｎｄ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｓｕｒｆａｃｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｃａｎ　ｏｐｔｉｍｉｚｅ　ｔｈｅ　ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ－ａｓｓｉｓｔｅｄ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｄｅｈｙｄｒｏｅｆｆｕｓｏｌ　ｆｒｏｍＪｕｎｃｕｓ　ｅｆｆｕｓｕｓ　ｅａｓｉｌｙ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｊｕｎｃｕｓ　ｅｆｆｕｓｕｓ；ｄｅｈｙｄｒｏｅｆｆｕｓｏｌ；ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｓｕｒｆａｃｅ　ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ；ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ　ａｓｓｉｓｔｅｄ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ
基金项目：国家自然科学基金资助项目（８１１７３５４１）
作者简介：付茜，女，硕士研究生
＊通信作者：黄建梅，女，教授，博士生导师
　　灯心草（Ｊｕｎｃｕｓ　ｅｆｆｕｓｕｓ　Ｌ．）为灯心草科灯心草
属多年生草本植物，入药部位为干燥茎髓，临床主要
用于治疗因心火所致的心烦失眠、尿少涩痛、口舌生
疮［１－２］。我国灯心草资源十分丰富，国内外对其成分
研究也较为透彻，菲类、黄酮类、三萜类和甘油酯类为
其主要化学成分［３－９］。课题组前期研究发现：不同产
地灯心草中化学成分相似度很高，且菲类成分为其最
主要成分［１０］；同时利用成分敲除技术实验证实：菲类
成分是灯心草中的抗焦虑活性物质［１１］，其中去氢厄
弗酚含量最高，为清心除烦的物质基础之一［１２－１３］。而
目前对灯心草中菲类化合物的提取工艺尚未报道，有
必要对其提取工艺进行研究。本文先进行单因素实
验考察，后采用响应面中心组合方法设计３因素３水
平实验，优化灯心草中去氢厄弗酚的超声提取条件，
为灯心草中菲类成分的高效提取提供理论依据，也为
灯心草的临床前研究奠定基础。
１　仪器与试药
１．１　仪器　岛津ＬＣ－２０Ａ型高效液相色谱仪（ＳＰＤ－
２０Ａ检测器，日本岛津公司）；安捷伦 ＨＣ－Ｃ１８色谱柱
（２５０ｍｍ×４．６ｍｍ，５μｍ）；ＫＱ３２００ＤＥ型数控超声
提取器（昆山市超声仪器公司）；ＢＬ－１００多功能高速
小型粉碎机（浙江永康五金公司）；ＣＰＡ２２５Ｄ型Ｓａｒ－
ｔｏｒｉｕｓ精密电子天平（德国赛多利斯公司）。
１．２　试药　去氢厄弗酚对照品（实验室自制，质量分
数为９８．０％ ）；液相用甲醇为色谱纯（Ｆｉｓｈｅｒ公司），
水为娃哈哈纯净水；超声提取用甲醇为分析纯（北京
化工厂）；灯心草髓部采购于江西抚州。
２　方法
２．１　去氢厄弗酚的测定方法
２．１．１　色谱条件　采用课题组前期段琼等［１４］的色谱
条件：Ａｇｉｌｅｎｔ　ＨＣ－Ｃ１８色谱柱（２５０ｍｍ×４．６ｍｍ，５μｍ）；
流动相为甲醇－水（６５∶３５）；流速为１．０ｍＬ·ｍｉｎ－１；柱
温２３℃；检测波长为２７０ｎｍ；进样量为１０μＬ。
２．１．２　对照品溶液的制备　精密称取去氢厄弗酚对
照品２５．００ｍｇ，加适量甲醇使其溶解，转移至２５０ｍＬ
量瓶中，用甲醇定容得１００ｍｇ·Ｌ－１的对照品溶液。
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２．１．３　样品溶液的制备　取干燥灯心草髓部，粉碎
后过６０目筛。精确称取０．２０ｇ粉末，精密加入２０
ｍＬ体积分数８０％甲醇溶液，超声提取（超声功率为
６０％Ｐ）３０ｍｉｎ，静置放冷至室温，用体积分数８０％甲
醇溶液补足损失的质量，摇匀，用０．４５μｍ滤膜过滤，
即得样品溶液。
２．１．４　线性关系考察　分别精密量取配制好的去氢
厄弗酚对照品溶液０．１，０．２５，０．５，１．５，２．５和１０．０
ｍＬ，置于１０ｍＬ量瓶中，定容稀释至刻度，得１．０，
２．５，５．０，１５．０，２５．０和１００．０μｇ·ｍＬ
－１的６份待测
溶液。按照上述色谱条件，分别进样测定，以去氢厄
弗酚对照品量为横坐标、峰面积为纵坐标进行回归，
得到标准曲线：Ｙ＝８４　７７３Ｘ＋１８　４８３（ｒ＝０．９９９　９），表
明去氢厄弗酚的质量浓度在１．００～１００．００μｇ·ｍＬ
－１
范围内，线性关系良好。
２．２　单因素实验优化去氢厄弗酚的提取条件　采用
２．１项下的方法，固定其他影响因素不变，以去氢厄弗
酚的提取率为指标，对甲醇体积分数、超声提取时间、
超声提取功率３个因素在一定范围内分别进行考察。
２．３　响应面法优化灯心草中去氢厄弗酚的提取工艺
　本实验利用Ｄｅｓｉｇｎ－ｅｘｐｅｒｔ　Ｖ８．０．６．１软件，以中心
组合设计原理来设计响应面实验。先以单因素实验
结果为依据，在一定范围内选取甲醇体积分数、超声
时间和超声功率３个因素作为实验因素进行考察，再
以去氢厄弗酚提取率为响应值，由程序设计响应面实
验，实验水平和因素见表１。
表１　响应面－中心组合因素水平表
Ｔａｂ．１Ｆａｃｔｏｒｓ　ａｎｄ　ｌｅｖｅｌｓ　ｏｆ　Ｂｏｘ－ｂｅｈｎｋｅｎ
因素
水平
－１　 ０　 １
Ａ，甲醇体积分数／％ ５０　 ７０　 ９０
Ｂ，超声时间／ｍｉｎ　 １０　 ２５　 ４０
Ｃ，超声功率／％Ｐ （Ｐ＝４００Ｗ） ４０　 ６０　 ８０
３　结果
３．１　单因素实验
３．１．１　甲醇体积分数对去氢厄弗酚提取率的影响　
每次准确称取灯心草０．２０ｇ，分别选择甲醇体积分数
５０％，６０％，７０％，８０％和９０％进行实验，发现灯心草
中去氢厄弗酚的提取量随着甲醇体积分数的增加而
相应增加，但当甲醇体积分数达到７０％时，去氢厄弗
酚的量达到最大，且趋于稳定。当甲醇体积分数达到
９０％时，去氢厄弗酚的量略微下降，可能是与去氢厄弗酚
的极性大小有关。故选定甲醇的体积分数为７０％左右。
３．１．２　超声提取时间对去氢厄弗酚提取率的影响　
每次准确称取灯心草０．２０ｇ，分别选择超声时间１０，
２０，３０，４０和５０ｍｉｎ进行实验，结果随着超声提取时
间的增加，去氢厄弗酚的提取量会增加，当达到
３０ｍｉｎ时，其含量最高，之后，随着超声时间的增加，
去氢厄弗酚提取量会稍有减少。可能是由于超声时
间过长，造成了目标成分的破坏。故选定超声提取时
间在３０ｍｉｎ左右。
３．１．３　超声提取功率对去氢厄弗酚提取率的影响　
每次准确称取灯心草０．２０ｇ，分别选择超声提取功率
４０％Ｐ，５０％Ｐ，６０％Ｐ，７０％Ｐ和８０％Ｐ（Ｐ＝４００Ｗ）
进行实验，结果去氢厄弗酚的量随着超声功率的增大
而稍有增加，到６０％Ｐ时，提取量达到最大。之后，随
着超声功率的增加，去氢厄弗酚的提取量会减少，可能
是由于超声功率过大，造成了目标成分去氢厄弗酚的
破坏。故选择超声功率在６０％Ｐ左右比较适合。
３．２　响应面法优化去氢厄弗酚的超声提取条件　响应
面－中心组合实验设计的实验具体方案和结果见表２。
表２　响应面－中心组合设计方案与结果
Ｔａｂ．２Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｄｅｓｉｇｎｓ　ａｎｄ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　Ｂｏｘ－ｂｅｈｎｋｅｎ
实验
序号
甲醇体积
分数／％
超声时间
／ｍｉｎ
超声功率／％
Ｐ（Ｐ＝４００Ｗ）
提取量
／ｍｇ·ｇ－１
１　 ７０　 １０　 ４０　 ０．９１４　２
２　 ７０　 ２５　 ６０　 ０．８９８　５
３　 ７０　 ２５　 ６０　 ０．９１１　９
４　 ７０　 ４０　 ８０　 ０．９３５　２
５　 ７０　 １０　 ８０　 ０．９２４　５
６　 ５０　 ２５　 ４０　 ０．５９２　１
７　 ５０　 １０　 ６０　 ０．５０２　５
８　 ５０　 ４０　 ６０　 ０．５８３　６
９　 ７０　 ４０　 ４０　 ０．９５６　０
１０　 ９０　 １０　 ６０　 ０．９４８　０
１１　 ７０　 ２５　 ６０　 ０．９１７　８
１２　 ７０　 ２５　 ６０　 ０．９１０　７
１３　 ７０　 ２５　 ６０　 ０．９２０　２
１４　 ９０　 ２５　 ８０　 ０．９６０　０
１５　 ９０　 ４０　 ６０　 ０．９５６　３
１６　 ９０　 ２５　 ４０　 ０．９５４　０
１７　 ５０　 ２５　 ８０　 ０．５６６　２
　　运用响应面法分析上述所得的实验结果，可计算
得到以去氢厄弗酚提取量为响应值的回归方程：
Ｙ＝０．９１＋０．２０Ａ＋０．０１８Ｂ－３．８４×１０－３　Ｃ－０．０１８
ＡＢ＋７．８６×１０－３　ＡＣ－７．７９×１０－３　ＢＣ－０．１２　Ａ２＋
１．５０×１０－４　Ｂ２＋０．０２１Ｃ２
式中：Ｙ 表示去氢厄弗酚提取量（ｍｇ·ｇ－１），Ａ
表示甲醇体积分数，Ｂ 表示超声时间，Ｃ 表示超声
功率。
回归统计得到分析结果，见表３。由表３可知，以
去氢厄弗酚的提取量为响应指标时，模型Ｐ＜０．０００　１，
模型相关系数ｒ＝０．９９７　４，表明该二次方程模型高度
显著，实验设计可靠。失拟项值为０．１４６　４，即方程模
型失拟不显著，说明一些未知因素对提取实验的影响
很小。同时，可以得知各个因素对去氢厄弗酚提取率
由大到小的影响依次为：甲醇体积分数、超声时间、超
声功率，其中对提取率影响最显著的是甲醇体积分
２３３ 西北药学杂志　２０１５年７月　第３０卷　第４期
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数。方差分析的结果表明，方程的总模型、甲醇体积
分数（Ａ）及二次项对去氢厄弗酚提取率的影响极其
显著；超声时间（Ｂ）及甲醇体积分数与超声时间的相
互作用（ＡＢ）对去氢厄弗酚提取率影响达到显著水
平，而交互项ＡＣ和ＢＣ对去氢厄弗酚提取率的影响
不显著。各因素间交互作用的响应面图见图１。
表３　响应面法对去氢厄弗酚提取量的方差分析结果
Ｔａｂ．３Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　ｍｅａｎ　ｓｑｕａｒｅ　ｄｅｖｉａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ　ｄｅｈｙｄｒｏｅｆｆｕｓｏｌ
项目 平方和 自由度 均方差 Ｆ值 Ｐ值 显著性
模型 ０．４３　 ９　 ０．０４８　 ３４６．７５ ＜０．０００　１ 高度显著
Ａ　 ０．３１　 １　 ０．３１０　 ２　２５３．５０ ＜０．０００　１ 高度显著
Ｂ　 ２．５１５Ｅ－００３　 １　 ２．５１５Ｅ－００３　 １８．３１　 ０．００３　７ 显著
Ｃ　 １．１８０Ｅ－００４　 １　 １．１８０Ｅ－００４　 ０．８６　 ０．３８４　８
ＡＢ　 １．３２１Ｅ－００３　 １　 １．３２１Ｅ－００３　 ９．６２　 ０．０１７　３ 显著
ＡＣ　 ２．４６９Ｅ－００４　 １　 ２．４６９Ｅ－００４　 １．８０　 ０．２２１　８
ＢＣ　 ２．４２５Ｅ－００４　 １　 ２．４２５Ｅ－００４　 １．７７　 ０．２２５　６
Ａ２　 ０．１１　 １　 ０．１１　 ８２８．６４ ＜０．０００　１ 高度显著
Ｂ２　 ９．４５６Ｅ－００８　 １　 ９．４５６Ｅ－００８　 ６．８８７Ｅ－００４　 ０．９７９　８
Ｃ２　 １．７７３Ｅ－００３　 １　 １．７７３Ｅ－００３　 １２．９１　 ０．００８　８ 显著
失拟项 ６．７７３Ｅ－００４　 ３　 ２．２５８Ｅ－００４　 ３．１８　 ０．１４６　４ 不显著
　注：Ｐ＜０．０５为显著，Ｐ＜０．０１为高度显著
　　
图１　两因素交互作用对去氢厄弗酚提取量影响的响应面图
Ａ．甲醇体积分数与超声时间；Ｂ．甲醇体积分数与超声功率；
Ｃ．超声时间与超声功率
Ｆｉｇ．１Ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｓｕｒｆａｃｅ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｒａｔｅ
Ａ．ｍｅｔｈａｎｏｌ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ　ｔｉｍｅ；Ｂ．ｍｅｔｈａｎｏｌ
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ　ｐｏｗｅｒ；Ｃ．ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ　ｔｉｍｅ　ａｎｄ　ｕｌ－
ｔｒａｓｏｎｉｃ　ｐｏｗｅｒ
　　综合以上响应面数据分析，Ｄｅｓｉｇｎ－ｅｘｐｅｒｔ程序
可以预测出对灯心草髓部去氢厄弗酚提取的最优化
工艺为：甲醇提取的体积分数为８０．４％，超声４０
ｍｉｎ，超声功率为４０％Ｐ（Ｐ＝４００Ｗ），在此最佳条件
下，去氢厄弗酚的提取量可达到１．００６　２ｍｇ·ｇ－１。
３．３　验证实验　根据响应面优化后的预测条件，即
在甲醇的体积分数为８０．４％，超声４０ｍｉｎ，超声功率
为４０％Ｐ（Ｐ＝４００Ｗ）条件下，得到平行实验３次的
结果，其平均值为１．００３　０ｍｇ·ｇ－１，而软件模型对
去氢 厄 弗 酚 提 取 量 的 预 测 最 佳 值 为 １．００６　２
ｍｇ·ｇ－１，两者误差仅为０．３２％，两者十分吻合，说明
建立的模型可行。同时，去氢厄弗酚的提取率与单因
素实验结果比较，得率较高。
４　讨论
去氢厄弗酚是灯心草清心除烦的物质基础之一，
有必要对其进行快速、有效地提取，本实验研究了超
声提取灯心草中去氢厄弗酚的工艺，响应面法优化条
件结果表明，甲醇体积分数、超声时间对去氢厄弗酚
提取率有显著影响，同时可以发现，甲醇体积分数起
了决定性的作用，可以考虑固定甲醇的体积分数，使
其他影响因素可以在一定范围内变化，从而有效地提
取去氢厄弗酚，为灯心草的工业化大生产提供依据。
超声提取具有提取率高、适用性广、耗能少等特
点［１５］。本文的研究结果也证实，Ｂｏｘ－ｂｅｈｎｋｅｎ响应
面法能快速有效地获得更加优化的提取条件，提供准
确的实验数据，方便简单。该法尤其适合于探索性的
实验研究，能更为准确地指明实验方向［１６］，可为中药
活性成分的产业化发展提供理论依据，有较好的应用
前景。
３３３西北药学杂志　２０１５年７月　第３０卷　第４期
ｈｔｔｐ：／／ＸＢＹＺ．ｃｂｐｔ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ
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（收稿日期：２０１５－０３－１０）
微量法在蚯蚓粗提物蛋白质量浓度和蚓激酶活性测定中的应用
范世光，顾鹏毅，赵蔓嘉，汪佳慧，张潇木，刘国栋，梁再赋，孙晋民＊（中国医科大学实验技术中心一部暨国家中医药管
理局中药生物工程实验室Ⅲ级，沈阳　１１０００１）
摘要：目的　探讨微孔板酶联比色测定法在蚯蚓粗提物蛋白质量浓度、蚓激酶活性测定中的应用。方法　蛋白质量浓度采用改
良Ｌｏｗｒｙ法，蚓激酶活性采用ＴＡＭＥ法，分别使用常量体积和微量体积，用紫外－可见分光光度计和酶标检测仪进行测量，用
ＳＰＳＳ软件进行直线拟合，做出标准曲线，比较测量结果。结果　标准曲线截距ＲＳＤ＜５％，用标准曲线检测ＢＳＡ的结果显示，
２种质量浓度、２种方法的回收率分别为９９．６％，９４．６％，１０１．２％和９６．５％，ＲＳＤ分别为３．３０％，５．０５％，３．３６％和２．５９％，经
ｔ检验３种检测结果差异无统计学意义，可以认为２种检测方法测得的数据一致。结论　可以采用微量法进行蚯蚓粗提物蛋白
质量浓度、蚓激酶活性的测定。
关键词：蛋白质量浓度；蚓激酶活性；微量法；常量法
ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００４－２４０７．２０１５．０４．００２
中图分类号：Ｒ２８４　　　文献标志码：Ａ　　　文章编号：１００４－２４０７（２０１５）０４－０３３４－０４
Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｒａｃｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｅａｒｔｈｗｏｒｍ　ｃｒｕｄｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｃｏｎ－
ｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｅａｒｔｈｗｏｒｍ　ｋｉｎａｓｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ
ＦＡＮ　Ｓｈｉｇｕａｎｇ，ＧＵ　Ｐｅｎｇｙｉ，ＺＨＡＯ　Ｍａｎｊｉａ，ＷＡＮＧ　Ｊｉａｈｕｉ，ＺＨＡＮＧ　Ｘｉａｏｍｕ，ＬＩＵ　Ｇｕｏｄｏｎｇ，ＬＩＡＮＧ　Ｚａｉｆｕ，ＳＵＮ　Ｊｉｎｍｉｎ＊
（Ｔｈｅ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｏｆ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｃｈｉｎａ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｔａｔｅ　Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ
Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｇｒａｄｅ Ⅲ，Ｓｈｅｎｙａｎｇ　１１０００１，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ａｎｄ　ｃｏｍｐａｒｅ　ｔｈｅ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ　ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ　ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ　ａｓｓａｙ　ｉｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａ－
ｔｉｏｎ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｋｉｎａｓｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｉｎ　ｅａｒｔｈｗｏｒｍ　ｃｒｕｄｅ　ｅｘｔｒａｃｔｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｔｈｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｗａｓ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ　ｂｙ　ｕ－
ｓｉｎｇ　ｔｈｅ　ｉｍｐｒｏｖｅｄ　Ｌｏｗｒｙ　ｍｅｔｈｏｄ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｋｉｎａｓｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｗａｓ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ　ｂｙ　ｕｓｉｎｇ　ｔｈｅ　ＴＡＭＥ　ｍｅｔｈｏｄ．Ｔｈｅ　ｃｏｎｓｔａｎｔ　ｖｏｌｕｍｅ　ａｎｄ
ｍｉｃｒｏ　ｖｏｌｕｍｅ　ｗｅｒｅ　ｔｅｓｔｅｄ　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｉｎ　ＵＶ－ＶＩＳ　ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ　ｏｒ　ｅｎｚｙｍｅ　ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ　ｓｔａｎｄａｒｄ　ｄｅｔｅｃｔｏｒ．ＳＰＳＳ　ｓｏｆｔｗａｒｅ
４３３ 西北药学杂志　２０１５年７月　第３０卷　第４期