全 文 ：　　收稿日期: 2000-06-12
用 RAPD分子标记探讨倭竹族的属间关系
杨光耀
(江西农业大学林学院 ,南昌 , 330045)　　　
赵奇僧
(南京林业大学 ,南京 , 210037)
摘　要　采用随机扩增多态性 DNA( RAPD)技术对倭竹族 ( Shibataeeae Nakai emend keng f. )中 8
属 , 即: 倭 竹 属 Shibataea、 刚 竹 属 Phyllostachys、 业 平 竹 属 Semiarundinaria, 短 穗 竹 属
B rachystachyum , 大节竹属 Indosasa ,唐竹属 Sinobambusa, 方竹属 Chimonobambusa ,筇竹属
Qiongzhuea中的 16种进行了分析。选用 20个 10碱基随机引物扩增结果 ,计算属间遗传相似系统 ,
建立 UPGM A聚类图。 分析结果表明:①大节竹属和唐竹属 ,方竹属和筇竹属关系密切 ,这一结果
与形态学研究结果一致 ;②业平竹属和短穗竹属关系较密切 ;③在倭竹族内基于形态研究结果建立
刚竹亚族 Phy llostachydinae Keng f.和倭竹亚族 Shibataeinae或唐竹亚族 Sinobambusinae Z. P.
Wang和倭竹亚族 Shibataeinae Soderst rom & Ellis的观点没有得到 RAPD分析的支持。
关键词　倭竹属 ; RAPD; 属间亲缘关系
倭竹族 ( Shibataeeae Nakai emend Keng f . )包括倭竹属 Shibataea ,刚竹属 Ph yllostachys,
业 平竹 属 Semiarundinaria, 短 穗竹 属 Brachystachyum , 大节 竹属 Indosasa , 唐竹 属
Sinobambusa ,方竹属 Chimonobambusa,筇竹属 Qiongzhuea等 8属。 在地下茎类型、花序类型
和叶解剖特征方面都表明这是一个自然的类群。在散生竹系统分类中本类群争议相对较少 ,但
在短穗竹属的归属 ,方竹属和筇竹属分合 ,以及族内亚族的划分上仍然存在分歧。
本文从倭竹族的 8属中选择了 16种 (竹种名称见表 1) ,利用 RAPD标记研究它们的系统
发育关系 ,目的在为解决本族中形态分类上存的分歧提供新的分子证据。
1　材料与方法
1. 1　材料来源
倭竹族 16种实验材料来源见表 1,凭证标本存于江西农业大学树木标本室 ( JX AU)。
1. 2　植物 DNA提取
DNA采用 CT AB提取法。 取 1. 0克新鲜叶片 ,在液氮中迅速研磨成粉末 ,转入预热的
CT AB提取液中 ,于 65℃水浴中保温 40min。 加入等体积氯仿: 异戊醇 ( 24∶ 1) ,在 4℃下离心
10min( 10 000r /pm )。取上清液 ,加入等体积的异丙醇或 2倍体积的无水乙醇 ,轻轻混匀 ,于
- 20℃下冰冻 2小时。 10℃下离心 10min( 10 000r /pm ) ,弃上清液留沉淀物使其自然风干 ;用
600ul双蒸水充分溶解 ,离心 2～ 5min,将上清液移入干净的 1. 5ml离心管中。加入 300ul饱和
酚和 300ul氯仿:异戊醇 ( 24∶ 1)抽提 ,离心取上清液 ;在上清液中再加氯仿:异戊醇 ( 24∶ 1)抽
提两次 ,离心取上清液 ;加入 1 /10体积的 3M NaAc和 2倍体的无水乙醇 ,轻轻混匀 ,于 - 20℃
冰冻 2小时 ;离心 10min( 10 000r /pm or 12 000r /pm ) ,弃上清液 ,将沉淀物乙醇洗涤后 ,自然
第 20卷　第 2期
2 0 0 1年 4月　　　　　　 竹　子　研　究　汇　刊JO U RNAL O F BAMBOO RESEARCH　　　　　　　
Vol. 20, No. 2
Ap r. 2 0 0 1
表 1　材料来源
Table 1　 The source of material s
竹种名称
Nam es
凭证标本
Vouch er
采集地点
Location
　　　　 1　中华大节竹 Indosasa sinica C. D. Chu& C. S. Ch ao Y01 南林大竹园
2　摆　　　竹 In. shibataeoides McCl. Y02 南林大竹园
3　唐　　　竹 S inobambuse tootsik ( Sieb. ) Makin o Y03 南林大竹园
4　满　山　跑 S . tootsik var. laeta ( McCl. ) Wen Y04 南林大竹园
5　光叶 唐 竹 S . tootsik var. tenu ifol ia ( Koid z. ) S. Suzuki Y05 南林大竹园
6　短　穗　竹 Brachystachyum densi f lorum ( Rend le) Keng Y06 南林大竹园
7　中华业平竹 Sem iarund inaria fastuosa (M tf . ) Makino Y07 南林大竹园
8　业　平　竹 S . sin ica Wen Y08 南林大竹园
9　黄槽 毛 竹 Phyllostachys edul is cv. Luteosulcata Y09 南林大竹园
10　水　　　竹 Ph .heteroclad a Oliver Y10 南林大竹园
11　鹅　毛　竹 Sh ibataea ch inensis Nakai Y11 南林大竹园
12　南平 倭 竹 Sh .nanp ingensis Q. F. Zheng & K. F. Huang Y12 南林大竹园
13　寒　　　竹 Ch imonocambusa m armorea ( Mi t f. ) Makino Y13 南林大竹园
14　方　　　竹 Ch . quadrangular is ( Fenzi) Makino Y14 南林大竹园
15　刺　黑　竹 Ch . neopu rpurea Yi Y15 南林大竹园
16　筇　　　竹 Qiongzhuea tum idinoda Hsu eh& Yi Y16 南林大竹园
　　注:竹种学名依据《中国植物志》第 9卷第 1分册
晾干。 加入 100ul T E溶解 , - 20℃保存。
1. 3　 DNA扩增
本实验采用的扩增仪为 Perkin-Elmen PCR9600。反应条件为 94℃预变性 2min, 94℃变性
30sec, 40℃退火 30sec, 70℃延伸 90sec, 38个循环 , 72℃延伸 7min, 4℃结束扩增。 反应体系为
20ul∶ 10倍反应缓冲液 ( Buffer) 2μl ( 100mM Tris-HCl ( pH8. 3) , 500mM KCl, 20mmol /L
MgCl2 ) , Taq聚合酶 1单位 ( 0. 2μl) , 2μl dN T P(d ATP, d TT P, dCTP, dGT P各为 100μm) , 2μl
引物 ( 0. 5μm) , 2μl模板 DNA( 20ng )。
扩增产物在含有溴化乙锭的 1. 0%琼脂糖凝胶在 1× TBE缓冲液中电泳分离 ,最后在紫
外灯下用 Po laroid摄像系统拍照记录结果。
1. 4　数据处理
RAPD扩增带用 “ 1”表示有 ,用 “ 0”表示无 ,建立数据文件。 RAPD扩增结果 ,运用
Popgen32软件进行统计分析。其中遗传距离 ( GD)根据以下公式计算:
Gdij= { Gdij
2}= x [1- 2xij /2x ]
其中 xij为样品 i, j共有的谱带 ; x为多态性谱带数。任意两样品之间的相似系数则为 ( 1-
Gdij )。根据遗传距离采用 U PGMA( unw eighted pai r g roup method w ith arithmetic mean)法
进行聚类分析 ,构建树系图。
2　结果与讨论
2. 1　结果
在确定的 RAPD扩增方案下 ,在前人的工作基础上选取 32个对竹子具有较好扩增效果
的引物 ,经进一步筛选 ,选出 20个引物具稳定多态性的引物 ,用于扩增反应。 引物购自上海生
2　　　 竹 子 研 究 汇 刊 20卷　
物工程公司 ,长度为 10bp,引物的碱基序列见表 2。
表 2　引物及碱基序列
Table 2　 The p rimers and th ei r s equences
引物
Primers
引物碱基序列 ( 5’ -3’ )
Sequ ences ( 5’ -3’ )
引物
Prim ers
引物碱基序列 ( 5’ -3’ )
Sequences ( 5’ -3’ )
S21 CAGGCCCTTC S71 AAAGCTGCGG
S35 T TCCGAACCC S72 TGTCATCCCC
S40 GTT GCGATCC S78 TGAGTGGGTG
S4 GGACTGGAGT S79 GT TGCCAGCC
S10 CTGCTGGGAC S80 ACTTCGCCAC
S15 GGAGGGTGT T S41 ACCGCGAAGG
S20 GGACCCT TAC S43 GTCGCCGT CA
S61 T TCGAGCCAG S44 T CTGGTGAGG
S69 CTCACCGTCC S50 GG TCT ACACC
S70 TGTCTGGGTG S52 CACCG TATCC
对筛选出的具有多态性的 20个引物分别对倭竹族 16种的 DNA样品进行扩增。 共得到
67个多态性位点 ,平均每引物产生 3. 35个。 计算 8个属间的遗传相似性系数 ,结果见表 3。
表 3　 8个属间的相似性系数
Table 3　 Th e coef fi cient of similari ty am ong 8 genera
No. 1 2 3 4 5 6 7 8
1 *
2 0. 1487 *
3 0. 3656 0. 2511 *
4 0. 2330 0. 2228 0. 3359 *
5 0. 3496 0. 3262 0. 4413 0. 2803 *
6 0. 4019 0. 4355 0. 5177 0. 3082 0. 4414 *
7 0. 3055 0. 3730 0. 7472 0. 4325 0. 5274 0. 4087 *
8 0. 4996 0. 4212 0. 6783 0. 5932 0. 5684 0. 5826 0. 2886 *
　　 notes: 1- Indosasa; 2 - Sinobambusasa; 3- Brachystachyum; 4- Sem iarund inar ia; 5- Phyllostachys; 6- Shibateae; 7-
Chimonobambusa; 8- Qiong zhuea
图 1　由引物 S40扩增产生 RAPD带型 (图上面的数字代表见表 1,M: 1kb Ladder DNA Maker)
Fig. 1　 RAPD profi les generated by p rimer S40( The n umber on top refers to th e
species li sted in Table 1. M: 1kb Ladder DNA Mark er)
3　 2期 杨光辉等　用 RAPD分子标记探讨倭竹族的属间关系 　 　
图 2　根据相似性系数 ,应用 UPGMA法构建的树系图
Fig. 2　 Dend rog ram generated using U PGAM algo ri thm according to simi lari t y coef ficien t
2. 2　讨论
耿伯介 [3 ]依据竹秆中部各节 芽及小花中雄蕊数目将倭竹族分为 刚竹亚族
(Phyllostachydinae Keng f . )和倭竹亚族 ( Shibataeinae)。前者秆中部每节具 2或 3芽 ,雄蕊 3
枚 ,包括 Phyllostachys ,Brachystachyum Sinobambusa, Indosasa等 4属 ;后者秆中部各节具一
芽 ,雄蕊 3～ 6枚 ,包括 Semiarundinaria , Shibataea ,Chimonobambusa , Qiongzhuea等 4属。 王
正平 [ 5]根据花序中假小穗或假小穗丛下有无叶鞘所形成的佛焰状苞片将本族分为 ,无佛焰苞
片的唐竹亚族 Sinobambusinae Z. P. Wang和有佛焰苞片的倭竹亚族 Shibataeinae Soderstrom
& Ellis。 前 者 包 括 Indosasa, Sinobambusa , Chimonobambusa, Qiongzhuea; 后 者 包 括
Semiarundinaria, Brachystachyum , Phyl lostachys , Shibataea。 上述观点未得到 RAPD分析的
支持 ,倭竹族 8个属的聚类结果并没有形成亚族相对应的两个单系类群。
大节竹属和唐竹属的营养器官不易区别。 生殖器官中主要的区别只是小花中雄蕊数目不
同 ,前者为 6雄蕊 ,后者常为 3雄蕊。在形态特征上两属亲缘关系很近 [ 4～ 6, 9, 13]。 RAPD分析结
果与表明这两属关系密切。
短穗竹属曾经被置于散生竹真花序类中 [ 1, 2] ,后经研究其所谓的总状花序是一复合的假花
序 ,这种花序与业平竹属 Sem iarundinaria花序一致 ,王正平等 [4 ]首次提出短穗竹属可并入业
平竹属 ,温太辉 [ 7]将短穗竹属归入业平竹属 ,这一处理得到了一些学者的支持 [10, 12 ]。本分析显
示这两属关系较近。
筇竹属 Qiongzhuea因其花序主轴各节具一大型苞片 ,秆基数节不具根刺 ,笋期春季 ,笋不
为酶的作用变黑等不同于方竹属 Chimonobambusa ,而作为一独立的属 [3, 12, 13 ]。但筇竹属地下茎
类型 ,分枝类型 ,花、果构造等方面与方竹属一致 ,多数学者主张归入方竹属 [8, 10, 11, 14, 15 ]。 RAPD
分析结果表明 ,这两属关系密切。
致谢:本研究承国家林业局南京林业大学林木遗传与基因工程开放实验室提供条件。实验过程中得到该实验室黄敏仁教授、
诸葛强副教授、尹佟明博士 ,竹类研究所丁雨龙教授、师丽华硕士 ,浙江林学院林新春硕士的指导和帮助 ,谨此致谢 .
4　　　 竹 子 研 究 汇 刊 20卷　
参 考 文 献
1　耿以礼 .中国主要禾本植物属种检索素 (附系统名录 ) .北京:科学出版社 , 1957
2　耿以礼 .中国主要植物图说· 禾本科 .北京:科学出版社 , 1959
3　耿伯介等 .中国植物志 9( 1) .北京:科学出版社 , 1996
4　王正平 ,叶光汉 .关于我国散生竹的分类问题 .南京大学学报 (自然科学版 ) , 1980( 1): 283～ 290
5　王正平 .中国竹亚科分类系统之我见 .竹子研究汇刊 , 1997, 16( 4): 1～ 6
6　温太辉 .中国唐竹属的研究及其他 (之一 ) .竹子研究汇刊 , 1982, 1( 2): 6～ 30
7　温太辉 .江南竹类新植物 .竹子研究汇刊 , 1989, 8( 1): 13～ 24
8　温太辉 .关于几个竹亚科分类群的分类问题 .竹子研究汇刊 , 1991, 10( 1) : 11～ 25
9　赵奇僧 ,朱政德 .中国大节竹属的研究 .植物分类学报 , 1983, 21( 1): 60～ 75
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RAPD Study on Intergeneric Relationships in Shibataeeae
Nakai emend Keng f . (Gramineae , Bambusoideae)
Yang Guangyao
( Fores t ry Col leg e, Jiangxi Agricul ture Universi ty, Nanch ang , 330045)
　 Chao Chison
( Nanjing Fores t ry Univ ersi ty, Nanjing, 210037)
Abstract　 Six teen species f rom eight genera o f Shibataeeae N akai emend Keng f . w ere
analy zed using random ampli fied polymo rphic DN A ( RAPD ) markers. Tw enty
decanucleo tide primers of arbi t ra ry sequences were selected for DN A amplification. By
popgen 32 prog ram , Nei s g enetic simi lari ty co ef ficients w ere generated and dendrog ram was
constructed using U PGM A. The resul t show s that: ( 1 ) Indosasa i s clo sely related to
Sinobambusa , andChimonobambusa also close to Qiongzhuea. The resul ts w ere in consistence
w ith that of the ana lysis of mo rpholog y. ( 2) Semiarundinaria and B rachystachyum had closer
rela tionship. ( 3) It is unreasonable to establish the subtribe Phyl lostachydinae keng f . and
Subtribe Shiba taeinae o r Subtribe Sinobambusinae Z. P. W ang and Subtribe Shibataeinae
Soderstrom & Ellis in Tribe Shibataeeae Nakai emend Keng f . .
Key words　Shibataeeae; RAPD; Relationship
5　 2期 杨光辉等　用 RAPD分子标记探讨倭竹族的属间关系