全 文 ：第28卷 , 第11期　 　　　　　　　　　　　光 谱 学 与 光 谱 分 析 Vol.28, No.11 , pp2574-2578
2 0 0 8 年 1 1 月　　　　　　　　　　　 　Spectro scopy and Spectr al Analy sis Novembe r , 2008 　
拉曼光谱研究复方鹿仙草颗粒对 SMMC-7721肝癌细胞的作用
张金彦 , 郭建宇 , 蔡炜颖 , 孙真荣＊
精密光谱科学与技术国家重点实验室(华东师范大学), 华东师范大学物理系 , 上海　200062
摘　要　应用拉曼光谱研究了不同浓度的鹿仙草溶液与肝癌细胞 SMMC-7721 的相互作用 , 通过对药物作
用前后细胞的光谱变化进行分析 , 从而为阐明鹿仙草与肝癌细胞的作用方式提供重要的依据。拉曼光谱显
示 , 加入鹿仙草后 , 细胞的许多峰都发生了变化。归属于磷酸骨架振动的 785和 1 092 cm -1的两个峰强度下
降 , 对应碱基 A 和 G的峰 1 312 和 1 585 cm -1等也有不同程度的降低 , 表明鹿仙草可能插入 DNA 碱基对之
间 , 使 DNA 复制受到抑制 , 导致细胞 DNA 含量下降 , 而且会引起 DNA 单 、 双链的断裂。同时 , 研究还发
现属于蛋白质的振动峰(1 005 , 1 360 , 1 656 cm -1)强度也有不同程度下降 , 说明蛋白质二级结构以及侧链
氨基酸的环境均发生了改变。此外 , 鹿仙草对细胞的作用效果随浓度增加逐步增强。
关键词　拉曼光谱;鹿仙草;肝癌细胞
中图分类号:O657.3　　文献标识码:A　　　DOI:10.3964/ j.issn.1000-0593(2008)11-2574-05
　收稿日期:2007-09-22 , 修订日期:2007-12-28
　基金项目:国家自然科学基金项目(10574046), 国家基础研究重大项目(2006CB806006 , 2006CB921105), 教育部新世纪人才计划项目
(NCET-04-0420), 高等学校博士点基金项目(20050269011)和上海市科委科技启明星计划项目(06QH 14003)资助
　作者简介:张金彦 , 女 , 1982年生 , 华东师范大学物理系硕士研究生　　e-mai l:y s03122038@studen t.ecnu.edu.cn
＊通讯联系人　　e-mai l:z rsun@phy.ecnu.edu.cn
引　言
　　复方鹿仙草颗粒是从古老的“包块方”到黄氏抗癌粉 、仙
九冲剂 、斯库等黄氏系列抗癌药物中筛选出来的配伍最佳 、
疗效最好的治疗原发性肝癌的新药 , 属纯天然植物药。其主
要成分是鹿仙草。鹿仙草(Balanophora S imoensis S. Y.
Chang et Tam)系蛇菰科蛇菰属植物。药效研究发现灌服复
方鹿仙草颗粒对裸鼠人肝癌 SMMC-7721 的生长有明显抑制
作用 , 在组织病理形态上 , 也可观察到给药组肿瘤细胞的变
形 、坏死 , 细胞内出现空泡样变和巨核细胞 、炎细胞浸润。
研究抗癌药物与肿瘤细胞相互作用的方法很多 , 如:
MTT 法 、荧光显微镜 、 电子显微镜 、 流式细胞仪等[ 1-3] 。但
这些传统的生物学方法都只能观测到宏观上药物对细胞的作
用效果 , 如细胞抑制率 、 形态变化 , 并不能从分子学的角度
判断出药物与细胞结合方式和位点 , 以及作用后对细胞内大
分子会产生怎样的影响。拉曼光谱是一种分子振动光谱 , 它
能够识别和区分不同的物质结构 , 当物质的种类 、 数量 、 结
构 、构象及存在状态发生改变的时候 , 在拉曼光谱上会显示
出相应的光谱强度或频率的变化 , 因此成为研究物质分子结
构及变化的重要手段。拉曼光谱技术在测量生物分子时 , 具
有结构信息量大 、操作方便等优点 , 而且水对拉曼光谱影响
很小。随着光谱学及激光技术的发展 , 拉曼越来越广泛地用
于蛋白质 、 核酸等生物大分子的结构研究以及与其它物质的
相互作用上 , 并且开始深入地研究细胞和组织等更复杂的体
系[ 4-8] 。本文通过对细胞拉曼光谱变化进行分析 , 观察鹿仙
草溶液和肝癌细胞的相互作用 , 从而为阐明中药鹿仙草与肝
癌细胞的作用方式提供重要的参考价值。
1　材料和方法
1.1　材料和仪器
SMMC-7721细胞购于上海午立生物技术有限公司 , 复
方鹿仙草颗粒系云南黄家医圈制药有限公司产品 , 实验所用
仪器是法国 Jobin Yvon T64000 型共焦显微拉曼光谱仪。
1.2　细胞培养及处理
取 5 组处于对数生长期的细胞 , 1 组为对照组 , 其余 4
组分别加入不同剂量鹿仙草于培养液中 , 使培养液中鹿仙草
终浓度依次为 0.1 , 0.2 , 0.5 , 1.0 mg·m L-1 , 培养 24 h 后
将细胞消化下来 , 离心弃上清 , 加入 PBS 缓冲液 4 m L 吹散
成细胞悬液 , 再离心 , 重复 2 次 , 以消除培养液影响 , 将离
心后的细胞悬浮在少量缓冲液中 , 滴在玻璃盖玻片上进行拉
曼光谱测量。
1.3　拉曼光谱
拉曼光谱测量用 T64000 型共焦显微拉曼光谱仪 , 使用
液氮冷却的 CCD 作为探测器 , 氪-氩离子激光器作为光源 ,
配备一台光学显微镜。实验条件如下:激发光波长 514.5
nm , 功率 80 mW;测量时间 100 s , 2 次累加 , 扫描范围为
700 ～ 1 800 cm -1 。所得光谱用五次多项式扣除荧光本底后并
光滑 , 以位于 1 450 cm -1位置拉曼峰(C—H 变形振动峰)强
度归一化[ 9] , 最后把所得光谱统计取平均值以减少实验误
差。
2　结果和讨论
　　图 1为实验所得的SMMC-7721肝癌细胞的拉曼光谱 , a
为空白组 , b , c, d , e为鹿仙草作用 24 h 后细胞的拉曼谱 ,
药物浓度分别为 0.1 , 0.2 , 0.5 , 1.0 mg ·m L-1 。图 2 为加
药组与空白组光谱的差谱。图 3 描绘了细胞主要拉曼峰的强
度随药物浓度变化的曲线。拉曼谱主要谱峰的指认如表 1 所
示[ 10-13] 。
Fig.1　Raman spectra of SMMC-7721 liver cancer cells reac-
ting with luxiancao at the different concentrations
a:0;b:0.1;c:0.2;d:0.5;e:1.0 mg·mL -1
　　从图中可以明显看出鹿仙草作用后细胞的拉曼谱与空白
组相比有了较大的变化 , 785 , 1 092 , 1 174 , 1 312 , 1 585 ,
1 656 cm -1等峰强度都有不同程度的下降 , 且随药物浓度的
增大下降趋势更明显。由于拉曼谱线的强度与散射中心的数
Fig.2　Difference spectra of cells reacting
with luxiancao and blank cells
Concen tration of luxiancao is a:0.1;b:0.2;
c:0.5 , d:1.0 mg·mL -1
目成正比 , 谱线强度的变化即意味着散射中心数目的变化 ,
谱线强度降低说明散射中心的数目减少 , 相应谱线所属的基
团和化学键受到了损伤[ 14 , 15] 。
Table 1　Peak assignments for the SMMC-7721
Raman spectrum
峰位
/cm-1
指认
DNA 蛋白质
785 O—P—O str.;U , C , T ring br.
1 004 Sym.ring br.P he
1 092 PO-2 str.
1 126 C—N str.
1 174 C— H in-plane bend T yr
1 312 A CH de f.
1 339 A , G CH de f.
1 360 Trp
1 450 CH de f.
1 585 G , A
1 619 C C Ty r , T rp
1 656 AmideⅠ αhelix
　　DNA 是很多抗癌药物作用的重要靶点 , 它的拉曼峰主
要来自于磷酸骨架基团和 DNA 各种碱基的振动。 1 092
cm -1处的峰归属于 DNA 骨架中磷酸离子 PO-2 的对称伸缩
振动峰 , 它对构象变化不灵敏[13] 。实验结果显示 , 加入药物
后1 092 cm -1峰强度明显降低 , 下降幅度保持在 12%～ 20%
之间 , 随浓度增加降幅变化不大。这个峰的强度已经可以作
为一种判断 DNA 含量的标准[ 9] 。在癌变过程中 , 细胞无限
增殖 , DNA 大量复制 , 导致细胞中的 DNA 含量增加 , 而该
峰强度减小表明加入药物后 DNA 含量减小 , DNA 复制被抑
制。785 cm -1对应 DNA 磷酸二酯(O —P—O)对称伸缩振动 ,
它对构象变化灵敏 , 当 DNA 呈无序状态时它会位移到 790
cm -1附近[ 13] , 而磷酸二酯的损伤则会引起 DNA 单 、双链的
断裂[ 14-17] 。从图 2和图 3可以看出 , 加入药物后 785 cm -1的
峰位并未发生位移 , 但强度有所下降 , 药物浓度为 0.1 和
0.2 mg·m L-1时强度变化不大 , 浓度进一步增大时强度下
降 20%, 浓度为 1.0 mg·m L-1降幅增大到 30%。这说明低
浓度药物对磷酸二酯影响不大 , 当药物浓度高于 0.5 mg ·
m L-1时会影响磷酸二酯振动 , 进而可能造成 DNA 单 、 双链
的断裂。此外 , DNA碱基的谱线在加入药物后发生了很大的
变化 , 加入药物后归属于鸟嘌呤 G、 腺嘌呤 A 振动的谱线
1 312 , 1 339 , 1 585 cm -1有明显下降 , 且随药物浓度增加降
幅逐步增加。对于 1 312 cm-1 , 当药物浓度为 0.1 和 0.2 mg
·m L-1时强度下降 10%左右 , 浓度增至 0.5 mg · mL-1时
强度下降将近 20%, 浓度为 1.0 mg·m L-1降幅达 30%。而
1 339和1 585 cm -1 , 在药物浓度低于 0.5 mg· mL-1时 , 降
幅分别为 4%～ 6%和 16%～ 19%;当浓度增大到 1.0 mg ·
m L-1时降幅增大 , 分别为 26%和 32%。过去研究已经证实
药物分子是通过插入 、 沟槽键联 、 共价键联三种基本方式与
DNA 相作用 , 药物与 DNA 的插入作用会引起拉曼光谱的减
色性 , 即谱峰强度的下降[ 18] 。实验结果所示的碱基拉曼峰的
2575第 11 期　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　光谱学与光谱分析
Fig.3　Raman bands of cells varied with the increase in luxiancao concentration
大幅度下降 , 说明药物可能插入到 DNA 碱基对之间 , 从而
影响 DNA 复制。
　　蛋白质的拉曼谱峰可以得到关于其主链构象 、 二级结构
和侧链氨基酸构象变化的信息。酰胺 Ⅰ带拉曼峰位于 1 656
cm -1 , 归属为α螺旋结构 , 表明细胞蛋白质以α螺旋结构为
主。α螺旋结构的另一个判据是 900 ～ 945 cm -1附近的骨架
C—C 伸缩振动的谱线 , 它是构象灵敏的 , β 折叠在此区域无
谱线[ 13] 。从图 1 可以看到在 938 cm-1处有谱峰 , 与上述判断
2576 光谱学与光谱分析　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 第 28 卷
相符。从图 2 和图 3 可以看出 , 加入药物后 1 656 cm-1峰强
度下降 , 浓度低时降幅不大 , 仅有 2%～ 6%, 浓度增大到
1.0 mg ·mL-1时下降 13%。1 656 cm -1拉曼峰的强度与细
胞α螺旋结构的含量相关 , 峰强度下降说明药物作用使得蛋
白质二级结构中α螺旋结构比例有所下降 , 但是药物浓度低
时影响不大 , 浓度达到 1.0 mg · mL-1时药物作用显著。
1 004 cm -1归属于苯丙氨酸 Phe单基取代苯环的振动 , 1 174
cm -1归属于酪氨酸 Ty r C—H 平面内弯曲振动模式 , 这两个
峰在药物作用后都有明显下降。1 004 cm -1强度在药物浓度
为 0.1 mg ·mL-1时降幅达 15%, 0.2 mg ·m L-1时强度又
有所回升 , 0.5 mg · mL -1时下降了 15%左右 , 1.0 mg ·
mL-1时降幅达27%;1 174 cm -1加入药物后变化很大 , 随浓
度增大降幅依次增大 , 从 25%到 30%, 最大达 45%。这表明
药物作用使得苯丙氨酸及酪氨酸的环境乃至含量都发生了变
化。1 360 cm -1属于色氨酸吲哚环的振动 , 该谱线对于环境
和聚集状态的改变是敏感的 , 它的存在表明色氨酸残基的吲
哚环处于“埋藏式” [ 13] 。图 1 显示 , 肝癌细胞拉曼谱 1 360
cm -1处有一肩峰 , 而药物作用后 , 该峰逐渐减弱最后消失 ,
说明药物作用使细胞色氨酸残基逐步“暴露”出来。此外 , 归
属于色氨酸的 C C 振动的 1 619 cm -1也略有下降。
由此可见 , 1 312 , 1 585 , 1 174 , 1 004 cm -1即碱基和蛋
白质侧链氨基酸的拉曼峰对药物很敏感 , 药物浓度很低时拉
曼谱就有变化 , 而归属于磷酸骨架和蛋白质二级结构的 785 ,
1 656 cm -1在药物浓度低时变化不大 , 浓度高时才有明显变
化 , 1 656 cm -1最大降幅也只有 13%, 而蛋白质中氨基酸以
及 DNA对应的各峰下降幅度很大。这些结果表明药物作用
对细胞内 DNA 及氨基酸影响较大 , 而对蛋白质二级结构变
化影响不大 , 药物对细胞的作用效果随药物浓度增加逐步增
强 , 只有在浓度高时 DNA 链可能断裂 , 使蛋白质二级结构
变化明显。
3　结　论
　　用拉曼光谱研究了中成药复方鹿仙草颗粒与肝癌细胞的
相互作用。根据光谱分析推断得知:(1)药物作用使得 DNA
链发生断裂 , DNA 含量下降 , 但 DNA 构象并未发生反应 ,
药物可能插入到碱基对之间 , 使 DNA 复制受到抑制 , 从而
可能诱导细胞的凋亡。(2)药物作用使得细胞内蛋白质侧链
的氨基酸环境改变很大 , 而蛋白质二级结构变化不大 , α螺
旋结构比例略有下降。(3)药物作用效果随药物浓度的增大
而增加。综上所述 , 鹿仙草可以与肝癌细胞内的 DNA 、 蛋白
质相作用 , 从而诱导肝癌细胞凋亡 , 但是药物与细胞具体结
合位点及方式还有待进一步研究。拉曼谱作为一种分子振动
光谱 , 可以成为药理研究的工具 , 具有方便 、 快捷的优点 ,
结合其他的研究方法可以在药物筛选和药理研究中发挥重要
的作用。
参 考 文 献
[ 1] 　WANG Shi-h on g , WEI Wei , XU Du-juan , et al(王世宏 , 魏　伟 , 许杜娟 , 等).Anhui Medical and Ph arm aceut ical Journal(安徽医药),
2006 , 10(1):8.
[ 2] 　SONG Wen-guang , WANG Yi-f eng , ZHANG Zhi , et al(宋文广 , 王毅峰 , 张　志 , 等).Sh aanxi J ournal of T radit ional Chinese Medicine
(陕西中医), 2006 , 27(5):629.
[ 3] 　CHEN Long-f ei , CHEN Tao(陈龙飞 , 陈　涛).Chinese Jou rnal of the P ract ical Chinese and Modern M edicine(中华实用中西医杂志),
2003 , 6(14):2123.
[ 4] 　GUO Jian-yu , SUN Zhen-rong , WU Liang-ping , et al(郭建宇 , 孙真荣 , 吴良平 , 等).Spect roscopy and Spect ral Analy sis(光谱学与光谱
分析), 2006 , 26(3):460.
[ 5] 　TANG Yu-long , GUO Zhou-yi(唐玉龙, 郭周义).Spect roscopy and Spect ral Analy sis(光谱学与光谱分析), 2006 , 26(4):653.
[ 6] 　YU Ge , ZHANG Pan , TAN En-zhong , et al(于　舸 , 张　攀 , 谭恩忠 , 等).Spect roscopy and Spect ral Analy sis(光谱学与光谱分析),
2007 , 27(2):295.
[ 7] 　 H anlon E B , M anoh aran R , Koo T W , et al.Phys.Med.Biol., 2000 , 45:R1.
[ 8] 　Ram asamy M , Yang W , Feld M S.Spect rochimica Acta Part A , 1996 , 52:215.
[ 9] 　Sharon R H , William B C , And re K B , et al.Cancer Let t., 1996 , 110:35.
[ 10] 　Not ingh er I , Verrier S , Rom an skab H , et al.Spect roscopy-An Interational J ou rnal , 2002 , 16(2):43.
[ 11] 　Verrier S , Not ingher I , Polak J M , et al.Biopolym ers , 2004 , 74(1-2):157.
[ 12] 　Not ingh er I , Verrier S , H aque S , et al.Biopolymers , 2003 , 72(4):230.
[ 13] 　XU Yi-ming(许以明).Raman Spect roscopy in App lication of S tru cture Biology(拉曼光谱及其在结构生物学中的应用).Beijing:Chemi-
cal Indus try Pres s(北京:化学工业出版社), 2005.
[ 14] 　KE Wei-zhong , ZHOU Dian-feng(柯惟中 , 周殿凤).Chinese J ou rnal of S pect ros copy Laboratory(光谱实验室), 2004 , 21(3):432.
[ 15] 　LI U S ong-hao , M ENG Yao-yong(刘颂豪 , 孟耀勇).Acta Opt ica Sinica(光学学报), 2000 , 20(4):529.
[ 16] 　XU Yi-ming , ZHANG Zhi-yi , XU Guo-rui(许以明 , 张志义 , 徐国瑞).C hinese Science Bulletin(科学通报), 1989 , 34(19):1500.
[ 17] 　ZHAO H ong-xia , XU Yi-ming , ZHANG Zhi-yi(赵红霞 , 许以明 , 张志义).Chinese Science Bul let in(科学通报), 1998 , 43:957.
[ 18] 　LI Wei , CHEN Wu-gao , LIANG Yong-mao(李　蔚 , 陈五高 , 梁永茂).Chin ese Journal of Las er Medicine & Su rgery(中国激光医学杂
志), 1998 , 7(2):102.
2577第 11 期　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　光谱学与光谱分析
Raman Spectroscopic Investigation on the Interactions between Liver
Cancer Cells(SMMC-7721)and Fufang Luxiancao Particles
ZHANG Jin-yan , GUO Jian-yu , CAI Wei-ying , SUN Zhen-rong ＊
Sa te Key Labor ator y of Precision S pectro scopy and Depertment of Phy sics , East China No rmal Univ ersity , Shanghai　200062 ,
China
Abstract　Luxiancao is a new medicine fo r liver cance r , and is purely natural bo tanical.I t has good cura tive effects and few side
effects.The cura tive mechanism o f Luxiancao is unknow n.In the present paper , the autho rs used a 514.5 nm lase r to measure
the changes in the Raman spectrum of liver cancer cells (SMMC-7721)t reated by Luxiancao a t different concentr ations.The
study can help us know mo re about the mechanism , efficiency and side effects o f Luxiancao.The results show that significant
changes w ere observed in the cells Raman spectr a af te r reacting w ith Lux iancao.The intensities at 785 and 1 092 cm -1 , co rre-
sponding to DNA phosphate backbone vibr ation , were reduced;and the Raman bands for the bases A and G a t 1 312 and 1 585
cm -1 also decreased , indicating that Lux iancao may be inser ted in DNA bases and influence the DNA replica tions , resulting in
the reduction in DNA content and breaking of the DNA strands.Besides , the intensity o f 1 360 cm -1 , belonging to T rp , de-
crea sed gr adually and disappea red in the end , indica ting the T rp of cancer cells began to be exposed w hen adding in Luxiancao.
The bands at 1 004 cm -1 fo r Phe and 1 656 cm -1 fo r pro teins α-helix a lso decreased , suggesting that there w ere changes in the
structur e of pro tein and circum stance of amino acid.Moreove r , the effects on cance r cells w ere enhanced g radually w ith the
HCPT concentra tion increasing.Since a Raman spectrum is a chemical finge rprint o f a sample , the different concentration de-
pendent changes in the Raman spectra of individual cells due to reacting w ith Luxiancao can overcome the limitations o f other de-
tection sy stems used fo r quantita tive and qualitative ana ly sis o f the drug.
Keywords　Raman spectr oscopy;Luxiancao;L ive r cancer cells
(Received Sep.22 , 2007;accepted Dec.28 , 2007)　　
＊Co rr esponding author
2578 光谱学与光谱分析　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 第 28 卷