全 文 ：The Structure and Activity Studies Based on
Combining Functional Domain of Human
Interleukin-6 Receptor.FENG Jian-Nan , REN
Yun-Fang , LI Song1), SHEN Bei-Fen (Insti tuteof
Basic Medical Sciences , Academy of Military
Medical Sciences , Beijing 100850 , China;
1)Insti tute of Pharmacology and Tox icology ,
Academy of Military Medical Sciences , Beij ing
100850 , China).
Abstract　Based on molecular docking method , the
inf luence of interaction energy and molecular
interaction betw een mutated lig and combining
functional domain “WSXWS” of human interleukin-6
receptor (hIL-6R)and human interleukin-6 (hIL-6)
is studied.The conformation changes on key amino
acids of human interleukin-6 receptor w hen
combining wi th human interleukin-6 and the
interactions between human interleukin-6 recepto r
and human interleukin-6 are analyzed.
Key words 　human interleukin-6 receptor (hIL-
6R), human interleukin-6 (hIL-6), molecular
docking , functional domain
肥皂草毒蛋白分离纯化及性质研究
杨元德 　周康靖 　潘克桢 张蓉真 　陈儒明 　饶平凡
(中国科学院福建物质结构研究所 , 福州 350002) (福州大学生物工程研究所 , 福州 350002)
摘要　从肥皂草里分离到三种核糖体失活蛋白 (ribosome inactivating proteins , RIPs):SO3a、 SO3b , SO6.并测定
SO3a , SO3b 的相对分子质量分别约为 22 500、 19 400 , 等电点都为 8.4 左右.进行了氨基酸组成分析.用激光拉
曼光谱初步预测 SO3a和 SO3b 的二级结构含量.用反相毛细管色谱发现 SO6 含有两个组分 , 而 Stripe 等报道
SO6 为单一峰.
关键词　核糖体失活蛋白 , 肥皂草毒蛋白 , 激光拉曼光谱 , 二级结构
学科分类号　Q512.2
　　核糖体失活蛋白 (RIPs)是一类作用于真核
细胞核糖体 , 抑制蛋白质合成的毒素.RIPs在植
物中分布极为广泛.目前已从 50多种植物中分离
到 60多种不同的 RIPs或具有 RIPs活性的粗提物 ,
除植物外 , 主要几种真菌中也发现 RIPs.RIPs对
细胞中蛋白质的生物合成具有强烈的抑制作用 , 所
以 RIPs 可以用来制造抗病毒制剂[ 1] .肥皂草
(Saponaria of f icinal is)原产于欧洲 , 是在我国北
方庭院常见的供观赏用的多年生草本植物.Stirpe
等[ 2]于 1983年首次从种子中分离到肥皂草毒蛋白 ,
是一个单链 RIPs , 不含糖[ 3] .肥皂草毒蛋白在植
物中含量高 , 抑制活性强 , 有效组分多 , 国内外学
者对其进行了多方面的研究 , 在分离方法上也不断
地改进 , 对肥皂草部分组分也进行了晶体培养的尝
试[ 4 , 5] .SO3在肥皂草种子中含量较少 , 还没有文
献对 SO3的性质做深入的报道.本实验对 SO3的
两个组分进行了各种物理化学性质的测试 , 测定了
其氨基酸组成 , 并用激光拉曼光谱测定了它们的二
级结构的含量 , 用反相色谱发现按前人的方法分离
出的 SO6并不是单一组分.
1　材料与方法
1.1　材料
　　肥皂草种子购自北京植物园;HPLC 填料:
Poros HS , 毛 细 管 反 相 色 谱 填 料:C-18 ,
ProSpective产品;Sephacryl S-200 , Phamacia产品;
bis , Fluka 产品;SDS , Serv a产品 , 标准蛋白 (牛
血清蛋白 , 67 000 , 卵蛋白 , 43 000 , 天花粉蛋白 ,
27 000 , 溶菌酶 , 14 300), 上海生物化学研究所东
风生化试剂厂;其他试剂均为分析纯.
1.2　氨基酸组分分析
　　在日本岛津 LC-4A 高效液相色谱仪上进行检
测 , 对每个峰进行 280 nm检测.
　Tel:(0591) 3712393;E-mai l:yyuande@yahoo.com
　收稿日期:1998-11-08 , 修回日期:1999-03-08
·57·2000;27 (1)　　　　 生物化学与生物物理进展　　 Prog.Biochem.Biophys.
1.3　相对分子质量测定
　　用 SDS-聚丙 烯酰胺凝胶 电泳.方法按
Fairbanks[ 6]所述.
1.4　pI 测定
　　用等电聚焦 , 方法按 Catsimpoolas[ 7]所述.
1.5　激光拉曼光光谱测定
　　激光拉曼光谱条件:
　　Nvcolet co.FT-Ramman 910 (傅立叶变换激
光拉曼光谱仪), 光源:1.064 μm , 扫描次数:
1 000次 , MCT 检测器 , 收集90℃散射光 , 样品为
粉末状.
2　结　　果
2.1　分离和纯化
　　称肥皂草种子 50 g 浸泡在含 0.72% NaCl ,
pH 7.2 , 5 mmol/L 磷酸缓冲液中 , 至少 4 h.用高
速组织匀浆机匀浆 2×3 min , 于 4℃抽提过夜.匀
浆液用两层纱布过滤 , 滤液用40%饱和度的硫酸铵
沉淀 , 过滤 , 滤液用 100%饱和度的硫酸铵沉淀 ,
过滤 , 将沉淀溶于最小量的 5 mmol/L pH 6.5的磷
酸盐缓冲液中 , 装透析袋 , 对重蒸馏水透析
(3×8 h), 最后对 pH 6.5的磷酸缓冲液透析 (1×
8 h).透析后的样品离心准备上 HPLC 阳离子交换
柱.已装好的柱用 pH 6.5 磷酸缓冲液平衡 , 直到
上下 pH一致 , 然后将粗提样品上柱 , 上柱完毕后 ,
用磷酸缓冲液冲洗未吸附的杂蛋白.最后用 NaCl
线性梯度的磷酸缓冲液洗脱.洗脱完毕 , 在 751紫
外分光光度计上比色 (图 1).
图 1　HPLC洗脱图谱
2.2　凝胶过滤
　　装柱 Sephacryl S-200 (2.6 cm ×80 cm), 用
300 ml 50 mmol/L pH 6.5 磷酸缓冲液平衡 , 将过
HPLC 的 第 三 号 峰 (SO3)浓 缩 上 柱 , 用
50 mmol/L pH 6.5磷酸缓冲液洗脱 (图 2).洗脱
速度 1 滴需 8 ～ 10 s , 走纸速度 3 cm/h , 部分收集
器 1管需 24 min , 检测仪波长 280 nm.洗脱完毕
分别收集 SO3a 和 SO3b , 收集液浓缩后 , 对水透
析 4×8 h , 然后在真空冷冻抽干机上制成干粉.
图 2　S-200 洗脱图谱
2.3　反相毛细管色谱分离
　　从 CM-32 柱上收集 SO6 , 然后上 C-18 反相
柱 , 用 60%～ 90%的乙腈梯度洗脱 (图 3).
图 3　SO6 的反相色谱洗脱图谱
2.4　相对分子质量测定
　　用 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳.方法按 Fair-
banks
[ 6]所述 , 以相对分子质量的对数对迁移率作
图 (图 4), 计算出未知样的相对分子质量.
图 4　SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测相对分子质量
2.5　pI 测定
　　用等电聚焦 , 方法按 Catsimpoolas[ 7]所述 , 结
果见图 5.
·58· 生物化学与生物物理进展　　Prog.Biochem.Biophys.　　　　　2000;27 (1)
图 5　等电聚焦测 pI 值
2.6　激光激光拉曼光谱初步预测二级结构
　　在蛋白质中 , 酰胺基团的振动模式对骨架构象
的变化很敏感.酰胺 Ⅰ模型由 C O 伸展振动 ,
C N 伸展振动和 C N H 平面弯曲振动组成.
酰胺 Ⅲ模型主要由 C N H 平面弯曲振动和
C H 伸展振动组成[ 8] .
　　Lo rd[ 9]首次提出了蛋白质激光拉曼光谱的酰胺
带频率与构象 (α螺旋 , 反平行 β折叠 , 无规卷曲)
的关系 (表 1).
表 1　蛋白质的酰胺振动带与蛋白质构象的关系
酰胺Ⅰ 酰胺Ⅲ
α螺旋 1645～ 1658 cm-1 1264～ 1310 cm-1
β折叠 1665～ 1680 cm-1 1230～ 1245 cm-1
无规卷曲 1660～ 1666 cm-1 1242～ 1250 cm-1
　　根据表 1对谱图作一定的处理就可以得到有关
蛋白质二级结构的信息.
　　Lippert[ 10]在 1976年提出了以 poly-L-Lys为模
型化合物的计算二级结构含量的公式:
　　　CI 1240=FαI1240α+Fβ I1240β +F R I1240R
　　　CI 1632=FαI1632α+Fβ I 1632β+F R I 1632R
　　　CI 1600=FαI1600α+Fβ I 1600β+F R I 1600R
　　　1.0=Fα+Fβ+FR
　　相对强度 I1240是蛋白质在 1 240 cm-1处的光
谱高度对 CH2在 1 448 cm-1高度的比值;I1240α是
纯α螺旋的相对强度.Fα, Fβ , F R 分别是蛋白质
中三种构象的含量.C 是蛋白质中 CH2 带强度相
对于 poly-L-Lys的比例常数.
　　在蛋 白质和 多肽 的激光 拉曼 光谱 中 ,
850 cm-1带和 830 cm-1带由于酪氨酸残基的结构
特点 , 总是成对出现.而这二谱带的强度比可表征
酪氨酸残基所处的环境.根据 Craig 和 Gaber[ 11]
1977年提出的公式可以定量地得出其是呈 “暴露
式” 或 “埋入式” .
　　0.5 Nb+1.2 Ne=I850/ I830
　　 Nb+ Ne=1
　　SO3a , SO3b中酪氨酸暴露于外的分别占酪氨
酸总数的 71.4%, 58.4%, 埋入在蛋白质分子内部
分别占酪氨酸总数的28.6%, 41.6%.用于上述计
算的激光拉曼光谱数据见表 2和表 3.
表 2　激光拉曼光谱数据
1448 cm-1 1240 cm -1 850 cm-1 830 cm-1
I SO3a 0.876 0.604 0.525 0.507
I SO3b 0.549 0.375 0.333 0.355
表 3　激光拉曼光谱相对强度
1240 cm-1 1632 cm-1 1660 cm-1
α螺旋1) 0.00 0.80 0.55
β折叠1) 1.20 0.72 0.88
无规卷曲1) 0.60 0.08 0.78
SO3a (干粉) 0.7226 0.5788 0.8436
SO3b (干粉) 0.6685 0.6248 0.8415
1)纯α螺旋 、 β折叠和无规卷曲的相对强度 (Lippert J L , et al.J
Am Chem Soc , 1976 , 98 (22):7075～ 7080).
3　讨　　论
　　SO3a和 SO3b是从阳离子柱分出的单一峰里 ,
用凝胶过滤分出的两个组分 , 所以它们的等电点应
该相近 , 等电聚焦结果也证实了这一点 (图 5).
SO3a比SO3b 的相对分子质量大 , 这从二者的迁
移率 (图 4)和凝胶过滤峰的位置 (图 2)可以得
到印证.
　　从激光拉曼光谱的二级结构测定可以看出 , 二
者在二级结构上有一定的差异 (表 4).从二者的
氨基酸组分分析看 (表 5), Asx , Glx 含量最多 ,
Lys , Arg 含量次之.等电聚焦表明二者都是碱性 ,
约为 8.4左右 , 故认为 Asx , Glx 多以酰胺形式存
在.二者氨基酸组成相比较 , SO3a 的 Pro 含量是
SO3b的 4.6倍.Pro的存在不利于α螺旋的形成 ,
这一点与激光拉曼光谱的二级结构测定相符合 ,
SO3a的α螺旋含量明显低于 SO3b 的含量.SO3a ,
SO3b的蛋白质纯度很高 , 再结合 HPLC 可知道
SO3a , SO3b 的组分也很单一.通过 SO3a , SO3b
与已知 RIPs 的二级结构含量比较可知 , SO3a ,
·59·2000;27 (1)　　　　 生物化学与生物物理进展　　 Prog.Biochem.Biophys.
SO3b富含 β 结构 , 我们推测 SO3a , SO3b 很可能
是一种新型的 RIPs.
表 4　根据 Lippert的三级结构模型算出的二级结构含量和
已知的 RIPs的二级结构含量的比较
占总残基百分数
α螺旋 β 折叠 无规卷曲
比例常数
C
SO3a 28.6 35.7 35.7 0.89
SO3b 35.5 32.3 32.2 0.87
天花粉毒蛋白 48.3 16.3 35.2
苦瓜子毒蛋白 48.6 14.1 37.2
α-丝瓜子毒蛋白 47.6 19.1 33.5
β-丝瓜子毒蛋白 49.0 10.7 40.3
蓖麻毒蛋白A链 39.0 23.3 37.7
蓖麻凝集素 38.4 26.1 35.4
香思子毒蛋白A链 31.5 28.3 48.3
商陆抗病毒蛋白 41.7 13.5 44.7
紫茉莉抗病毒
蛋白 46.4 17.6 36.0
表 5　氨基酸组分分析
名称 含量/ %
SO3a SO3b
平均氨基酸数/个
SO3a SO3b
Asp 15.2 17.52 14 25
Thr 5.7 5.65 6 9
S er 4.58 4.73 5 9
Glu 10.54 10.82 9 14
Pro 2.83 0.62 3 1
Gly 5.52 5.41 9 14
Ala 7.21 8.65 10 19
Cys — — — —
Val 6.03 4.10 6 7
Met 1.38 1.16 1 2
Ile 4.80 5.05 5 7
Leu 7.73 6.64 7 10
Tyr 6.59 6.10 4 6
Phe 6.59 7.08 5 8
His 1.26 0.81 1 1
Arg 6.34 6.85 4 8
Lys 8.98 8.72 4 8
Trp — — — —
注:%是质量百分比 , 平均氨基酸数以 His个数为 1 , T rp Cys酸解
时被破坏.
　　根据氨基酸组成分析 , 可算出 SO3a、 SO3b的
最小相对分子质量分别约为 12 342 、 19 187 , 而从
凝胶过滤知道 , SO3a 的相对分子质量大于 SO3b ,
并且电泳测得 SO3a 、 SO3b分别为 21 135 、 19 770
左右 , 故可估计 SO3a , SO3b的相对分子质量约为
22 500 , 19 400.
　　Stripe等报道 SO6为单一峰 , 本实验中采用反
相毛细管色谱发现 SO6 含有两个组分 , 在本实验
中用反相毛细管色谱发现 SO6含有两个非常相似
的峰 , 因为本实验中的反相毛细色谱是根据样品的
疏水性来分离的 , 所以我们推测 SO6的两个组分
的一级结构区别只存在于极少数氨基酸上 , 甚至极
个别氨基酸上.SO6 一直未能获得晶体 , 可能与
SO6含有两个相似的组分有关.
致谢　在本项工作中福州大学生物工程研究所的陈
天豹 , 李珑 , 徐小华 , 林晓辉 , 李邦德等给予了许
多帮助 , 在此对他们表示感谢 !
参　考　文　献
1 　Byers V S , Baldw in R W.A Phase Ⅰ/Ⅱ study of t richosan thin
t reatment of HIV disease.AIDS , 1990 , 4 (12):1189～ 1196
2 　S tripe F , Anna G C , Anna F , et a l , Ribosome-inact ivating
proteins f rom the seeds of Saponar ia L.(soapw ort), of
Agrostemma g ithago L.(corn cockle), of Asparagus of f ici-
naicus L. (asparagus), and f rom the latex of Hura crepitans
L.(sandbox t ree).Biochem J , 1983 , 216 (3):617～ 625
3 　郑　硕.植物核糖体失活蛋白的研究概况 , 生物化学与生物物
理进展 (Zheng S.Prog Biochem Biophys), 1989 , 16 (1):16
～ 18
4 　Lappi D A , Fred S E , Luigi B , et a l.Characterizat ion of a
Saponaria of f icinal is seed robosome-inact ivating proteins:
immunoreactivi ty and sequence homologies.Biochem Biophys Res
commun , 1985 , 129 (3):934～ 942
5 　黄东宏 , 邱　巍 , 傅珠玑等.肥皂草毒蛋白的纯化 、 性质及晶
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Fu Z J , et al.Acta Biochimica et Biophysica S inica) 1995 , 27
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Purification and Characterization of Saporins.
·60· 生物化学与生物物理进展　　Prog.Biochem.Biophys.　　　　　2000;27 (1)
YANG Yuan-De , ZHOU Kang-Jing , PAN Ke-Zhen
(Fuj ian Institute of Research on the S tructure of
Mat ter , The Chinese Academy of Sciences , Fuzhou
350002 , China);ZHANG Rong-Zhen , CHEN Ru-
Ming , RAO Ping-Fan (Biotechnology Institute ,
Fuzhou Universi ty , Fuzhou 350002 , China).
Abstract　Three sapo rins , SO3a , SO3b and SO6 ,
were separated and purified from the seeds ex tracts of
Saponaria of f icinalis.The molecular w eights of
SO3a and SO3b are about 22 500 , 19 400 , respec-
tively , and their p I values are about 8.4 and the
amino acid components are analysed.The contents of
the secondary st ructure of SO3a and SO3b are deter-
mined by laser Raman spect rum.In the experiment
i t w as also found by reverse phase capillary chromato-
g raphy that SO6 which w as reported by stripe to be a
purified protein , contain tw o components in fact.
Key words　RIPs , saporin , laser Raman spect rum ,
secondary structure
佛波酯 (TPA)促进 NIH3T3细胞α5β1
整合蛋白的合成＊
贺建宇1)　方新初 　曹立环 　查锡良2)
(卫生部糖复合物重点实验室 , 上海医科大学生化教研室 , 上海 200032)
摘要　佛波酯 (TPA)是潜在促肿瘤剂 , 也是蛋白激酶 PKC 激活剂.TPA 能在极低浓度下替代 DG 激活 PKC ,
从而导致一系列细胞功能变化.应用 100 nmol/ L TPA作用于 NIH3T3细胞 , 观察 NIH3T3 细胞的粘附变化 , 发
现 TPA 可促进 NIH3T3 细胞与基质纤连蛋白的粘附 , 进一步研究 Fn 的主要受体α5β1 整合蛋白在细胞表面含量 ,
发现 TPA 作用 24 h 使α5 及 β1 含量分别增加 52.3%和 51.6%.应用3H-甘露糖标记 N-糖链和凝集素柱层析方法
分析 TPA 作用后细胞 N-糖链总量和组分比 , 结果均与对照组相仿 , 说明是通过增加细胞合成整合蛋白α5 及 β1
亚基含量实现的.在 TPA 作用于细胞的同时 , 加入 PKC 抑制剂 Sphingosine , 发现α5 、 β1 含量和细胞与 Fn 的粘
附均回复至对照组水平 , 提示 TPA 增加α5β1 整合蛋白合成而增加的细胞与 Fn 粘附作用 , 是由 PKC 介导完成
的.此外还发现酪氨酸蛋白激酶抑制剂也阻断 TPA增加α5β1整合蛋白含量的作用.
关键词　整合蛋白 , 细胞粘附 , 蛋白激酶 C , 佛波酯
学科分类号　Q5
　　蛋白激酶 (protein kinase)[ 1] 主要有三类 , 即
蛋白激酶A (protein kinase A , PKA)、 蛋白激酶 C
(protein kinase C , PKC)、 和酪氨酸蛋白激酶
(tyrosine protein kinase , TyPk), 它们参与胞外信
号跨膜传递 , 通过蛋白质丝/苏氨酸或酪氨酸磷酸
化 , 在调节细胞代谢 、 分化 、生长 、 增殖及癌变过
程中具有十分重要的作用.PKC 是一种广泛分布
的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶 , 催化底物蛋白 Ser/
Thr残基磷酸化.PKC 活化后 , 可催化多种底物
蛋白质磷酸化 , 包括 Na+/H+交换泵磷酸化而使
细胞内 pH 升高.最终导致 DNA 合成增加.PKC
还催化胰岛素受体 、表皮生长因子受体 (EGFR),
钙调蛋白等多种重要的生理活性蛋白的 Ser/Thr残
基磷酸化 , 影响细胞内生物信息的传递 , 发挥重要
的生物学功能[ 2] .
　　佛波酯 (12-0-tet radecanoylphorbol-13-acetate ,
TPA)是已知的潜在促肿瘤剂 (tumo r promoto r),
实验证实 PKC是 TPA 的直接作用受体.结构分析
提示 TPA具有甘油二酯样结构 , 因此 TPA能在极
低浓度下替代 DG 激活 PKC , 并能大大地增加
PKC和 Ca2+的亲和力 , 导致细胞内无法觉察的
Ca2+流动时 , 而 PKC 已完全被激活[ 2～ 6] .
　　由于 TPA能通过激活 PKC 导致细胞内一系列
生化反应 , 产生细胞众多生理功能 , 但 TPA 能否
引起细胞粘附变化 , 目前尚不明确 , 这值得进一步
　＊国家自然科学基金(39570169)和上海市教委重点学科资助项目.
　1)上海医科大学肝癌研究所.
　2)通讯联系人.
　Tel:(021) 64041900-2696 , E-mail:xlzha@shmu.edu.cn
　收稿日期:1998-12-26 , 修回日期:1999-05-24
·61·2000;27 (1)　　　　 生物化学与生物物理进展　　 Prog.Biochem.Biophys.