全 文 ：锦带花体外抗流感病毒有效部位研究
王芳，陈萍萍，尹俭俭，高松
(大连大学医学院，辽宁 大连 116622)
摘 要:目的:筛选锦带花抗流感病毒的有效部位，为锦带花药效物质基础阐明提供依据。方法:体外用 MTT 法检
测锦带花有效部位对传代狗肾细胞 MDCK 的毒性浓度，观察锦带花有效部位抑制甲型流感病毒的致细胞病变作用
(CPE) ，MTT检测锦带花有效部位对流感病毒的抑制率。结果:锦带花的各有效部位均有抗流感病毒(H1N1)的作用，其
中锦带花乙酸乙酯提取物的抑制流感病的作用与利巴韦林相似;而石油醚提取物的抑制作用最弱。结论:锦带花具有确
切的抗流感病毒作用，锦带花的乙酸乙酯提取物为抗流感病毒的有效成分集中部位。
关键词:锦带花;甲型流感病毒;有效部位;抗流感病毒作用
中图分类号:R284． 1 文献标志码:B 文章编号:1000 － 1719(2013)02 － 0315 － 02
Study on Effective Fraction of Anti-Influenza Virus of Weigela Florida in Vitro
WANG Fang，CHEN Pingping，YIN Jianjian，GAO Song
(Medical College of Dalian University，Dalian 116622，Liaoning，China)
Abstract:Objective:To screen effective fraction of anti-influenza virus extracted from Weigela florida，which would provide
evidence for explanation of active substance foundation of Weigela florida． Methods:Methyl thiazolyl tetrazolium(MTT)assay was
used for the detection of in-vitro toxicity concentrations of the Weigela florida active extracts on Madin-Darby canine kidney(MD-
CK)cell line． Then cytopathic effect(CPE)of Weigela florida active extracts on influenza virus A /H1N1 was observed，and MTT
assay was applied to observe the inhibitory rate for influenza virus． Results:The inhibitory effect for influenza virus of the extract of
ethyl acetate was the same as that of ribovirin，but the inhibitory effect for influenza virus of the extract of petroleum ether was the
feeblest of all the extracts． Conclusion:Weigela florida has exact anti-influenza virus activity，and the most active ingredients focus
in the extracts of ethyl acetate．
Key words:Weigela florida;influenza A virus;effective fraction;anti-influenza virus effect
收稿日期:2012 － 08 － 25
作者简介:王芳(1988 －) ，女，山东招远人，硕士研究生，研究方向:中药
有效成分及疗效机理。
通讯作者:高松(1959 －) ，男，辽宁大连人，副教授，硕士研究生导师，研
究方向:中药质量控制与中药药效学研究。
锦带花来源于忍冬科(Caprifoliaceae)植物锦带
Weigela florida(Bunge)A． DC、早开锦带花 W． praecox
(Lemoine)Bailey 的干燥花蕾。传统认为具有清热解
毒，活血止痛的功效，主治瘟病初起，头疼烟干，喉痹，
痈肿疔疮，丹毒等症［1］。流行性感冒是由流感病毒引
起的急性呼吸道传染病，具有传染性高，传播速度快，
易变异，易发生流行等特点。目前，化学药物对防治流
感的毒副作用较大，又由于流感病毒的易变异性，使得
疫苗的有效利用率并没有达到预期的效果［2 － 3］。而中
药在这方面具有独特的疗效，因而，开展中药的抗病毒
的研究并从中寻找活性物质是当前研究的重点课题之
一。本文真对锦带花的不同化学组分，观察对流感病
毒的抑制作用，为其今后的进一步研究奠定基础。
1 实验材料与仪器
1. 1 药物 锦带花采自大连大学校园，经大连大学中
医中药学系高松教授鉴定为忍冬科植物锦带花 Weige-
la florida(Bunge)A． DC的干燥花蕾。
取干燥锦带花 400 g，置圆底烧瓶中，加入适量的
75%乙醇(没过锦带花)浸泡过夜，80 ℃回流提取 3
次，每次 2 h，滤过，滤液减压回收乙醇，使提取物体积
达到 250 mL，依次用石油醚，乙酸乙酯，正丁醇萃取，
并回收溶剂，制备锦带花不同极性部位提取物。以二
甲亚砜(DMSO)溶解后用 DMEM 配置成浓度为 10
mg /mL的溶液，使用前经 0. 08 MPa，15 min 消毒灭菌。
利巴韦林注射液(濮阳市汇元药业有限公司，1 mL:
0. 1 g，101022)
1. 2 病毒株 流感病毒 H1N1 购于中国科学院武汉
病毒研究所，经大连大学病原生物学实验室传代保存。
1. 3 细胞 传代够肾细胞(MDCK)经大连大学病原
生物学实验室传代后保存。细胞生长液为含有 10%
胎牛血清的 DMEM培养液(美国 Gibco 公司) ;细胞维
持液中含 2%胎牛血清，其余同细胞生长液。
1. 4 主要实验仪器 酶标仪(瑞士 TECAN) ;细胞培
养箱(美国 Heraerus)环境:37 ℃，5% CO2，湿度饱和;
小型离心机(美国 Sigma 公司) ;电热鼓风干燥箱(天
津泰斯特仪器公司)。
2 方 法
2. 1 药物对 MDCK细胞的毒性作用 MDCK 细胞按
1 × 106 mL －1的浓度接种于 96 孔板，每孔 100 μL。置
·513·辽宁中医杂志 2013 年第 40 卷第 2 期
DOI：10.13192/j.ljtcm.2013.02.129.wangf.056
37 ℃，5%CO2 培养箱中培养 24 h 后，加入不同药物浓
度的含药维持液继续培养。每天于倒置显微镜下观察
细胞变化，72 h 后用 MTT 法［4］检测吸光度(A)值，并
计算细胞存活率。每一药物浓度重复 4 孔，同时设正
常细胞对照，实验重复 3 次。计算药物的半数细胞毒
性浓度(CC50)。
细胞存活率(%)= A 实验组 /A 细胞对照组 ×
100%
2. 2 病毒对 MDCK细胞的毒性作用 取置 － 70 ℃冰
箱保存的病毒，将病毒在 96 孔板上作 10 倍递进稀释，
即 10 －1，10 －2，10 －3……10 －10，每孔病毒悬液量为 50
μL，每个稀释度做 8 孔，每孔加入 100 μL细胞悬液，每
块板的最后一行设 8 孔细胞对照，制备细胞悬液的浓
度以使细胞在 24 h 内长满单层为度。把培养板置 37
℃，5% CO2 培养箱中培养，记录结果。用 Reed-
Muench两氏法［5］计算 TCID50。
2. 3 体外抗流感病毒的药效学实验 MDCK 细胞按
1 × 106 mL －1的浓度接种于 96 孔板，每孔 100 μL。置
37℃，5% CO2 培养箱中培养 24h 后，用 100TCID50 的
病毒每孔 100 μL感染单层 MDCK细胞，吸附 2 h 后弃
上清，PBS洗涤后加入不同药物浓度的含药维持液(从
CC50 /2 开始分别作 2 倍系列稀释共 7 个稀释度) ，每
孔 200 μL，每日观察细胞病变情况，待病毒对照孔
CPE达 80%以上且细胞对照正常时，用MTT法检测细
胞存活率，每一药物浓度重复 4 孔，同时设正常细胞对
照和病毒对照。计算药物对病毒的半数抑制浓度
(IC50) ，以上实验均重复 3 次。
病毒抑制率(%)=(A 药物处理孔 － A 病毒对照
孔)/(A细胞对照孔 － A病毒对照孔)× 100%
采用治疗指数(TI)作为评价指标［6］，衡量药物对
流感病毒的抑制作用。
TI = CC50 / IC50
3 结 果
3. 1 药物对 MDCK细胞的毒性作用 药物对细胞的
毒性作用表现为细胞变小，折光性差，破碎甚至脱落。
锦带花各有效部位及利巴韦林对 MDCK 细胞的毒性
作用如表 1 所示。
表 1 药物对 MDCK细胞的毒性作用
CC50(μg /mL)
乙醇提取物 11158. 98
石油醚提取物 8433. 78
乙酸乙酯提取物 15521. 79
正丁醇提取物 10829. 18
利巴韦林 6974. 39
3. 2 病毒对 MDCK的毒性作用 通过记录的 CPE 百
分率，应用 Reed － Muench两氏法计算得到的 H1N1 流
感病毒 TCID50 为 10 － 5. 84 /mL(1:691830)。
3. 3 药物对流感病毒的抑制作用 见表 2，每日观察
流感病毒对 MDCK 细胞的影响，观察到流感病毒对
MDCK细胞的 CPE 表现为细胞皱缩、变圆、胞内颗粒
增多、坏死脱落。结构显示，锦带花的各个有效部位均
具有一定的抑制流感病毒的作用，但其作用有强有弱，
其中锦带花乙酸乙酯提取物抑制流感病毒作用最强，
虽较利巴韦林较小，但也达到很高的安全范围;而石油
醚提取物作用最弱。
表 2 药物对流感病毒的抑制作用
IC50(μg /mL) TI
乙醇提取物 482. 99 22. 87
石油醚提取物 V1380. 22 5. 93
乙酸乙酯提取物 473. 43 33. 78
正丁醇提取物 424. 11 25. 79
利巴韦林 179. 47 38. 86
3. 2 病毒对 MDCK的毒性作用 通过记录的 CPE 百
分率，应用 Reed － Muench两氏法计算得到的 H1N1 流
感病毒 TCID50 为 10 － 5. 84 /mL(1:691830)。
3. 3 药物对流感病毒的抑制作用 见表 2，每日观察
流感病毒对 MDCK 细胞的影响，观察到流感病毒对
MDCK细胞的 CPE 表现为细胞皱缩、变圆、胞内颗粒
增多、坏死脱落。结构显示，锦带花的各个有效部位均
具有一定的抑制流感病毒的作用，但其作用有强有弱，
其中锦带花乙酸乙酯提取物抑制流感病毒作用最强，
虽较利巴韦林较小，但也达到很高的安全范围;而石油
醚提取物作用最弱。
4 讨 论
锦带花作为民间草药，来源于忍冬科(Caprifoli-
aceae)植物锦带 Weigela florida(Bunge)A. DC、早开锦
带花 W. praecox(Lemoine)Bailey 的干燥花蕾。传统认
为具有清热解毒，活血止痛的功效，主治瘟病初起，头
疼烟干，喉痹，痈肿疔疮，丹毒等症。但目前对于锦带
花的研究罕见。本实验通过体外细胞培养法考察了锦
带花的各有效部位对流感病毒的抑制作用，抗流感病
毒有效部位的研究为锦带花清热解毒物质基础的阐明
提供实验依据。
本文的研究结果表明，锦带花的乙酸乙酯提取物
对流感病毒甲型有抑制作用，且活性显著;正丁醇及乙
醇提取物也有较强的活性，但其活性较乙酸乙酯提取
物稍弱;而石油醚提取物对流感病毒甲型的抑制作用
则很弱。故初步得到锦带花的乙酸乙酯提取物为抗流
感病毒的有效成分集中部位，值得进一步的深入研究。
参考文献
［1］ 高松．辽南地区药用植物志［M］．北京:科学出版社，2008:331．
［2］ Hiseh YC，Wu TZ，Liu DP，et al． Influenza Pandemics:Past，Present
and Future［J］． Formos Med Assoc，2006，105(1) :1 － 6．
［3］ Megan CS，Dominic ED，Aeron CH，et al． Detection of influenza A
H1N1 and H3N2 mutation conferring resistance to oseltanivir using
rolling circle amplification［J］． Antiviral Research，2009，84:242 －
248．
［4］ Marina P，Sonia S，Umberlo B，et al． Interference in MTT cell viability
assay in activated macrophage cell line［J］． Anal Biochem，2003，313
(2) :338．
［5］ 黄祯祥． 医学病毒学基础及实验技术［M］． 北京:科学出版社，
1990:133．
［6］ Takeuchi I，Baba M． An application of Tetrazolium (MTT)colorimet-
ric assay for the screening of anti － herpes simplex virus compounds
［J］． Viral Methods，1991，33:61．
·613· 辽宁中医杂志 2013 年第 40 卷第 2 期