全 文 ：Traditional Chinese Drug Research ＆ Clinical Pharmacology，2011 January，Vol．22 No．1
鸡血藤醇提物体外抗病毒活性研究
曾凡力1，程 悦2，陈建萍3，符 影2，王巧利1，杨得坡2，陈振平1，向阳飞1，王一飞1，王冬梅2（1. 暨南大学生
物医药研究开发基地，广州 510632；2. 中山大学药学院，广州 510006；3. 香港大学中医药学院，香港）
摘要：目的 研究鸡血藤醇提物及其不同极性溶剂萃取物的体外抗柯萨奇B3病毒、单纯疱疹病毒Ⅰ型、呼吸道
合胞病毒、甲型流感病毒以及乙型肝炎病毒的活性。方法 鸡血藤药材60 %醇提物经石油醚、乙酸乙酯、正
丁醇依次萃取后浓缩制得各不同极性溶剂萃取物，观察其药物毒性、病毒引起的细胞病变效应判断药物毒性及
药物抗病毒效应。结果 鸡血藤醇提物无抗柯萨奇B3病毒和呼吸道合胞病毒活性，但具有抗甲型流感病毒、乙
型肝炎病毒和单纯疱疹病毒Ⅰ型活性，且抗单纯疱疹病毒Ⅰ型效果显著。醇提物经初步萃取分离，得到5个不
同极性溶剂萃取物，其中乙酸乙酯萃取物和水层留余物抗单纯疱疹病毒Ⅰ型活性最显著。结论 鸡血藤醇提物
及其乙酸乙酯萃取物和水层留余物在体外对单纯疱疹病毒Ⅰ型具有明显的抑制作用，适用于抗单纯疱疹病毒Ⅰ
型治疗药物的深入研究与开发。
关键词：鸡血藤；柯萨奇B3病毒；单纯疱疹病毒Ⅰ型；呼吸道合胞病毒；甲型流感病毒；乙型肝炎病毒
中图分类号：R285.5 文献标志码：A 文章编号：1003-9783（2011）01-0016-05
Study on in vitro Antiviral Activities of Different Extracts from Caulis Spatholobi
ZENG Fanli1，CHENG Yue2，CHEN Jianping3，FU Ying2，WANG Qiaoli1，YANG Depo2，CHEN Zhenping1，
XIANG Yangfei1，WANG Yifei1，WANG Dongmei2（1. Biomedicine Research & Development Center of Jinan
University， Guangzhou 510632， China； 2. School of Pharmaceutical Sciences， Sun Yat -sen University，
Guangzhou 510006，China；3. School of Chinese Medicine，University of Hongkong，Hongkong，China）
Abstract: Objective To assay the in-vitro anti-virus activities of extracts from Caulis Spatholobi（CS）on Cox－
sackie B3 virus（CVB3），herpes simplex virus 1（HSV-1），respiratory syncytial virus（RSV），influenza A and
hepatitis B virus（HBV）. Methods The 60 % ethanol extract of CS was extracted by petrol ether，ethyl ac－
etate and n-butanol in order to obtain the extracts with different polarity. The toxicity and antiviral actions were
evaluated by observing drug cytotoxicity effect and cytopathic effect（CPE）. Results The 60% ethanol extract of
CS had no antiviral activities against CVB3 and RSV，but inhibited infection of influenza A，HBV and HSV-1.
The inhibitory effect of ethanol extract against HSV-1 infection was more significant. Among the five different
polar solvents extracts obtained by liquid-liquid extraction of the ethanol extract，the ethyl acetate extract and
the water residue part showed most significant anti-HSV-1 activities. Conclusion CS ethanol extract and its
ethyl acetate extract and the water residue part have remarkable anti-HSV-1 activity in vitro，and can be uti－
lized for the further research and development of anti-HSV-1 drugs.
Keywords: CauLis spatholobi；Coxsackie B3 virus（CVB3）；Herpes simplex virus 1（HSV-1）；Respiratory syncy－
tial virus（RSV）；Influenza A；Hepatitis B virus（HBV）
收稿日期：2010-10-30
作者简介：曾凡力，男，硕士研究生，研究方向：主要从事抗病毒新药研究工作。Email：350908202@qq.com。通讯作者：王一飞，博士，教授，
博士生导师，研究方向：主要从事新药研究工作。Email：twangyf@jnu.edu.cn。王冬梅，博士，副教授，硕士生导师，主要从事中草药药效物质基
础与质量标准化研究，Email：lsswdm@mail.sysu.edu.cn。
基金项目：国家自然科学基金·广东省自然科学联合基金（U0632010）；科技部国际合作项目（2009DFA31230）。
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中药新药与临床药理 2011年 1月第 22卷第 1期
病毒感染会引起多种疾病，严重危害人类和动物
健康和生命，有数据显示，约 60％的传染病是由病
毒引起的。迄今为止，全世界发现的病毒超过 3000
种，并且有新的病毒不断被发现。上世纪 80年代医
学家发现的人免疫缺陷病毒（HIV）所致艾滋病是危害
性极大、死亡率很高的传染病。2003年又发现了一
种由新的冠状病毒所致严重急性呼吸道综合征（se－
vere acute respiratory syndrome，SARS），具有高度传
染性，致死率高。2009年 4月份爆发的高致病性甲
型 H1N1流感先后逐渐在北美和全世界蔓延，造成死
亡人数至少超过 5000，严重威胁人类生命健康。但
是对病毒性疾病的治疗，至今仍缺乏专属性强的药
物。
鸡血藤（CauLis spatholobi）为豆科密花豆属植物
密花豆 Spatholobus suberctus Dunn 的干燥藤茎，其
性温，味苦、甘，是一味沿用千年的活血化瘀中药，
古代多篇本草论著中都记载了其“去瘀血，生新血”
的功效，并称之为“血分之圣药”[1]。中医认为其具
有补血、活血、通络之功效，用于治疗月经不调、血
虚萎黄、舒筋活血、麻木瘫痪等症[2]。现代医学研究
表明，鸡血藤具有抗菌消炎，改善血液系统[3-4]，提
高免疫力[5]，降血压，抗心律失常[6]，抗肿瘤[7]及抗病
毒活性[8]等作用。为深入研究探讨鸡血藤在抗病毒药
物研发中的应用前景，本研究对鸡血藤 60 %乙醇提
取物进行了抗柯萨奇 B3 病毒、单纯疱疹病毒Ⅰ型、呼
吸道合胞病毒、乙型肝炎病毒的体外抗病毒实验，并对
其进行了初步萃取分离和抗病毒活性筛选，以期为其在
抗病毒方面的应用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 药材 鸡血藤药材（购于香港大学中医药学院药
房，产地：广西），经中山大学药学院生药学与天然
药物化学实验室杨得坡教授鉴定为密花豆属植物密花
豆（Spatholobus suberctus Dunn）的干燥藤茎。
1.2 细胞 Hela细胞株、Vero细胞株、Hep-2细胞株
和 MDCK细胞株均引自美国 ATCC，由本室保存。细
胞生长液为 10 %胎牛血清的 DMEM，细胞维持液为
含 2 %新生牛血清（Hep-2细胞为含 2.5 %的鸡血清）
的 DMEM，常规加入青霉素 100 U/mL，链霉素 100
U/mL；HepG-2.2.15细胞为 HBV DNA经克隆转染入
肝癌细胞（HepG-2）的细胞系，由武汉大学医学院病
毒研究所惠赠，其细胞培养液为 RPMI 1640培养液，
含 10 %胎牛血清，100 U/mL 青霉素，100 U/mL 链
霉素和 200 μg /mL G 418（抗生素）。
1.3 病毒 柯萨奇 B3病毒（CVB3）、单纯疱疹病毒Ⅰ
型（HSV-1）、呼吸道合胞病毒（RSV） 均由武汉大学
医学院病毒研究所提供，CVB3在 Hela细胞中活化增
殖后，其滴度 10-9 TCID50/mL，实验用 100 TCID50/
mL；HSV-1 在 Vero 细胞中活化增殖后，其滴度为
10 -6 TCID50/mL，实验用 100 TCID50/mL； RSV 在
Hep-2细胞中活化增殖后，其滴度为 10-4 TCID50/mL，
实验用 100 TCID50/mL；甲型流感病毒（Influenza A）
由日本长崎大学生物医学与分子微生物学部提供，病
毒在鸡胚中活化增殖后，其滴度为 10-4 TCID50/mL，
实验用 100 TCID50/mL。
1.4 仪器与试剂 CO2 培养箱，日本 Sanyo 公司；
超净工作台，苏州净化设备公司；相差显微镜，德国
Laica 公司；酶标仪，美国 BIO-RAD 公司；GB204
电子天平，0.1/0.01 mg，METTLER TOLEDO；DMEM
培养基、RPMI1640 培养基，GIBCO 公司，批号：
795518；胎牛血清、新生牛血清，杭州四季青生物材
料工程有限公司，批号：090820；G418为 Sigma 公
司产品；HBsAg、HBeAg 诊断试剂盒购自英科新创
（厦门）科技有限公司，批号：2010066310。
1.5 实验方法
1.5.1 鸡血藤醇提物及各萃取部位的制备 鸡血藤药
材粉碎后，用 60 %乙醇超声提取 2次，每次 1 h，溶
剂用量分别为 1 ∶ 10、1 ∶ 8（W/V），减压回收溶剂后，
得到鸡血藤 60 %醇提物。将上述醇提物用适量水溶
解分散后，分别用等体积的石油醚、乙酸乙酯、正丁
醇萃取，各萃取液以及水层留余液浓缩至干，分别制
得石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物（EA1）、乙酸乙酯
萃取不溶物（EA2）、正丁醇萃取物（Bu）和水层留余物
（DW）等 5个部位。由于石油醚萃取物得率极低，故
未进行后续的深入研究。上述醇提物以及其余 4个萃
取部位作为抗病毒活性测试的供试药物，用适量二甲
基亚砜（DMSO）溶解配制成 100 mg/mL 的药液，备
用。
1.5.2 抗 CVB3、HSV-1、RSV、Influenza A活性实验
（1）药物对细胞的毒性测定 在 96孔培养板上加
入 1.5×105个/孔密度的细胞，100 μL/孔，37℃，5 %
CO2培养 24 h，待其生长为单层细胞，弃去培养液。
用维持液将药物倍比稀释成 7个系列浓度（起始浓度
为 200 μg/mL），每个稀释度设 4 个复孔，100 μL/
孔，并设正常细胞对照组。继续培养 48 h，其间置
倒置显微镜下观察，观察药物的最大无毒浓度。
·17·
Traditional Chinese Drug Research ＆ Clinical Pharmacology，2011 January，Vol．22 No．1
（2）药物的药效学实验 在 96孔培养板上加入
1.5×105 个/孔密度的细胞，100 μL/孔，37℃，5%
CO2 培养 24 h，待其生长为单层细胞，弃去培养液。
将不同稀释度的药物（在无毒浓度范围内）和病毒稀释
液（100 TCID50）等体积混合后直接加到单层细胞上，
每个浓度设 4个复孔，100 μL/孔，同时设病毒对照
组、正常细胞对照组，置于 37℃、5% CO2培养箱培
养 24～36 h，其间置倒置显微镜下观察细胞病变
（Cytopathogenic effect，CPE）的情况，以病毒对照组
CPE达 75 %及以上时，且细胞对照正常时为实验观
察终点，记录药物各浓度的细胞病变情况。
1.5.3 抗乙型肝炎病毒实验
（1）药物对细胞的毒性测定 在 96孔培养板上加
入 5×103个/孔密度的 HepG-2.2.15细胞，100 μL/孔，
37℃，5 % CO2培养 24h，待其生长为单层细胞，弃
去培养液。用维持液将药物倍比稀释成 7个系列浓度
（起始浓度为 200 μg/mL），每个稀释度设 4个复孔，
100 μL/孔，并设正常细胞对照组。继续培养 9 d，每
隔 3 d换含相同浓度药液 1次，其间置倒置显微镜
下观察，观察药物的最大无毒浓度。
（2）药物对 HepG-2.2.15 细胞表达 HBsAg、HBeAg
的抑制实验 在 24 孔板上加入 2×104 个/孔密度的
HepG-2.2.15 细胞，1 mL/孔，37℃，5 % CO2 培养
24 h，弃去培养液。将药物倍比稀释成 4个系列浓度
（在无毒浓度范围内），每个浓度设 4个复孔，同时正
常细胞对照组和阳性药物对照组。继续培养 9 d，每
隔 3 d换含相同浓度药液 1次，并将各孔上清液收
集至 1.5 mL的 EP管中－20℃冻存备用。采用 ELISA
试剂盒进行检测，操作按照试剂盒的使用说明进行，
最后用酶标仪测吸光值 A450，计算药物对细胞表达
HBsAg、HBeAg 的抑制率。抑制率（%）=（未用药的
抗原值-用药的抗原值）/未用药的抗原值 × 100 %。
1.6 数据结果的统计学处理 鸡血藤醇提物及其不同
极性溶剂萃取物和药物对细胞的毒性测定与空斑减数
实验的数据以表示，用 SPSS 13.0 软件分析作 t 检
验。
2 结果
2.1 抗CVB3、HSV-1、RSV、Influenza A活性 鸡
血藤醇提物对细胞的毒性较大，镜检结果如表 1 所
示。药物浓度为 100 μg/mL以上时，均对宿主细胞具
有毒性作用。
表1 鸡血藤醇提物对细胞的毒性
Table 1 The cytoxicity affected by the ethanolic extract
from cs（n=4）
鸡血藤醇提物 /μg·mL-1 Hela Vero Hep- 2 MDCK
200
100
50
25
12.5
6.25
3.13
-
-
-
-
-
-
-
-
-
+
-
-
-
-
-
-
-
-
注：无毒为 -；1%～25% 为 +；26%～50% 为 ；51%～75%为
；76%～100% 为 。
实验结果表明鸡血藤醇提物对 Hela细胞、Vero
细胞、Hep-2细胞和 MDCK细胞的最大无毒浓度依
次是： 25 μg/mL， 50 μg/mL， 12.5 μg/mL， 50 μg/
mL。以最大无毒浓度为起始浓度，鸡血藤醇提物倍
比稀释成 7 个浓度，分别进行抗 CVB3、HSV-1、
RSV、Influenza A 活性研究，镜检结果见表 2。实验
结果表明，鸡血藤醇提物无抗 CVB3、RSV活性；鸡
血藤醇提物在浓度为 50 μg/mL及以上浓度时能够完
全抑制 HSV-1对细胞的病变作用；鸡血藤醇提物在
浓度为 25 μg/mL及以上浓度时能部分抑制 Influenza
A对细胞的病变作用。
表2 鸡血藤醇提物的抗病毒活性
Table 2 The antiviral activity of the ethanolic extract from
cs（n=4）
稀释倍数
病毒株
CVB3 HSV- 1 RSV Influenza A
20
21
22
23
24
25
26
-
+
+
注：1%～25%为 +；26%～50%为 ；51%～75%为 ；76%～
100%为 。
2.2 抗HBV活性
2.2.1药物对细胞的毒性测定 鸡血藤醇提物对
HepG-2.2.15 细胞的毒性较大，镜检结果如表 3 所
示。药物作用第 4 d时，200 μg/mL，100 μg/mL，和
50 μg/mL均对细胞有毒性；作用第 7 d时，随着药物
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中药新药与临床药理 2011年 1月第 22卷第 1期
对细胞的作用时间加长，其毒性作用加剧，25 μg/
mL也表现一定的毒性；作用第 10 d后，最终最大无
毒浓度为 6.25 μg/mL。
表3 不同浓度的鸡血藤醇提物（μg/mL）对HepG-2.2.15细胞的
毒性（n=4）
Table 3 The cytoxicity affected by the ethanolic extract
from Spatholobus suberctus to HepG-2.2.15 cell（n=4）
稀释倍数
第 4 d
第 7 d
第 10 d
毒性等级
200 100 50 25 12.5 6.25 3.13
-
+
-
-
+
-
-
-
-
-
-
注：无毒为 -；1 %～25 %为 +；26 %～50 %为 ；51 %～75 %
为 ；76 %～100 %为 。
2.2.2 鸡血藤醇提物对 HBsAg 表达的抑制效果 在
HepG-2.2.15 细胞培养中，药物对 HBsAg 表达的抑
制效果如表 4 所示，药物作用第 4 d 时，各剂量对
HBsAg的表达均有一定的抑制作用（P ＜ 0.05），但量
效关系不明显。第 7 d时，高剂量表现为一定抑制作
用（P ＜ 0.05），其他剂量效果不明显。随着药物治疗
时间的加长，到第 10 d时，各剂量对 HBsAg 的表
达均有抑制效果（P ＜ 0.05），高剂量的抑制率达到
27.59 %。
2.2.3 鸡血藤醇提物对 HBeAg 表达的抑制效果 在
HepG-2.2.15细胞培养中，药物对 HBeAg 表达的抑
制效果如表 5 所示，药物作用第 4 d 时，各剂量对
HBeAg的表达均有一定的抑制作用（P ＜ 0.01），并显
示一定的量效关系。第 7 d时，中、高剂量表现为一
定抑制作用（P ＜ 0.05），低剂量效果不明显。随着药
物治疗时间的加长，到第 10 d时，各剂量对 HBeAg
的表达的抑制效果不明显，高剂量的抑制率仅为
14.86 %。
2.2.4 抗单纯疱疹病毒Ⅰ型活性研究 鸡血藤醇提物
各萃取部位对 Vero 细胞毒性镜检结果如表 6 所示，
其中水层留余物（DW）对细胞毒性最小，最大无毒浓
度为 100 μg/mL；其次为乙酸乙酯萃取物（EA1），最
大无毒浓度为 50 μg/mL；其余两萃取部位的最大无
毒浓度均为 25 μg/mL。
表4 鸡血藤醇提物对HepG-2.2.15细胞表达HBsAg的抑制作用（x± s，n=4）
Table 4 Effects of the ethanolic extract from CS on HBsAg secretion in HepG-2.2.15 cell culture（x± s，n=4）
组别
剂量 /
μg·mL-1
1.56
3.13
6.25
-
0.41±0.06*
0.39±0.14*
0.39±0.18*
0.48±0.01
14.65
17.62
17.97
-
0.73±0.04
0.68±0.02
0.67±0.02*
0.73±0.03
0.87
7.17
8.40
-
1.00±0.16*
0.94±0.13*
0.89±0.02**
1.24±0.10
19.16
23.95
27.60
-
OD值 抑制率 /% OD值 抑制率 /% OD值 抑制率 /%
第 4 d 第 7 d 第 10 d
鸡血藤
醇提物
细胞对照组
注：与对照组比较，**P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。vs. untreated group， *P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。
表5 鸡血藤醇提物对HepG-2.2.15细胞表达HBeAg 的抑制作用（x± s，n=4）
Table 5 Effects of the extract from CS on HBeAg secretion in HepG-2.2.15 cell culture（x± s，n=4）
注：与对照组比较，*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001；vs. untreated group，*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。
组别
剂量 /
μg·mL-1
1.56
3.13
6.25
-
1.10±0.14**
1.01±0.11***
0.94±0.04***
1.49±0.08
26.03
31.79
36.78
-
1.79±0.12
1.50±0.18**
1.43±0.08**
1.86±0.05
3.73
19.71
22.96
-
1.33±0.11
1.36±0.13
1.21±0.15
1.42±0.12
5.92
3.97
14.86
-
OD值 抑制率 /% OD值 抑制率 /% OD值 抑制率 /%
第 4 d 第 7 d 第 10 d
鸡血藤
醇提物
细胞对照组
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Traditional Chinese Drug Research ＆ Clinical Pharmacology，2011 January，Vol．22 No．1
表6 鸡血藤提取物对Vero细胞的毒性作用（n=4）
Table 6 The cytotoxicity affected by different extracts
from CS to Vero cell（n=4）
浓度 /
μg·mL-1
200
100
50
25
12.5
6.25
3.13
+
-
-
-
-
-
+
-
-
-
-
+
-
-
-
-
+
-
-
-
-
-
-
鸡血藤醇提物的不同极性溶剂萃取部位
EA1
萃取物
EA2
萃取物
Bu
萃取物
水层
留余物
注：无毒为 -；1%～25%为 +；26 %～50 %为 ；51 %～75 %为
；76%～100% 为 。
鸡血藤醇提物各萃取部位分别以最大无毒浓度为
起始浓度，倍比稀释进行抗 HSV-1活性研究，镜检
结果如表 7所示。结果表明，PE萃取物和 EA2萃取
物均没有抗 HSV-1 活性，在最大无毒浓度时，其
CPE 与病毒对照没有显著差别；水层留余物在 100
μg/mL时能完全抑制病毒对细胞的病变作用，随着浓
度降低，抗病毒活性逐渐减弱；其他萃取物虽有一定
的抗病毒活性，但效果并不明显。
表7 鸡血藤提取组分抗单纯疱疹病毒Ⅰ型活性结果（n=4）
Table 7 The anti-HSV-1 effects of active components
extracts from CS（n=4）
稀释倍数
病毒株（HSV- 1）
EA1萃取物 EA2萃取物 Bu萃取物 水层留余物
20
21
22
23
24
25
26
+ + -
+
注：1 %～25 %为 +；26 %～50 %为 ；51 %～75 %为 ；76
%～100 %为 。
3 讨论
柯萨奇病毒 B3（coxsackievirus group B type 3，
CVB3） 是病毒性心肌炎的主要病原，病毒持续感染
可导致扩张型心肌病，目前，临床缺乏有效的抗病毒
治疗药物[9]。人类单纯疱疹病毒Ⅰ型（Herpes simplex
1 virus，HSV-1）可引起多种疾病，如唇疱疹、疱疹
性角膜炎、新生儿脑炎等，目前临床常用的治疗药物
主要是无环鸟苷（ACV）等核苷类，但其毒性大，易产
生耐药性、抗病毒谱窄且价格高昂[10]。呼吸道合胞病
毒（respiratory syncytial virus，RSV）是婴幼儿病毒性
肺炎和毛细支气管炎的主要病原体之一，目前，对
RSV感染尚无特效治疗和预防方案[11]。乙型病毒性肝
炎是由乙型肝炎病毒（HBV）引起的一种世界性疾病，
目前尚缺乏专属性较强的治疗药物。
鸡血藤是一种传统的活血补血中药，在我国广
西、广东、云南、贵州等地区资源非常丰富。本实验
研究表明，鸡血藤醇提物具有广谱的抗病毒效果，对
甲型流感病毒、乙型肝炎病毒和单纯疱疹病毒Ⅰ型均
有一定的活性，其中对单纯疱疹病毒Ⅰ型抑制效果最
显著。其抗病毒靶点可能是抑制病毒的 DNA聚合酶
和 RNA聚合酶，从而达到抗病毒效果[12]，本论文进
一步探讨了鸡血藤醇提物不同极性溶剂萃取部位的抗
单纯疱疹病毒Ⅰ型活性，结果显示乙酸乙酯萃取物和
水层留余物具有明显的抗病毒活性，可为进一步分离
纯化得到抗病毒的先导化合物提供重要参考。
参考文献：
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（编辑：邓响潮）
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