全 文 ：中药新药与临床药理 2010年 7月第 21卷第 4期
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（编辑：梁进权）
收稿日期：2010-02-15
作者简介：黎锦（1980-），女，技师，主要从事与病毒性疾病相关的临床与实验研究。Email：pearli1980@126.com。通讯作者：杨占秋，教授，博
士生导师。Email：yangzhanqiu@163.com。
基金项目：国家“863”计划资助项目（2007AA02Z465）。
菘蓝有效成分抗流感病毒作用的实验研究
黎 锦1，2，杨占秋2，陈 文2，王又又2（1. 武汉大学中南医院检验科，武汉 430071；2. 武汉大学医学病毒学研
究所，病毒学国家重点实验室，武汉大学食品与药品研究中心，武汉 430071）
摘要：目的 研究菘蓝有效成分在体内外抗甲型流感病毒的作用。方法 体外用MTT法检测菘蓝有效成分对传
代狗肾细胞（MDCK）的毒性浓度，观察菘蓝有效成分抑制甲型流感病毒的致细胞病变作用（CPE），MTT法检测
菘蓝有效成分对流感病毒的抑制率；建立在体流感病毒感染小鼠肺炎模型，通过观察小鼠肺病变程度指标，测
定肺组织内流感病毒血凝滴度判定菘蓝有效成分对小鼠肺炎的治疗作用。结果 菘蓝有效成分在体外主要抑制
甲型流感病毒在细胞内的复制，其对病毒的半数抑制率浓度为64 μg·mL-1，治疗指数达28.88；口服菘蓝有效成
分能明显减轻小鼠肺组织病变程度，对肺组织内病毒的增殖有明显抑制作用。结论 菘蓝有效成分具有较好的
抗甲型流感病毒的作用，且呈剂量效应关系。
关键词：菘蓝有效成分；甲型流感病毒；抗病毒作用
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1003-9783（2010）04-0389-05
Antiviral Effect of Active Component of Isatis tinctoria L. on Influenza A Virus
LI Jin1，2， YANG Zhanqiu2， CHEN Wen2，WANG Youyou2（1.Department of Laboratory， Zhongnan Hospital，
Wuhan University，Wuhan 430071，China; 2. National Key Laboratory of Virology， Institute of Medical Virology，
School of Medicine，Research Center of Food and Drug，Wuhan University，Wuhan 430071，China）
Abstract: Objective To investigate the antiviral effect of active component of Isatis tinctoria L.（ITL）on influenza virus
A/H1N1 in vitro and in vivo. Methods Methyl thiazolyl tetrazolium（MTT）assay was used for the detection of in-vitro
toxicity concentrations of the ITL active component on Madin-Darby canine kidney（MDCK）cell line. Then cytopathic
effect（CPE）of ITL active component on influenza virus A/H1N1 was observed，and MTT assay was applied to observe
the inhibitory rate for influenza virus. Influenza virus infection mouse pneumonitis model was established，and pul－
monary pathological changes and pulmonary virus hemagglutination titers of the mice were examined for the assessment
of the anti-influenza activity of the active component in vivo. Results The activity component had inhibitory effect on
viral replication in vitro with IC50 being 64 μg·mL-1 and therapeutic index（TI）up to 28.88. Oral use of active compo－
nent significantly reduced the pulmonary pathological changes， and inhibited the proliferation of pulmonary virus.
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Traditional Chinese Drug Research ＆ Clinical Pharmacology,2010 July,Vol．21 No．4
流行性感冒是由流行性感冒病毒（Influenza virus，
简称流感病毒）引起的急性呼吸道传染病，具有传染
性高，传播速度快，易发生流行等特点，严重危害人
类健康和生命。据统计，全球每年的流感病例约为6
亿到12亿，平均每年有50多万人死于流感 [1]。而且，
流感病毒，尤其是甲型流感病毒的表面抗原极易变
异[2]。疫苗保护作用仍是目前预防流感的重要措施之
一，但由于病毒变异速度快，疫苗不能对所有人群完
成有效免疫等诸多因素的影响，使得疫苗的有效利用
率并没有达到预期效果。目前化学药物（如金刚烷胺
类）的毒副作用较大，且部分变异的流感病毒对传统
药物（如神经氨酸酶抑制剂）已产生耐药性 [3]，因此，
至今尚无安全有效的防治流感的方法。为寻找有效
的、毒副作用小的抗流感病毒中药，作者选择菘蓝有
效成分进行抗流感病毒体内体外试验，为流感病毒感
染的治疗提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 药物 菘蓝采自安徽毫州，经华中科技大学同济
医学院附属同济医院中药研究室方建国副主任药师
鉴定为十字花科植物菘蓝的干燥根。将其粉碎成粗
粉，95 %乙醇渗漉法提取，减压浓缩至无醇味，拌
以硅藻土，采用系统溶剂分离法，依次以石油醚、
氯仿、醋酸乙酯、正丁醇加热回流萃取，回收溶剂
得到4个不同极性的化学部位，按原生药量计，得率
分别为2.0 %、2.2 %、0.6 %、1.5 %（各部位分别含
腺苷0.004 %、0.010 %、0.005 %、0.042 %）。根据
初筛试验结果，选取醋酸乙酯提取部位作实验对象。
以二甲基亚砜（DMSO）溶解后用DMEM配置成浓度为
10 mg·mL-1的溶液，使用前经0.08 MPa、15 min消毒
灭菌。
1.2 病毒株 流感病毒A/（H1N1）由本实验室保存。使
用前在9~11日龄鸡胚尿囊腔接种传代3~4次，收集尿
囊液，以3000 r/min离心15 min，取上清液进行血凝
实验，将血凝滴度大于1 ∶ 320且细菌培养阴性的病毒
液进行分装，置-80 ℃保存备用。
1.3 细胞 传代狗肾细胞（MDCK）由本实验室保存。
细胞生长液为含有10 %胎牛血清（三利生物制品厂）
的DMEM培养液（Hyclone公司产品），常规加入1×105
U·L-1青霉素，100 mg·L-1链霉素和1 %谷氨酰胺；细
胞维持液中除含2 %胎牛血清外，其余同细胞生长液。
1.4 动物 5~7周龄BALB/c小鼠，雌雄各半，体重
（11±1）g，武汉大学医学院实验动物中心，动物合格
证号：SCXK（鄂）2003-0004。
1.5 菘蓝有效成分体外抗流感病毒实验
1.5.1 对MDCK细胞的毒性作用 MDCK细胞按1×106
mL-1的浓度分种于96孔板，每孔100 μL。置37 ℃，
5 % CO2孵箱培养24 h后，加入不同药物浓度含药维
持液继续培养。每天于倒置显微镜下观察细胞变化，
72 h后用MTT法[4]检测吸光度（A）值，并计算细胞存活
率。每一药物浓度重复4孔，同时设正常细胞对照。
实验重复3次。用统计软件SPSS11.5进行Probit回归分
析计算药物的半数细胞毒性浓度（CC50）。
细胞存活率（%）=A实验组/A细胞对照组×100 %
1.5.2 体外抗流感病毒的药效学实验 96孔板上的
MDCK细胞长成单层后分成3组，分别以3种不同方式
检测菘蓝有效成分对流感病毒（H1N1）的抑制作用。Ⅰ
组（药物对病毒感染的预防作用）：将含有不同浓度药
物的细胞维持液预先处理单层MDCK细胞2 h，磷酸
缓冲液（PBS）洗涤2次后，以100 TCID50的病毒每孔0.1
mL感染细胞，35 ℃，5 %CO2吸附2 h后，弃病毒上
清，PBS洗涤2次，加细胞维持液培养，每日观察细
胞病变（CPE）情况。CPE记录方法为：“-”为无
CPE，“+”为25 %细胞出现CPE，“++”为50 %细
胞出现CPE，“+++”为75 %细胞出现CPE，“++++”
为100 %细胞出现CPE。待病毒对照孔CPE达80 %以
上且细胞对照正常时，用MTT法检测细胞存活率，每
一药物浓度重复4孔，同时设正常细胞对照和病毒对
照。以Probit回归方法计算药物对病毒的半数抑制浓
度（IC50）。Ⅱ组（药物对病毒的直接灭活作用）：将不
同浓度药物与100 TCID50的病毒等量混合作用2 h，再
将其感染单层MDCK细胞，吸附2 h后弃上清，PBS洗
涤后加入细胞维持液，同上法继续培养和检测。Ⅲ组
（药物对病毒在细胞内复制的抑制作用）：用100
TCID50的病毒每孔0.1 mL感染单层MDCK细胞，吸附2
h后弃上清，PBS洗涤后加入不同药物浓度的含药维
持液，每孔0.2 mL，同上法继续培养和检测。以上实
验均重复3次。
Conclusion The active component of Isatis tinctoria L. has antiviral activity by inhibiting replication of influenza virus
A/H1N1 in vitro and in vivo in a dose-dependent manner.
Keywords: Active component of Isatis tinctoria L.；Influenza virus A /H1N1；Antiviral effect
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中药新药与临床药理 2010年 7月第 21卷第 4期
病毒抑制率（%）=（A药物处理孔-A病毒对照孔）/（A细胞对照孔-
A病毒对照孔）×100 %
采用治疗指数（treatment index，TI）作为评价指
标[5]，衡量药物对流感病毒的抑制作用。
TI = CC50/IC50
1.6 菘蓝有效成分体内抗流感病毒实验
1.6.1 流感病毒对小鼠半数致死量（LD50）的测定 将
血凝滴度为1 ∶ 640的病毒10倍倍比稀释，得到10-4、
10-5、10-6、10-7、10-8五个稀释度的病毒液，分别接
种5组小鼠，每组5只，雌雄各半。乙醚轻度麻醉后，
每组分别给予上述稀释度的病毒液，每只小鼠滴鼻接
种50 μL。观察感染后14 d小鼠死亡情况，按Reed-
Muench法计算LD50[6]。
1.6.2 对小鼠流感病毒性肺炎的影响 40只雌性
BALB/c小鼠随机分为5组。分别为正常对照组，病毒
感染模型组，均灌服羧甲基纤维素钠；菘蓝有效成分
低剂量治疗组（0.05 g·kg-1·d-1），中剂量治疗组（0.1
g·kg-1·d-1），高剂量治疗组（0.2 g·kg-1·d-1）。小鼠经乙
醚轻度麻醉，以15 LD50病毒液滴鼻感染，每只50 μL，
正常对照组用生理盐水代替病毒液滴鼻。感染后12 h
开始灌胃给药，每天灌胃给药1次，每次0.1 mL，连
续给药5 d。逐日观察小鼠发病症状和体重变化情况。
最后一次给药后小鼠禁食8 h，称重，摘除眼球放血，
脱颈处死各组小鼠，取全肺，用生理盐水洗涤2次，
称肺重，逐个计算小鼠肺指数（Lung Index，LI）和肺
指数抑制率[7]。
肺指数=肺重/体重×100 %
肺指数抑制率（%）=（病毒组肺指数-给药组肺指
数）/病毒组肺指数×100 %
1.6.3 肺悬液流感病毒血凝滴度测定 取小鼠肺组织
置匀浆器中加生理盐水[肺重（g）/生理盐水（mL）=1 ∶ 9]，
在冰浴中研磨制成匀浆，离心（4 ℃，3000 r/min，20
min）后取上清液，作血凝试验[8]。选用96孔血凝试验
板，每孔加入25 μL生理盐水，第一孔加入25 μL待
测病毒悬液，混匀后取25 μL做倍比稀释，最后一孔
弃去25 μL。每孔加入1 %鸡红细胞悬液25 μL，轻微
振荡，室温静置45 min，观察血凝现象并记录结果。
出现“ ”（即红细胞在孔底形成一个环状，四周有小
凝集块）的流感病毒最高稀释度为血凝终点，并以病
毒悬液稀释倍数表示病毒的血凝滴度。实验同时设生
理盐水对照和病毒对照。
1.7 统计学处理 采用SPSS11.5统计软件，用Linear-
Regression对药物剂量与其产生的细胞效应（细胞存
活率，病毒抑制率） 进行相关性分析；体内实验两组
间比较采用One-way ANOVA分析。
2 结果
2.1 体外实验
2.1.1 对MDCK细胞的毒性作用 菘蓝有效成分对细
胞的毒性作用表现为细胞变小，胞内颗粒增多，折光
性差，甚至破碎、脱落。菘蓝有效成分对MDCK细胞
的毒性作用如表1所示，经直线回归分析，对细胞的
毒性作用在一定范围内随着药物浓度的增加，细胞存
活率降低，存在线性相关关系，P ＜ 0.05。菘蓝有效
成分CC50为1868.3 μg·mL-1。
表1 菘蓝有效成分对MDCK细胞的毒性作用
2.1.2 体外抗流感病毒的作用 每日观察细胞病变情
况，流感病毒对MDCK细胞的CPE表现为细胞皱缩、
变圆，颗粒增多，坏死脱落。在Ⅰ组和Ⅱ组中，每个
药物浓度孔细胞均表现出典型的流感病毒CPE效应，
且MTT显示病毒抑制率与病毒对照组相近 （P ＞
0.05）。菘蓝有效成分对流感病毒侵入细胞无预防作
用，对流感病毒无直接灭活作用。在Ⅲ组中，随着药
物浓度的增加，典型的CPE表现减弱，病毒抑制率增
加，且抑制作用随药物浓度增加而增强，呈明显量效
关系（P ＜ 0.05）。表明菘蓝有效成分对细胞内流感病
毒的复制有明显抑制作用，见表2。
菘蓝有效成分浓度/μg·mL-1
50
100
200
400
800
1600
细胞存活率/%
93.5
92.8
88.7
83.9
74.5
60.8
CC50/μg·mL-1
1868.3
表2 菘蓝有效成分对流感病毒的抑制作用
组别
Ⅰ组
Ⅱ组
Ⅲ组
2.5μg·mL-1
4.0
0.8
10.1
5μg·mL-1
6.1
2.4
27.3
10μg·mL-1
6.1
4.3
34.6
20 μg·mL-1
6.4
4.8
40.5
40 μg·mL-1
6.9
6.6
43.7
80 μg·mL-1
9.3
8.2
61.7
160 μg·mL-1
8.8
9.8
79.5
879.0
464.8
64.0
3.56
5.26
28.88
不同药物浓度下病毒抑制率 /%
IC50/μg·mL-1 TI
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Traditional Chinese Drug Research ＆ Clinical Pharmacology,2010 July,Vol．21 No．4
2.2 体内实验
2.2.1 流感病毒对小鼠LD50的测定 感染后第3天，前
3组均有小鼠出现发病症状，第6天开始陆续有小鼠死
亡。观察14 d的小鼠死亡情况，统计各组小鼠死亡
数，按Reed-Muench法计算该病毒株LD50为10-6.3。
2.2.2 对小鼠流感病毒性肺炎的影响 正常对照组小
鼠精神良好，行动敏捷，皮毛顺滑，呼吸正常，进食
饮水量正常，体重持续增加。病毒模型组小鼠行动迟
缓无力，蜷缩，耸毛，呼吸加快、短促，食量减少，
逐渐消瘦。各药物治疗组小鼠体重下降较少，与病毒
对照组相比有显著性差异（P < 0.05）。
正常小鼠肺脏呈淡粉红色，未见病变；病毒模型
组小鼠肺脏体积明显增大，大多数有2个以上肺叶出
现成片的实变区，说明实验建立的小鼠染毒模型可
靠。各药物治疗组小鼠肺部病变均有不同程度的减
轻，低、中、高剂量组小鼠肺指数值与病毒模型组相
比明显降低（P < 0.05），见表3。
表3 菘蓝有效成分对流感病毒感染致小鼠肺炎的影响（x±s，n=8）
注：与病毒模型组比， *P < 0.05。
2.2.3 对小鼠肺组织流感病毒血凝滴度的影响 菘蓝
有效成分中、高剂量组小鼠肺悬液病毒血凝滴度较病
毒对照组明显降低（P < 0.05），说明菘蓝有效成分能
有效抑制小鼠肺组织内流感病毒的增殖，见表4。
表4 菘蓝有效成分对小鼠肺组织流感病毒血凝滴度的影响
注：与病毒模型组比， *P < 0.05。
3 讨论
菘蓝（Isatis tinctoria L.）是十字花科植物，其根和
叶均可入药，干燥根入药称板蓝根，有泄火，解毒，
凉血等功效 [9]，有抗内毒素及抗炎作用 [10-11]，可治疗
包括甲型流感病毒感染在内的多种病毒性疾病[12]。但
对菘蓝中起主要作用的单个有效成分研究很少。本实
验通过体外细胞培养法和体内建立病毒感染模型考察
了菘蓝有效成分抗甲型流感病毒的效果。结果显示，
对MDCK细胞内流感病毒的复制有较明显的抑制作
用，表明菘蓝有效成分可进入感染病毒的细胞内发挥
作用，为其抗流感病毒的主要方式。
Takizawa T等[13]对流感病毒感染后宿主细胞的蛋
白质合成过程分析表明，宿主蛋白质合成在感染早期
还正常进行，而病毒蛋白质合成则于感染后3.5~4 h
才开始，5.5~6 h达高峰。为了研究菘蓝有效成分治
疗小鼠病毒性肺炎的作用，我们选择在15LD50流感病
毒滴鼻感染小鼠后12 h给药。正常小鼠感染流感病毒
后引发小鼠病毒性肺炎，以肺间质大量单个核细胞浸
润为特征，小鼠肺重增加的同时体重减轻，肺指数相
应增加，因而“肺指数”能较好的反映小鼠肺病变的
程度，是评价药物是否具有抗流感病毒作用的有效指
标。结果显示，菘蓝有效成分低、中、高剂量组均能
明显延缓小鼠体重下降，减轻其肺部炎症病变程度，
肺指数值明显降低，说明菘蓝有效成分对小鼠流感病
毒性肺炎有较好的治疗效果。
流感病毒血凝素与感染性病毒颗粒密切相关，病
毒血凝效价在一定程度上可反映病毒的数量和毒力，
血凝试验可以用来判断病毒滴度。通过对小鼠肺组织
悬液血凝滴度的测定可了解肺内流感病毒的增殖程
度。结果显示，菘蓝有效成分中、高剂量组小鼠肺组
织内流感病毒血凝滴度明显低于病毒模型组，说明菘
蓝有效成分能有效抑制小鼠肺组织内流感病毒的增
殖。综上所述，菘蓝有效成分能较好的抑制甲型流感
病毒的增殖，是一种有效的抗流感病毒的中药成分。
本研究为临床上治疗甲型流感病毒感染提供了药效学
依据。
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组 别
正常组
模型组
低剂量组
中剂量组
高剂量组
剂量
/g·kg-1·d-1
-
-
0.05
0.1
0.2
1 d
17.20±0.72
17.20±0.72
17.35±0.50
17.96±1.13
17.81±0.84
2 d
17.06±0.72
16.4±0.83
17.48±0.44
17.91±0.89
17.65±0.82
3 d
16.67±0.78
15.9±0.75
17.41±0.36
18.03±0.83
17.61±0.78
4 d
16.56±0.73*
13.8±0.41
15.29±0.27*
16.67±1.19*
17.18±0.39*
5 d
17.55±0.69*
13.58±0.24
14.88±0.43*
16.61±1.02*
17.16±0.75*
LI
0.83±0.02*
1.73±0.12
1.36±0.07*
1.27±0.13*
1.05±0.11*
肺指数
抑制率/%
-
-
21.39
26.59
39.31
体重/g
组 别
正常组
模型组
低剂量组
中剂量组
高剂量组
剂量/g·kg-1·d-1
-
-
0.05
0.1
0.2
x± s
-
15.8±1.2
12.3±1.5
9.2±1.0
6.5±1.73
ln（x± s）
-
2.68±0.24
2.42±0.37
2.17±0.25*
1.74±0.36*
血凝滴度
·392·
中药新药与临床药理 2010年 7月第 21卷第 4期
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（编辑：梁进权）
收稿日期：2009-12-26
作者简介：古学文（1968-），男，硕士，副主任中医师，主要从事中医内科临床工作。Email：guxuewen628@tom.com。
基金项目：广东省教育厅“千百十工程”优秀人才基金项目（Q02026）。
白花蛇舌草诱导HSP70表达对H22肝癌细胞移植瘤T淋巴细胞的影响
古学文1，胡 玲2，唐纯志2，崔娜娟3，王洪琦2（1. 广州中医药大学第三附属医院，广州 510360 ；2. 广州中医
药大学脾胃研究所，广州 510405；3. 北京市中西医结合医院，北京 100039）
摘要：目的 观察白花蛇舌草对H22肝癌细胞移植瘤鼠瘤体T淋巴细胞亚群的影响。方法 将中药处理后的H22
肝癌细胞，采用HSP70单抗封闭技术分为白花蛇舌草和党参未封闭、封闭及RPMI-1640空白对照共5组；观察各
组CD4+、CD8+T淋巴细胞表达情况。结果 与空白对照组比较，白花蛇舌草未封闭组CD8+、封闭组CD4+表达明
显上调；党参封闭组CD4+表达也明显上调；与白花蛇舌草封闭组比较，白花蛇舌草未封闭组CD8+T淋巴细胞表
达明显上调。结论 白花蛇舌草诱导恶性肿瘤瘤体HSP70的高表达，增强机体对肿瘤的免疫作用，其机理可能
与提高瘤体CD4+、CD8+CTL表达有关。
关键词：白花蛇舌草；H22肝癌细胞；T淋巴细胞
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1003-9783（2010）04-0393-03
Effect of H8P70 Expression Induced by Herba Hedyotis Diffusae on T Lymphocytes in Mice with H22 Liver
Cancer Cell Xenograft
GU Xuewen1，HU Ling2， TANG Chunzhi2， CUI Najuan3，WANG Hongqi2（1. The Third Affiliated Hospital of
Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510360，China; 2. Institute of Piwei，Guangzhou Univeristy
of Chinese，Guangzhou 510360，China; 3. Beijing Hosptital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine，
Beijing 100039，China）
Abstract: Objective To observe the effect of Herba Hedyotis Diffusae（HHD）on T-lymphocyte subsets in H22 mice
liver cancer cell xenograft tumor. Methods By using HSP70 monoclonal antibody blocking technique，H22 hep－
atoma cells treated with HHD were divided into 5 groups: HDD blocking group，Radix Codonopsis（RC）blocking
group，HDD non-blocking group，RC non-blocking group and RPMI-1640 blank control group. Then we observed
CD4+ and CD8+ T lymphocyte expression in each group. Results Compared with the blank control group，CD8+ ex－
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