全 文 ：收稿日期:2013-09-06 接受日期:2013-11-21
基金项目:国家自然科学基金项目(81173541)
* 通讯作者 Tel:86-10-84738619;E-mail:huangjianmeiluck@ sina． com
天然产物研究与开发 Nat Prod Ｒes Dev 2014，26:1248-1251
文章编号:1001-6880(2014)8-1248-04
高速逆流色谱法分离纯化灯心草的四个菲类化合物
李贵云，陈泽蔓，王小红，黄建梅
北京中医药大学中药学院，北京 100102
摘 要:本研究建立了高速逆流色谱法分离纯化灯心草中四个主要菲类成分 effusol、dehydroeffusol、juncusol、de-
hydrojuncusol的方法。以环己烷-乙酸乙酯-甲醇-水为溶剂体系，上相为固定相，下相为流动相，流速 2mL /min，
主机转速 850 rpm，温度 25 ℃，对灯心草经 80%乙醇回流提取，乙酸乙酯超声萃取得到的粗提物经高速逆流色
谱 2 次纯化，得到 dehydroeffusol、effusol、dehydrojuncusol、juncusol的纯度分别为 99． 3%、98． 5%、98、7%、97． 4%。
关键词:灯心草;菲类成分;高速逆流色谱;分离;
中图分类号:Ｒ965． 2 文献标识码:A
Preparative Isolation and Purification of Four
Phenanthrenes from Juncus effusus by HSCCC
LI Gui-yun，CHEN Ze-man，WANG Xiao-hong，HUANG Jian-mei*
School of Chinese Materia Medica，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100102，China
Abstract:This study is to establish the high-speed counter-current chromatography method for purification of effusol，de-
hydroeffusol，juncusol，dehydrojuncusol from Juncus effusus L． A two-phase solvent system was composed of cyclohexane-
ethyl acetate-methanol-water(5∶ 3∶ 5∶ 3)，The upper phase was stationary phase while the lower as mobile phase，the flow
rate was 2 mL /min，the revolution speed was 850rpm，and the temperature was 25 ℃ ． The ethyl acetate extracts of Jun-
cus effusus was purified by HSCCC twice． The purity of effusol，dehydroeffusol，juncusol，dehydrojuncusol was 99． 3%，
98． 5%，98． 5%，97． 4% ．
Key words:Juncus effusus;phenanthrenes;High-speed counter-current chromatography;separation
高速逆流色谱［1-3］是新型的液-液分配色谱技
术，无需固体载体作固定相，克服了固体载体所带来
的样品吸附，既能分离非极性化合物，也能分离极性
化合物，制备量大，分离可得到高纯度化合物。前期
课题研究发现灯心草的乙酸乙酯提取物具有显著的
抗焦虑作用［4］，同时证实乙酸乙酯部位中菲类成分
effusol、dehydroeffusol［5］、juncusol、dehydrojuncusol 具
有明显抗焦虑作用且四个化合物为灯心草的主要菲
类成分［6，7］，前期采用硅胶柱层析法对灯心草经乙
醇回流提取，乙酸乙酯超声萃取得到的粗提物进行
分离纯化，需多次色谱分离操作较繁琐、试剂消耗
多、分离时间长，为了灯心草后续研究，本文应用高
速逆流色谱分离纯化 effusol、dehydroeffusol、juncu-
sol、dehydrojuncusol，与之前的硅胶柱层析方法相比
只需经高速逆流色谱两次纯化即可得到高纯度的四
个菲类化合物、试剂消耗量小、分离时间短，为灯心
草中菲类成分的制备提供了一种有效方法，同时为
灯心草的后续研究奠定了坚实的基础。
1 仪器与试药
1． 1 仪器
上海同田 TBE-300B 高速逆流色谱仪，紫外检
测器，浙江智达 N2000 色谱工作站:岛津 LC-20A 型
高效液相色谱仪，SPD-20A 检测器;SHB-III 循环水
多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司);KQ300DB
型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司) ，
电子天平 sartorius AGBS110S(北京赛多利斯仪器系
统有限公司)。
1． 2 试药
环己烷、乙酸乙酯、甲醇均为分析纯，液相用甲
醇为色谱纯，用于 HPLC分析的水为娃哈哈水，其余
用水均为去离子水。
灯心草药材购自黑龙江齐齐哈尔药材市场，经
北京中医药大学中药学院生药系杨瑶珺副教授鉴定
为灯心草 J． effusus L． 的干燥茎髓。对照品为本研
究团队自制，经波谱分析确定结构。
2 实验方法
2． 1 灯心草粗提物的制备
1． 5 kg灯心草干燥髓部，以 80%乙醇回流提取
两次，第一次以 25 倍量 80%乙醇回流提取 1． 5 h，
第二次以 15 倍量 80%乙醇回流提取 1 h，合并提取
液，浓缩，真空干燥，得到干燥乙醇提取物 90． 6 g。
乙醇提取物经硅胶拌样，乙酸乙酯超声萃取两次，每
次各 30 min，合并提取液，浓缩，真空干燥，得到干燥
乙酸乙酯粗提物 17． 6 g，备用。
2． 2 两相溶剂的选择
本实验选择不同的两相溶剂体系，按不同比例
混合摇匀，净置分层后分别取 2 mL 上相溶液和 2
mL下相溶液，置于装有约 2 mg 待分离样品的离心
管中，使其完全溶解，用 HPLC法测定待测样品在上
相溶液和下相溶液中的浓度，并计算其分配系
数［8］:
K = C上 /C下 = A上 /A下
式中，K为分配系数;C上为上相溶液中的浓度
(mol /L);C 下为下相溶液中的浓度(mol /L) ;A 上
为上相溶液峰面积;A下为下相溶液峰面积。
2． 3 高效液相色谱条件
色谱柱 Agilent H C-C18(4． 6 × 250 mm，5 um)，
柱温:23 ℃;进样量:10 uL，流动相:甲醇:水
(65∶ 35);流速:1 mL /min，检测:PDA 检测器(检测
波长:270 nm)。
2． 4 HSCCC分离
将按比例配置的溶剂系统在分液漏斗中静置
24 h，次日分离后超声脱气 15 min。将上相以 20 mL
l /min泵入并充满分离螺线管，开启循环水浴并将
温度设定为选定的实验温度。然后将下相以 2 mL /
min泵入，同时开启检测器并按选定的转速启动主
机。待流动相从管柱出口流出且基线稳定后，进样。
管柱出口处的流出物经紫外检测器检测并由色谱工
作站和记录仪记录，根据色谱图手动收集各色谱峰
组分，如图 3 阴影所示收集各色谱峰组分。
2． 5 化合物的鉴别和纯度检查
采用上述高效液相条件，分析 HSCCC分离得到
组分，通过与实验室自制的 4 个化合物的对照品保
留时间对比，确定经 HSCCC分离得到组分对应的化
合物结构，并通过色谱峰面积归一化法判断化合物
的纯度。
3 结果与讨论
3． 1 高速逆流溶剂系统选择
本实验根据文献报道选用了正己烷-乙酸乙酯-
甲醇-水、石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水，正己烷-乙酸乙
酯-甲醇-1%乙酸、环己烷-乙酸乙酯-甲醇-水等不同
体系，最后结合分离效果与分离时间的长短选择环
己烷-乙酸乙酯-甲醇-水体系，考察了环己烷-乙酸乙
酯-甲醇-水体系 5 种不同配比下 effusol、dehydroeffu-
sol、juncusol、dehydrojuncusol 的分配系数(表 1)，由
表 1 的实验数据表明，采用环己烷∶ 乙酸乙酯∶ 甲醇
∶水(5 ∶ 3 ∶ 5 ∶ 3)溶剂体系时，可得到最佳的分配系
数，满足实验需求。故本实验选择此体系分离样品。
表 1 环己烷-乙酸乙酯-甲醇-水系统不同配比下四个菲类化合物的分配系数
Table 1 The K values of four phenanthrenes in cyclohexane-ethyl acetate-methanol-water solvent system
环己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水
cyclohexane∶ ethyl acetate∶ methanol∶ water(v /v)
K厄弗酚
Effusol
K去氢厄弗酚
Dehydroeffusol
K灯心草酚
Juncusol
K去氢灯心草酚
Dehydrojuncusol
5∶ 4∶ 5∶ 4 2． 36 2． 07 4． 11 4． 02
5∶ 3． 5∶ 5∶ 3． 5 0． 84 0． 68 1． 28 1． 28
5∶ 3∶ 5∶ 3 0． 62 0． 47 1． 08 0． 81
3∶ 2∶ 3∶ 2 44． 21 27． 11 5． 91 11． 49
3∶ 3． 5∶ 3∶ 3． 5 3． 01 2． 36 4． 40 5． 05
3． 2 高速逆流色谱转速的选择
转速主要体现在固定相的保留率上，一般转速
越高，固定相保留率也越高，分离效果也相对较好，
本实验采用环己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(5∶ 3∶ 5∶ 3)溶
剂体系，进样量 50 mg，流速 2 mL /min，温度 25 ℃条
件下，考察了转速 700、800、850、900 rpm 下的高速
9421Vol. 26 李贵云等:高速逆流色谱法分离纯化灯心草的四个菲类化合物
逆流分离结果，如图 1 所示，结果表明 850 rpm 转速
条件下这四个物质的分离效果较好，转速为 900 rpm
时，分离效果不好，可能跟该溶剂体系容易乳化有
关，乳化后固定相保留减少，从而造成分离效果变
差，综合各因素最终选择转速为 850 rpm。
400
350
300
250
200
150
100
50
0
-50
400
350
300
250
200
150
100
50
0
-50
300
250
200
150
100
50
0
-50
300
250
200
150
100
50
0
-50
0 40% 80 120% 160% 200% 240% 280
时间（min）
0 40% 80 120% 160% 200% 240% 280
时间（min）
0 40% 80 120% 160% 200% 240% 280
时间（min）
0 20% 40% 60% 80
时间（min）
120%140%160%180%200
电
压（
m
V）
电
压（
m
V）
电
压（
m
V）
电
压（
m
V）
A B
C D
700%rpm 800%rpm
850%rpm 900%rpm
图 1 不同转速 HSCCC图
Fig. 1 High-speed counter-current chromatography under different revolution speed
3． 3 高速逆流色谱温度的选择
温度影响溶剂体系的分配平衡，实验采用环己
烷-乙酸乙酯-甲醇-水(5 ∶ 3 ∶ 5 ∶ 3)体系，进样量 50
mg、转速 800 rpm、流速 2 mL /min 等相同的条件下，
考察了 25、30 ℃温度下对目标化合物分离结果的影
响，结果如图 2 所示，最后选择温度为 25 ℃。
300
250
200
150
100
50
0
-50
0 40% 80 120% 160% 200% 240% 280
时间（min）
0 20% 40% 60% 80
时间（min）
120%140%160%180%200
电
压（
m
V）
A B25%℃
300
250
200
150
100
50
0
-50
电
压（
m
V）
30%℃
图 2 不同温度 HSCCC图
Fig. 2 High-speed counter-current chromatography under different temperature
综上所述，HSCCC 最佳分离条件为∶环己烷-乙
酸乙酯-甲醇-水(5∶ 3∶ 5∶ 3)为两相溶剂系统，上相为
固定相，下相为流动相，主机转速为 850 rpm，流动相
流速 2 mL /min，分离温度 25 ℃，检测波长 270 nm，
进样量 50 mg，用 4 mL下相溶解。
3． 4 灯心草粗提物分离纯化结果
用环己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(5∶ 3∶ 5∶ 3)体系分
离灯心草粗提物，采用 2． 3 项的 HPLC 方法检测，灯
心草粗提物的高效液相色谱图和灯心草粗提物的
HSCCC分离情况见图 3，分离得到 effusol、dehydroef-
fusol、juncusol、dehydrojuncusol，分离效果良好。
400
350
300
250
200
150
100
50
0
-50
电
压（
m
V）
0 20%40%60%80 120%140%160%180%200%220%240%260%280%300
时间（min）
200
150
100
50
0
2.5% 5.0% 7.5% 10.0% 12.5% 15.0% 17.5min
1
2 4 3
图 3 灯心草粗提物的 HSCCC和 HPLC图
Fig. 3 The HSCCC and HPLC chromatograms of extract of
Juncus effusus
1 dehydroeffusol;2 effusol;3 dehydrojuncusol;4 juncusol
1 dehydroeffusol;2 effusol;3 dehydrojuncusol;4 juncusol
0521 天然产物研究与开发 Vol. 26
3． 5 产物纯度的测定
将两次进样量同为 50 mg，高速逆流分离得到
的相同物质合并，每个物质峰再进行一次高速逆流
色谱分离纯化，分离得到四个菲类成分与对照品的
保留时间进行比较，经 HSCCC 分离所得 1 为 de-
hydroeffusol、2 为 effusol、3 为 dehydrojuncusol、4 为
juncusol，按照面积归一化法计算，dehydroeffusol、ef-
fusol、dehydrojuncusol、juncusol 的 纯 度 分 别 为
99. 3%、98． 5%、98． 7%、97． 4%，回收溶剂后干燥称
重，分别为 11． 6、3． 6、2． 1、1． 0 mg。
4 结论
⑴样品可以用上相、下相和上、下相按一定比例
溶解，试验中分别考察了用上相、下相和上、下相(1
∶ 1，v /v)混合溶剂制备样品溶液的分离情况。结果
表明，以上、下相混合溶剂溶解时，分离过程中存在
固定相流失的问题，以上相溶解样品时，由于样品在
其中的溶解度较小，需要大量的溶剂才能完全溶解
样品，进样体积较大，致使整个分离过程的分离度大
大降低。以下相溶解能满足实验要求，故选择下相
溶解样品。⑵试验结果表明，进样量对分离度有一
定的影响，尤其是最先出现的峰(图 3 中峰 1、2)。
因此必须选择适宜的进样量。⑶高速逆流色谱分离
的关键是溶剂系统的选择和优化［9］，该试验的溶剂
体系选择方法是参照相关应用文献，在总结分析的
基础上，从所要分离的物质类别出发寻找类似的分
离实例，实验中发现，含有环己烷的溶剂体系能很容
易的将菲类成分和其他成分分开而含有正己烷的溶
剂体系却无法实现分离目的，加入少量酸的溶剂体
系分离所需时间较长，因此后期实验根据具体情况
做一些调整，选出了符合实际需要的溶剂系统，建立
了适合灯心草乙酸乙酯提取物中 effusol、dehydroef-
fusol、juncusol、dehydrojuncusol的高速逆流色谱分离
方法，显示高速逆流色谱在高速分离制备中的优势，
为灯心草中 effusol、dehydroeffusol、juncusol、dehydro-
juncusol的分离制备提供了一条新的技术路线，为实
验室灯心草的后续研究奠定了坚实的基础。
参考文献
1 Zhang TY(张天佑)． Countercurrent Chromatography 3rd E-
dition(逆流色谱技术，第 3 版)． Beijing:Beijing Science
and Technology Press，1991．
2 Zhang HZ(张志宏)． High-speed countercurrent chromatog-
raphy in Chinese medicine active ingredient separation appli-
cations． China Health Industry(中国卫生产业)，2012，16:
166-167．
3 Shun Y． Preparative isolation and purification of chemical
constituents from the root of Polygonum multiflorum by high-
speed counter-current chromatography． J Chromatography A，
2006，1115:64-71．
4 Wang YL(王衍龙)，Duan Q(段琼)，Duan TX(段天璇)，et
al． Study of the active site of the Juncus sedation． Journal of
Beijing University of Traditional Chinese Medicine(北京中医
药大学学报)，2006，03:181-183．
5 Liao YJ，Zhai HF，Huang JM，et al． Anxiolytic and sedative
Effects of dehydroeffusol from Juncus effusus in mice． Planta
Med，2011，77:416-420．
6 Zhao DD(赵丹丹)，Li GY(李贵云)，Wang XH(王小红)，
et al． Ｒapid recognition and identification of phenanthrenes
in Juncus effusus and Juncus setchuensisby LC-ESI-MS． Chin
Tradit Herb Drugs(中草药)，2003，44:1539-1545．
7 Jian WJ(简伟杰)，Duan Q(段琼)，Duan TX(段天旋)，et
al． HPLC fingerprint of MedullaJunci． Chin J Ex Tradit Med
Formula(中国实验方剂学杂志) ，2011(10) :60-63．
8 Chen HY(陈会杰)，Separation and preparation of gentiopi-
croside and sweroside from the extracts of Swertia francheti-
ana H． Smith by high speed counter-current chromatography．
J Anhui Agri Sci(安徽农业科学)，2010，28:15561-15563．
9 Cheng J(程杰)，Fu XH(符晓辉)，Wang WN(王维娜)．
the selection of solvent system in the traditional Chinese
medicine by high-speed countercurrent chromatography sepa-
ration． Chin Tradit Herb Drugs(中草药)，2008:1272-1275．
10 Zhang ＲJ(张荣劲)，Yang YF(杨义芳)． Seletion of solvent
system for high speed countercurrent chromatography in sep-
aration of natural products． Chin Tradit Herb Drugs(中草
药)，2008(2) :298-303．
11 Zheng D(郑栋)，Zheng W(郑威)． High-speed counter-cur-
rent chromatography and its application in analysis of Chi-
nese traditional medicine separation． Health Ｒes(健康研
究)，2009:394-396．
12 Guo LL(郭丽丽)，Liu JS(刘景圣)，Cai D(蔡丹)． Selec-
tion of solvent system for high-speed countercurrent chroma-
tography in separation of the active ingredient． Academic Pe-
riodical of Farm Products Processing(农产品加工)，2010
(5) :27-29．
13 Yoichiro Ito． Golden rules and pitfalls in selecting optimum
conditions for high-speed counter chromatography． Journal of
Chromatography A，2005，1065:145-168．
1521Vol. 26 李贵云等:高速逆流色谱法分离纯化灯心草的四个菲类化合物