全 文 ：北方园艺 2008(5):197 ～ 199 ·生物技术 ·
第一作者简介:王轶(1983-),女,江苏南京人 ,在读硕士 ,主要从事
植物生物技术与分子生物学研究。 E-mail:1x1999@tom.com。
通讯作者:陈崇顺。 E-mail:chenchongshun@njnu.edu.cn。
收稿日期:2008-01-05
利用正交设计建立洋桔梗 RAPD最佳反应体系
王 轶 , 陈 崇顺 , 曹伟杰 , 王 转梅
(南京师范大学生命科学学院,江苏省生物多样性与生物技术重点实验室 ,南京 210046)
摘 要:利用正交设计法对影响洋桔梗 RAPD反应的Mg2+ 、dNTPs 、Taq DNA 聚合酶 、引物
和模板等主要因素的作用进行了比较分析 ,建立了洋桔梗 RAPD的最佳反应体系:即在 25μL反
应体积中 ,10×PCR buffer为2.5μL ,Mg2+浓度为 2.0 mmol/L ,dNTPs浓度为0.4 mmol/ L ,引
物浓度为 0.2μmol/L ,模板浓度为50 ng/μL ,Taq DNA聚合酶用量为1.0 U;在此基础上 ,比较了
不同退火温度对 RAPD扩增产物的影响 ,退火温度经筛选选定为41℃;最后再将该反应体系应用
于不同引物 ,结果表明该优化结果具有较好的稳定性和通用性。
关键词:洋桔梗;RAPD;正交设计
中图分类号:S 682.1+9 文献标识码:A 文章编号:1001-0009(2008)05-0197-03
随机扩增多态性 DNA(random amplified polymor-
phic DNA , RAPD)是由Williams[ 1] 和Welsh[ 2] 两个研究
小组分别提出的一种分子标记技术 ,具有快速 、简便 、灵
敏、通用性好 、多态性检出率高 、所需 DNA量少 、且无需
了解物种基因组相关分子生物学信息等优点 ,可用于植
物(包括观赏植物)的系统发育进化分析 、种质资源遗传
多样性分析 、亲缘关系鉴定 、品种鉴定 、目标性状基因标
记以及遗传图谱快速构建等方面的研究[ 3] 。
洋桔梗(Eustoma grandi f lorum),又名草原龙胆或
土耳其龙胆 ,是龙胆科龙胆属的 1、2 a生草本观赏植物。
洋桔梗花姿优美 ,花色丰富 ,是国际上十分流行的切花
和盆花种类之一。目前洋桔梗产量列切花第 7位 ,是切
花生产中上升最快的种类[ 4] 。
一般栽培观赏植物品种间因亲缘关系比较近 ,仅靠
花色 、花型 、叶色 、叶型等传统的形态指标有时难以区
分 ,这样既影响品种的正确识别 ,也给新品种的注册登
录和法定保护等带来困难 ,而分子标记技术可有效地用
于品种鉴定等[ 5] 。但迄今还未见有关洋桔梗 RAPD分
子标记的研究报导。
由于 RAPD技术是基于 PCR的一种分子标记技
术 ,其扩增结果易受 Mg2+ 、dNTPs 、Taq DNA 聚合酶 、引
物、模板 DNA等因素的影响 ,因此 ,在将该技术应用于
一个新的植物材料之前 ,应先建立一个合适的反应体
系 ,以期获得可靠的结果。为此 ,研究利用正交试验设
计法 ,对上述各因素的最佳反应条件进行了优化 ,这样
既可更好地考虑各因素间的交互作用 ,又可更快地建立
适合于洋桔梗的 RAPD反应体系 ,为进一步进行洋桔梗
品种分子鉴定和遗传变异分析等研究奠定重要技术基
础。
1 材料与方法
1.1 试材与试剂
植物试材为`Double Mariachi Pink洋桔梗 ,其种子
购于昆明缤纷园艺有限公司。10×buffer 、MgCl2 、Taq
DNA聚合酶购于大连 Takara 公司;随机引物购于上海
生工公司;植物基因组 DNA 提取试剂盒 、dNTPs 、DNA
分子量标记(MD109)购于北京天根公司。
1.2 方法
1.2.1 基因组DNA的提取 取洋桔梗无菌苗幼嫩叶
片 ,在液氮中研成粉末 ,利用植物基因组 DNA提取试剂
盒提取高质量的模板 DNA;将所提模板 DNA 稀释后 ,
用紫外分光光度计测定其 OD260/OD280比值 ,估算样品
的纯度 ,并结合浓度 0.8 %琼脂糖凝胶电泳结果 ,确定
其含量和完整性 ,然后将其稀释至20 ng/μL备用。
表 1 RAPD反应体系的5个因素与 4个水平
水平 Mg2+/ mmol·L-1
dNTPs
/mmol·L-1 Taq DNA聚合酶/U
引物
/μmol·L-1 模板/ ng
1 1.0 0.1 0.5 0.2 10
2 1.5 0.2 1.0 0.4 30
3 2.0 0.3 1.5 0.6 50
4 2.5 0.4 2.0 0.8 70
1.2.2 RAPD反应体系各主要影响因素的正交试验设
计 经过初步筛选 ,将引物 S73(5AAGCCTCGTC 3,
Tm :32℃)作为正交试验的引物。以 Mg2+ 、dNTPs 、Taq
DNA聚合酶 、引物和模板为5个试验因素 ,每个因素分
设 4个水平 ,具体见因素水平表(表1);采用正交试验设
计表 L16(45)安排试验(见表 2),每管 RAPD反应体系中
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包含 2.5μL 的10×buf fer ,在按表 2所列的量加入各成
分后 ,以无菌水补充总体积至 25 μL。每个处理设 2次
重复。RAPD反应在 PTC-200TM 型 PCR仪(美国 MJ
Research公司)中进行 ,反应程序为:94℃预变性 5 min;
94℃变性1 min、41℃退火 45 s 、72℃延伸 1.5 min ,35个
循环;72℃延伸 6 min。取 6 μL 的 PCR产物点入含有
0.5μg/mL溴化乙锭的 1.0%琼脂糖凝胶加样孔 ,于
0.5×TBE电泳缓冲液中 ,设定 5 V/cm 稳压电泳 1 h。
置电泳结果于紫外分析仪上观察 ,并通过 UVP 紫外凝
胶成像系统采集图像。
表 2 RAPD反应体系因素水平正交
试验设计(L16(45))
水平 Mg2+/mmol·L-1
dNTPs/mmol·L-1 Taq DNA聚合酶/ U 引物/μmo l·L-1 模板/ng
1 1.0 1.0 0.1 0.25 0.5
2 1.0 2.0 0.2 0.50 1.5
3 1.0 3.0 0.3 0.75 2.5
4 1.0 4.0 0.4 1.00 3.5
5 1.5 1.0 0.2 0.75 3.5
6 1.5 2.0 0.1 1.00 2.5
7 1.5 3.0 0.4 0.25 1.5
8 1.5 4.0 0.3 0.50 0.5
9 2.0 1.0 0.3 1.00 1.5
10 2.0 2.0 0.4 0.75 0.5
11 2.0 3.0 0.1 0.50 3.5
12 2.0 4.0 0.2 0.25 2.5
13 2.5 1.0 0.4 0.50 2.5
14 2.5 2.0 0.3 0.25 3.5
15 2.5 3.0 0.2 1.00 0.5
16 2.5 4.0 0.1 0.75 1.5
1.2.3 退火温度的确定 在以正交试验设计法确定的
RAPD最佳反应体系基础上 ,按 35 、38 、41和44℃共4个
退火温度梯度进行试验 ,以比较分析不同退火温度对
RAPD扩增结果的影响。
1.2.4 RAPD最佳反应体系稳定性和通用性的检验
将前述以 S73为引物优化得到的 RAPD最佳反应体系 ,
应用于随机选择的 S1005(5′TTGCAGGCAG 3′)、S1238
(5′GTTGCGCAGT 3′)、S1383(5′TTAGCGCCCC 3′)、
S287(5′AGAGCCGTCA 3′)、S5(5′TGCGCCCTTC 3′)等
5个 RAPD引物 ,以检验该 RAPD优化反应体系的稳定
性和通用性。退火温度选定为大多数 RAPD引物通用
的37℃。
2 结果与分析
2.1 RAPD反应体系的正交优化
对利用植物基因组DNA提取试剂盒提取的模板进
行琼脂糖凝胶电泳 ,检测结果显示DNA条带较亮 ,谱带
整齐 ,可作为 RAPD扩增反应的模板DNA。
图1为根据表 2安排的正交试验设计 RAPD的扩
增结果。从图 1 可以看出 ,由于 Mg2+ 、dNTPs 、Taq
DNA聚合酶 、引物和模板等5个影响因素浓度组合的不
同 ,16个处理组合得到不同效果的扩增。从 1号到 4号
组合条带数量增多 ,清晰程度加强 ,显示了在 Mg2+浓度
一定的情况下 ,扩增效果随其它 4个组分浓度提高而增
强的变化趋势。但由于 Mg2+浓度比较低 ,大多数条带
很弱不清晰。第 5 、6 、13 、14号组合 ,背景较暗 ,条带弥
散 ,可能与dNTPs的不足有关。而 7 、8 、9 、10号虽然背
景较亮 ,但均出现了非特异性扩增 ,使背景模糊 ,原因可
能是 Tag DNA 聚合酶浓度较高。1 、6、11、16条带较少 ,
多态性低 ,可能是由于 Tag DNA 聚合酶浓度过低。理
想组合应具备谱带清晰 、多态性高和重复性好的特点。
只有第12号组合谱带多而清晰 ,无弥散和拖尾现象 ,因
此确定其为正交优化的最佳体系 ,即在 25μL 反应体积
中 含 Mg2+浓度 为 2.0 mmol/L , dNTPs 浓度为
0.4 mmol/L ,引物浓度为 0.2 μmol/L , 模板浓度为
50 ng/μL ,Taq DNA聚合酶用量为1.0 U 。
图 1 RAPD正交设计各处理的扩增结果
注:1～ 16为表 2的处理组合编号。
2.2 退火温度的确定
退火温度是影响 RAPD的重要条件之一 ,温度降低
会降低特异性而增加扩增条带数 ,温度升高会增加扩增
特异性而减少扩增条带 ,温度过高则会抑制扩增。所以
还需对退火温度进行优化。根据正交试验结果 ,选择最
佳的12号体系进行退火温度试验。由图2看出 ,退火温
度过低(35℃)则扩增特异性差 ,背景深 ,条带不清晰;当
退火温度逐渐升高时(38、41℃),扩增的特异性升高 ,杂
带减少 ,弥散背景减少;退火温度过高(44℃),则引物与
模板结合差 ,PCR产物丰度低 ,电泳条带亮度小。试验
的退火温度在 41℃较为适宜 ,谱带清晰且数目较多 ,因
此 ,确立最佳退火温度为 41℃。
图 2 不同退火温度下 RAPD 图3 不同 RAPD引物用优化
反应体系的扩增结果 的 RAPD体系的扩增结果
注:1～ 4分别为 35 、38、 注:1～ 5为引物编号,分别为 S1005 、
41、44℃。 S287 、S1238、S1383、S5。
2.3 RAPD最佳反应体系稳定性和通用性的检验
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随机选择了 S1005、S287 、S1238 、S1383、S5 等 5个
RAPD引物来检验12号体系的稳定性和通用性 ,结果如
图3。从图3可以看出 ,5个引物均能扩增出较清晰的条
带 ,这表明优化的反应体系具有良好的稳定性 ,可适用
于其它的 RAPD随机引物。不过由于各引物退火温度
的不同 ,因此在应用上述引物进行 RAPD分析前 ,仍需
对各引物的退火温度进行筛选优化。
3 讨论
有关 RAPD反应条件的优化研究大多采用单因素
试验的方法[ 6-8] ,试验次数比较多 、工作量比较大。近年
来 ,正交设计开始用于各种 PCR反应体系的优化[ 9-11] 。
该方法是根据统计学原理 ,从多因素实验的结果中 ,挑
选几个处理进行部分试验 ,即可了解全部试验因素水平
以及因素之间的相互作用 ,较快地找到最优的因素水平
组合。试验利用正交设计大大简化了试验过程 ,节约了
时间和经费。
在试验范围内 ,不同的组分浓度组合扩增出的片段
数量和亮度不同。如 Taq DNA聚合酶显著地影响到凝
胶上显示的扩增片段数量;dNTPs对扩增片段的亮度有
显著影响 ,这些结果与前人研究结果一致[ 8, 11] 。但试验
结果中 ,dNTPs 、引物和模板浓度对扩增片段数量无显著
影响 ,引物和模板浓度对扩增片段亮度也无显著影响 ,
这与许多单因素试验结果不同[ 6-7] 。其原因可能是:单
因素试验中 ,某组分对扩增结果的影响是通过固定其它
组分浓度 ,单一变化其浓度获得的;而在正交试验中 ,某
组分对扩增结果的影响是通过综合该组分的不同浓度
与其它各组分多种浓度相互作用而获得的。显然 ,正交
设计的结果包含了更多的信息 ,反映了反应体系中各因
素间存在的相互影响。
另外 ,试验结果还表明 ,对于同一引物 ,其实际合适
的退火温度与理论上计算出的值可能不同 ,这与文献中
的报道是一致的[ 12] 。所以对于不同的RAPD引物 ,其最
合适的退火温度 ,更应通过实际试验来优化确定。
通过试验研究得出 ,虽然影响 RAPD反应稳定性的
因素较多 ,但是如果严格规范实验操作 ,并注意在仪器
设备 、试剂来源等方面尽可能保持一致 ,还是能获得较
稳定的结果的。试验获得的优化体系稳定性好 、重复性
高 、通用性强 ,为进一步进行洋桔梗的 RAPD分析及相
关分子生物学研究奠定了良好基础。
参考文献
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Establishment of Eustoma grandif lorumOptimal RAPD Reaction
System Using Orthogonal Design
WANG Yi , CHEN Chong-shun , CAO Wei-jie , WANG Zhuan-mei
(Jiangsu Key Labo ratory for Biodiversity &Biotechnology , College of Life Sciences , Nanjing No rmal University , Nanjing 210046 , China)
Abstract:The essential factors of the RAPD reaction system for Eustoma grandi f lorum , such as:Mg2+ , dNTPs , Taq
DNA polymerase , primer and DNA template were optimized by using the method of orthogonal design.The optimal
RAPD reaction sy stem was set as follow s:10×PCR buffer 2.5μL , Mg2+ 2.0 mmol/L , dNTPs 0.4 mmol/L , random
primers 0.2μmol/ L , DNA template 50 ng/μL and Taq DNA polymerase 1.0 U , in a total 25μL reaction volume.Then
the effects of different annealing temperatures to the amplified products of RAPD were also investigated.The annealing
temperature was selected as 41℃.Finally the optimized system was successfully applied to dif ferent random primers , in-
dicating that the optimal system was stable and adapted.
Keyword:Eustoma grandi f lorum;RAPD;Orthogonal design
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