全 文 ：天然产物研究与开发 Nat Prod Res Dev 2012，24:1339-1342
文章编号:1001-6880(2012)10-1339-04
收稿日期:2011-12-23 接受日期:2012-03-14
基金项目:国家自然科学基金 (20772105，21062027，20502021) ;
云南省应用基础研究基金 (2010CD009) ;云南省中青
年学术技术带头人后备人才基金 (2008PY028) ;云南
省教育厅科学研究基金 (2010Z054) ;云南大学校基金
(2010YB001)
* 通讯作者 Tel:86-871-5032423;E-mail:shwu123@ 126． com
滇牡丹内生真菌 PR20 的鉴定及次生代谢产物的研究
苗翠苹，胡 娟，翟英哲，宋 飞，玄其存，陈有为，吴少华*
云南大学 云南省微生物研究所 西南微生物多样性教育部重点实验室，昆明 650091
摘 要:根据形态学特征和 18S rDNA序列分析，将滇牡丹根中分离得到的内生真菌菌株 PR20 鉴定为高大毛壳
Chaetomium elatum。利用柱色谱层析方法从该菌株的发酵产物中分离到 5 个化合物，通过理化性质及波谱数据
分析，分别鉴定为 7-羟基-4，6 二甲基苯酞(1)、苔黑酚(2)、苔色酸(3)、间羟基苯甲酸(4)和次黄嘌呤核苷(5) ，
以上化合物均为首次从滇牡丹内生真菌中分离获得。
关键词:滇牡丹;高大毛壳;7-羟基-4，6 二甲基苯酞;苔黑酚;苔色酸
中图分类号:R284. 2 文献标识码:A
Identification and Secondary Metabolites of
Endophytic Fungus PR20 from Paeonia delavayi
MIAO Cui-ping，HU Juan，ZHAI Ying-zhe，SONG Fei，XUAN Qi-cun，CHEN You-wei，WU Shao-hua*
Key Laboratory of Microbial Diversity in Southwest China，Yunnan Institute
of Microbiology，Yunnan University，Ministry of Education，Kunming 650091，China
Abstract:The fungal strain PR20 isolated from the root of Paeonia delavayi was identified as Chaetomium elatum based
on morphological features and 18S rDNA sequence analysis． Five compounds were obtained from the fermentation broth
of the strain，and their structures were identified as 7-hydroxy-4，6-dimethyl-phthalide (1) ，orcinol (2) ，orsellinic acid
(3) ，m-hydroxybenzoic acid (4)and inosine (5) ，by means of their physic-chemical properties and spectroscopic meth-
ods． All compounds were reported from the endophytic fungus of P． delavayi for the first time．
Key words:Paeonia delavayi;Chaetomium elatum;7-hydroxy-4，6-dimethyl-phthalide;orcinol;orsellinic acid
植物内生真菌在植物组织中普遍存在，并具有
丰富的物种多样性。一方面，它们是一类相对未开
发的新资源，很有可能是新物种和新基因的丰富资
源，而新基因和新物种通常又意味着产生新的天然
产物［1］。另一方面，内生真菌与宿主植物之间存在
着非常复杂的关系，能产生与宿主植物相同或相似
的具有生理活性的次生代谢产物［2］。近年来，学者
们对药用植物内生真菌的研究非常活跃，国内外的
相关报道越来越多。
我们曾报道了云南省嵩明县滇牡丹植物内生真
菌的分离、形态鉴定以及抗菌活性的筛选［3］。本文
对具有抗菌活性的内生真菌菌株 PR20 进行了鉴定
及其次生代谢产物的研究，通过形态学特征并结合
18S rDNA序列分析，确定该菌株为毛壳菌属的高大
毛壳 Chaetomium elatum，利用柱色谱层析方法从该
菌株的发酵产物中分离获得了 5 个化合物，根据理
化性质及波谱数据分析，分别鉴定为 7-羟基-4，6 二
甲基苯酞(1)、苔黑酚(2)、苔色酸(3)、间羟基苯甲
酸(4)和次黄嘌呤核苷(5)。
1 材料
1． 1 菌株来源
菌株 PR20 于 2007 年 9 月从滇牡丹的根中分
离得到，现保存于云南大学云南省微生物研究所。
1． 2 培养基
马铃薯葡萄糖培养基(PDA) :去皮马铃薯 200 g
煮沸 30 min过滤，葡萄糖 20 g，琼脂 12 g，加水定容
至 1000 mL，pH自然。查氏培养基:蔗糖 30 g，硝酸
钠 3 g，硫酸镁 0． 5 g，氯化钾 0． 5 g，硫酸亚铁 0． 01
g，磷酸氢二钾 1 g，琼脂 12 g，水 1000 mL。PDB 培
DOI:10.16333/j.1001-6880.2012.10.003
养基:去皮马铃薯 200 g 煮沸 30 min 过滤，葡萄糖
20 g，加水定容至 1000 mL，pH自然。
2 方法
2． 1 菌株 PR20 的形态学特征
菌落形态特征:采用点植培养法，从斜面上蘸取
极少量孢子以三点式接种于 PDA培养基上，置于 28
℃恒温箱中培养 5 ～ 7 d 后，观察菌落的大小、表面
纹饰、质地、边缘、菌落颜色等。
显微形态特征:采用插片培养法，将无菌的盖玻
片以 30 ～ 45°斜插入 PDA 培养基中，然后接种培养
数天，插片盖在滴有蒸馏水的载玻片上于光学显微
镜观察其孢子形态、产孢结构等特征。
2． 2 18SrDNA序列分析
采用 CTAB 法［4］提取基因组 DNA。用 18S rD-
NA 序列通用扩增引物 5-GTAGTCATATGCTT-
GTCTC-3和 5-TCCGCAGGTTCACCTACGGA-3对菌
株 18S rDNA进行扩增。PCR 反应体系如下:10 ×
PCR Buffer + 5 μL、100 μM each dNTP Mix 4 μL、0． 25
μM 正反向引物各 1 μL、DNA模板 1 μL、TaqDNA聚
合酶 0． 3 U，用 ddH2O补足至 50 μL。反应程序为:
94 ℃预变性 4 min，94 ℃变性 1 min、56 ℃退火 1
min和 72 ℃延伸 1 min，共 30 个循环。PCR扩增产
物用 1%琼脂糖凝胶电泳分离和纯化后，由上海生
工测序部完成测序工作。将获得的 18S rDNA 序列
数据经人工检验核定后，提交到 GenBank 中，利用
NCBI数据库中 Blastn (http:/ /www． ncbi． nlm． nih．
gov /BLAST /)对其进行相似序列检索，利用 Clustal
X软件［5］对获得的相似序列进行多序列比对以及相
似性分析，采用邻接法用 MEGA4． 0 软件［6］进行系
统发育树的构建。
2． 3 代谢产物的分离纯化
从 PDA斜面培养基上挑取菌丝接种于装有 50
mL PDB培养基的三角瓶中，28 ℃、200 r /min 恒温
振荡培养 24 h后制成种子液，按 2%的接种量将种
子液接种至装有 140 mL发酵培养液的 500 mL锥形
瓶中，28 ℃、200 rpm恒温振荡培养 7 d 后，经过滤，
分别收集菌体和发酵液，共发酵 10 L。发酵液在 45
℃下减压浓缩至 2 L，用等体积乙酸乙酯萃取 6 次，
萃取液减压浓缩干燥后得提取物约 6 g，菌丝体用甲
醇浸泡超声提取 4 次，收集滤液，浓缩蒸干得到菌体
提取物约 15 g，经过 TLC 检测比较，将发酵液萃取
物和菌体提取物合并后经硅胶柱层析，用氯仿-甲醇
(10∶ 0 ～ 6∶ 4)梯度洗脱，得到 10 个组分(Fr． 1 ～ Fr．
10)。Fr． 2 经硅胶柱层析(石油醚-丙酮 6 ∶ 1)和
Sephadex LH-20 凝胶柱层析(甲醇)分离得到化合
物 1(10 mg) ;Fr． 3 经硅胶柱层析(石油醚-乙酸乙
酯 8∶ 2)和 Sephadex LH-20 凝胶柱层析(甲醇)分离
得到化合物 2(25 mg) ;Fr． 4 经硅胶柱层析(石油醚-
乙酸乙酯 7∶ 3)和反向 RP-18 柱层析(甲醇-水 8∶ 2)
分离得到化合物 3(44 mg) ;Fr． 5 经硅胶柱层析(氯
仿-甲醇 95 ∶ 5)和 Sephadex LH-20 凝胶柱层析(甲
醇)分离得到化合物 4(4 mg) ;Fr． 7 经硅胶柱层析
(氯仿-甲醇 5∶ 1)分离得到化合物 5(7 mg)。
3 结果
3． 1 菌株 PR20 形态学特征
菌株 PR20 在 PDA 培养基上菌落生长较快，28
℃培养 7 d后，菌落直径约 7 cm，灰白色，生长极为
松散，四周菌丝匍匐状，边缘整齐。子囊壳表生，从
菌落中心开始产生，子囊壳浅色成熟后变为橄榄绿
色。在查氏培养基上菌落生长较慢，28 ℃培养 10 d
后，菌落直径约 7 cm，中间突起，菌落灰白色，边缘
整齐，子囊壳产生较慢。在光学显微镜下，菌株
PR20 菌丝交织，透明有隔。子囊壳球形，子囊壳壁
膜质，呈不透明暗黑色，易破裂，表面着生两种附属
丝，顶生附属丝下部直，顶部螺旋状卷曲，褐色，侧生
附属丝直，渐细，褐色。子囊孢子褐色，椭圆形，柠檬
形，壁厚，两侧平滑，两端突起。产生厚垣孢子，在菌丝
上间生或顶生。从形态上来看 PR20属于毛壳菌属。
3． 2 基于 18S rDNA序列的系统发育分析
经 PCR 扩增后获得的菌株 PR20 的 18S rDNA
序列长 1709 bp，该序列与高大毛壳(序列号为
M83257)在同一分支上，同源性为 100%。
A:子囊壳 B:子囊孢子 C:附属丝 D:厚垣孢子
A:perithecium B:ascospore C:appendage D:chlamydospore
图 1 菌株 PR20 的显微形态特征
Fig. 1 The morphological features of strain PR20
0431 天然产物研究与开发 Vol. 24
图 2 基于 18S rDNA序列构建的菌株 PR20 与相关种之间的
系统发育树
Fig. 2 Phylogenetic tree based on the 18S rDNA sequences of
strain PR20 and related strains downloaded from Gen-
Bank
综合菌株 PR20 形态学特征和 18S rDNA 序列
分析结果，本研究将菌株 PR20 鉴定为高大毛壳
(Chaetomium elatum)。
3． 3 化合物的结构鉴定
化合物 1 无色针晶 (MeOH)。1H NMR
(CDCl3，500 MHz)δ:7． 65 (1H，s，7-OH ) ，7． 17
(1H，s，H-5) ，5． 18 (2H，s，H-3) ，2． 24 (3H，s，6-
Me) ，2． 19 (3H，s，4-Me) ;13 C NMR (CDCl3，125
MHz)δ:173． 6 (s，C-1) ，152． 9 (s，C-7) ，142． 6 (s，
C-4a) ，139． 2 (d，C-5) ，125． 2 (s，C-6) ，122． 8 (s，C-
4) ，110． 3 (s，C-7a) ，70． 2 (t，C-3) ，16． 9 (q，6-
Me) ，14． 8 (q，4-Me)。以上数据参照文献［7］确定该
化合物为 7-羟基-4，6 二甲基苯酞(7-hydroxy-4，6-
dimethyl-phthalide)。
化合 物 2 无 色 针 晶 (MeOH)。1H NMR
(CD3OD，500 MHz)δ:6． 13 (2H，s，H-2，6 ) ，6． 05
(1H，s，H-4) ，2． 16 (1H，s，H-7) ;13C NMR (CD3OD，
125 MHz)δ:159． 7 (s，C-3) ，159． 7 (s，C-5) ，140． 7
(s，C-1) ，109． 0 (d，C-2) ，109． 0(d，C-6) ，101． 2 (d，
C-4) ，20． 2 (q，C-7)。以上波谱数据与文献［8］报道
一致，确定其结构为苔黑酚(orcinol)。
化合 物 3 无 色 针 晶 (MeOH)。1H NMR
(CD3OD，500 MHz) δ:6． 18 (1H，s，H-5) ，6． 13
(1H，s，H-3) ，2． 47 (3H，s，H-8) ;13C NMR (CD3OD，
125 MHz)δ:175． 4 (s，C-7) ，167． 3 (s，C-4) ，164． 1
(s，C-2) ，145． 7 (s，C-6) ，112． 7 (d，C-5) ，106． 0 (s，
C-1) ，101． 9 (d，C-3) ，24． 6 (q，C-8)。以上波谱数
据与文献［8］报道基本一致，确定其结构为苔色酸
(orsellinic acid)。
化合物 4 无色晶体 (CHCl3)。
1H NMR
(CD3OD，500 MHz )δ:7． 50 (1H，d，J = 7． 1 Hz，H-
6) ，7． 45 (1H，s，H-2 ) ，7． 27 (1H，t，J = 7． 1 Hz，H-
5) ，7． 01 (1H，d，J = 7． 6 Hz，H-4) ;13 C NMR
(CD3OD，125 MHz)δ:170． 5 (s，C-7) ，159． 0 (s，C-
1) ，133． 5 (s，C-3) ，130． 9 (d，C-5) ，122． 4 (d，C-
4) ，121． 5 (d，C-6) ，117． 7 (d，C-2)。以上波谱数据
与文献［9］报道基本一致，确定其结构为间羟基苯甲
酸(m-hydroxybenzoicacid)。
化合物 5 白色粉末。1H NMR (DMSO-d6，500
MHz)δ:12． 37 (1H，s，6-OH) ，8． 34 (1H，s，H-2) ，
8． 07 (1H，s，H-8) ，5． 88 (1H，d，J = 5． 5 Hz，H-
1) ，5． 47 (1H，s，2-OH) ，5． 19 (1H，s，3-OH) ，
5. 07 (1H，s，5-OH) ，4． 49 (1H，s，H-2) ，4． 14
(1H，s，H-3) ，3． 95 (1H，s，H-4) ，3． 67 (1H，d，J =
11． 4 Hz，H-5 a) ，3． 50 (1H，d，J = 11． 3 Hz，H-5
b) ;13C NMR (DMSO-d6，125 MHz)δ:156． 9 (s，C-
6) ，148． 5 (s，C-4) ，146． 2 (d，C-8) ，139． 0 (d，C-
2) ，124． 8 (s，C-5) ，87． 9 (d，C-1) ，86． 0 (d，C-4) ，
74． 5 (d，C-2) ，70． 7 (d，C-3) ，61． 7(t，C-5)。以
上波谱数据与文献［10］报道基本一致，确定其结构为
次黄嘌呤核苷(inosine)。
图 3 化合物 1 ～ 5 的结构
Fig. 3 Structures of compounds 1-5
4 讨论
本文根据菌株的形态特征和 18S rDNA 序列分
析，将分离自滇牡丹植物的内生真菌菌株 PR20 鉴
定为高大毛壳(Chaetomium elatum)。从该菌株的发
酵产物中分离获得了 5 个化合物，均为首次从滇牡
丹内生真菌中分离获得。7-羟基-4，6 二甲基苯酞最
早分离自唐菖蒲青霉(Penicillium gladioli)［11］。苔
黑酚和苔色酸广泛存在于地衣中，也曾经从烟曲霉
(Aspergillus fumigatus)［12］和粉红粘帚霉(Gliocladi-
um roseum)［13］的发酵产物中获得过，我们曾报道过
1431Vol. 24 苗翠苹等:滇牡丹内生真菌 PR20 的鉴定及次生代谢产物的研究
从一株附球菌属(Epicoccum sp．)印楝内生真菌的代
谢产物中分离到这两个化合物［7］，表明该类苯酚衍
生物较广泛地存在于不同种类的丝状真菌中。上述
3 个化合物均为首次从毛壳菌属真菌中分离得到。
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