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[收稿日期] 2008-08-13
[ 基金项目] 国家自然科学基金项目(编号:30470193)　[ 作者简介] 殷丹 ,女 ,博士研究生 ,电话:027-83768546 , E-m ail:yd410@126.com 　[ 通
讯作者] 陈科力 ,男 ,教授 ,电话:027-62326589 , E-mail:kelichen@126.com
江南卷柏提取物的体外抗柯萨奇病毒实验
殷丹 ,陈科力　(湖北中医学院 中药资源和中药复方教育部重点实验室 ,湖北 武汉 430065)
[ 摘要] 　目的:对江南卷柏不同部位提取物在体外抗柯萨奇病毒 CVB3的作用进行研究 ,并对其抗病毒作用机制进行初步探
讨。方法:采用不同部位的提取物培养 CVB3 感染的 Hep-2细胞 , 观察比较细胞病变效应(CPE), 72 h后用 MT T 法测定细胞
活性。结果:在 Hep-2 细胞体系中 , 江南卷柏各不同部位提取物均具有一定的抑制 CVB3 对细胞的致病变作用 , 使细胞存活
率提高 ,其中含有脂溶性双黄酮和水溶性黄酮苷的部分是主要的活性部位。结论:江南卷柏可以作为新潜在的抗 CVB3 的资
源植物。
[ 关键词] 　江南卷柏;提取物;柯萨奇病毒
[中图分类号] R285.5　　[ 文献标识码] A　　[文章编号] 1001-5213(2009)04-0262-03
Study on the inhibitory action on CVB3 replication in vitro by the extracts from Selaginella
moelledorf ii Hieron
YIN Dan , CHEN Ke-li(Hubei Co lleg e of TCM Key Labo rato ry o f TCM Resource and Foumulation o f the M inistry of Ed-
ucation , Hubei Wuhan 430065 , China)
ABSTRACT:OBJECTIVE　To investig ate the anti-Coxsackie virus B3(CVB3)activ ity of diffe rent ex tr acts from Selaginella
moe lledor f ii Hier on , and their antivir al mechanism.METHODS　Hep-2 cells infected by CVB3 w ere cultured w ith diffe rent
e xt racts fo r 72 hour s and their inhibito ry effect on CVB3 replica tion were evaluated by cell survival rates according to MTT as-
say.RESULTS　In the Hep-2 cell sy stem , some of the ex tracts could inhibit cy topathic effect(CPE)o f cells infected by CVB3 ,
and increase cells , sur viv al ra tes.The active sites wer e lipid so luble bif lavone and hydro-so luble flav onoid gly coside.CONCLU-
SION　Selaginella moelledor fii Hieron can be taken into account as new potential resource plants with anti-CVB3 action.
KEY WORDS:Selaginella moelledor f ii Hier on;ex tracts;Coxsackie virus B3
　　柯萨奇病毒(Coxsackie virus)属小 RNA 病毒
科的肠道毒属 ,在人群中感染十分普遍 ,与多种人类
疾病有着十分密切的关系 ,如病毒性心肌炎 、慢性胰
腺炎 、慢性疲劳综合征 、慢性肾炎 、心律失常 、I 型糖
尿病等 ,其中 CVB3 是病毒性心肌炎的主要病因 。
由于缺乏有效的治疗药物 ,许多患者演变为慢性扩
张性心肌病 ,最后死于心力衰竭 。江南卷柏为卷柏
科植物江南卷柏 Selaginel la moel ledor f i i Hieron
的全草 ,具有凉血止血 ,清热利湿的功效 ,民间用来
治疗肝炎 、各种内外出血等疾病[ 1] 。以江南卷柏为
原料制得的江南卷柏片治疗原发性血小板减少性紫
癜 、继发性血小板减少性紫癜以及多种出血性疾病 ,
有较好作用。《广西中药材标准》将其作为石上柏的
原植物之一收载 ,用于癌症及多种炎症的治疗[ 2] 。
江南卷柏所含化学成分以双黄酮类为主 ,主要含穗
花杉双黄酮。穗花杉双黄酮具有抗肿瘤 ,抗病毒 ,血
管舒张作用[ 3] 。在抗病毒筛选研究中 ,发现江南卷
柏具有较强的抗柯萨奇病毒的活性 ,本实验深入比
较其不同提取部位抗 CVB3 病毒的强度 ,以确定其
抗 CVB3病毒的主要活性部位 。
1　材料
1.1　药物　江南卷柏的全草采集于湖北宜昌雾渡
河 ,原植物经湖北中医学院陈科力教授鉴定 。
将采集的江南卷柏植物材料晒干 ,去除杂质 ,粉
碎成粗粉。称取粗粉 50.0 g ,首先用石油醚脱脂 ,再
用 95%乙醇回流提取 3次 ,滤过 ,合并滤液 ,滤液用旋
转蒸发器回收溶剂后干燥 ,此干膏先以醋酸乙酯萃
取 ,再以正丁醇萃取。将醋酸乙酯萃取液回收溶剂后
干燥 ,编号为 1号(醋酸乙酯部位)。将 1号(醋酸乙
酯部位)溶于低浓度乙醇溶液 ,以大孔树脂纯化 ,回收
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乙醇后干燥 ,编为 2号(脂溶性总双黄酮部位),含量
测定表明 ,2号含总黄酮以穗花杉双黄酮计达 50%以
上 ,其中穗花杉双黄酮的含量占总黄酮的 80%以
上[ 4] 。3号为穗花杉双黄酮 ,为本实验室提取纯化制
得。在高效液相色谱上与穗花杉双黄酮对照品(购自
武汉生物药品检定所)对照 ,用归一法计算得其纯度
为 97%。将正丁醇萃取部分回收溶剂后干燥 ,编为 4
号(正丁醇部位),该部位经分析含有多种水溶性黄酮
苷。阳性药物阿昔洛韦编号为 A号。
1.2　试剂　RPMI-1640(GIBCO ,批号 SH3032707);
小牛血清(三利生物制品厂 ,批号 070306);MTT(噻
唑兰 ,AMRESCO ,批号 M1124);阿昔洛韦(武汉长联
来福生化药业有限责任公司 ,批号 20070421C)。
1.3　细胞　Hep-2细胞 ,由武汉大学医学院病毒所
保存 。细胞生长液为 RPM I-1640 ,加新生牛血清至
10%。细胞维持液为 RPM I-1640 ,加新生牛血清至
2%。
1.4　病毒　CVB3(Nancy 株),由武汉大学医学院
病毒所保存。病毒经 Hep-2细胞活化增殖 ,细胞病
变达 75%以上时收获 , 反复冻融 3 次 , 3 000 r·
min
-1离心 30 min ,上清液分装后-20 ℃保存备用 。
在 Hep-2 细胞上测定其病毒滴度为 10-7 。实验中
使用的感染剂量为 10-5 。
2　方法
2.1　药物对细胞的毒性测定　取已经生长成单层
Hep-2细胞的 96孔培养板 ,弃去培养液 ,分别加入
1号 ～ 4号不同质量浓度的6.25 , 12.5 , 25 , 50 , 100 ,
200 , 400 mg·L-1的药物培养液 ,37 ℃培养 72 h ,每
12 h观察细胞形态 ,并与正常细胞作对照 ,每一药
物剂量均重复 4孔 ,MT T 法检测细胞活性 ,确定药
物的无毒剂量。
2.2　药物体外抗病毒实验　根据病毒的复制周期 ,
设计药物抗病毒作用的 3种途径 ,分 3个处理组 ,同
时根据药物细胞毒性实验的结果 ,在半数毒性浓度
之内确定 5个终浓度 ,以这 5 种浓度的药物培养液
进行实验 。每一个处理组都设立病毒对照组 、阳性
药物对照组和正常细胞对照组 ,这 3种对照组与处
理组同时同法操作。
2.2.1　药物抗病毒吸附实验　将不同浓度的药物
培养液 100 μL 加入生长完好的单层 Hep-2细胞培
养板中 ,37 ℃孵育 2 h后 ,弃去含药培养液 ,再加入
100 μL 病毒液 ,37 ℃孵育 2 h后 ,弃去病毒液 ,再加
入细胞维持液继续培养 ,观察 。
2.2.2　药物直接作用试验　将不同浓度的药物培
养液 100μL 和病毒液 100 μL 混合 , 37 ℃孵育 2 h
后 ,再加入生长完好的单层 Hep-2 细胞培养板中 ,
37 ℃孵育 2 h 后 ,弃去含药与病毒培养液 ,再加入
细胞维持液继续培养 ,观察 。
2.2.3　药物抗病毒生物合成实验　将 100μL 病毒
液加入生长完好的单层 Hep-2细胞培养板中 ,37 ℃
孵育 2 h 后 ,弃去病毒液 ,再加入不同浓度的药物维
持液继续培养。以上 3个处理组在37 ℃继续培养
72 ～ 120 h ,参照正常细胞对照组 、病毒对照组 ,每天
观察细胞生长情况及相应细胞病变效应(CPE)程
度。当病毒对照组出现 75%以上典型 CPE 时采用
MT T 法检测细胞活性 。
2.3　细胞活性测定和数据处理[ 5] 　细胞存活率%
=药物组平均吸光度(OD)值/细胞对照组平均 OD
值×100%。病毒抑制率%=(药物组平均 OD值-
病毒对照组平均 OD值)/(正常细胞对照组 OD值
-病毒对照组 OD值)×100%。半数细胞毒性浓度
TC50为使药物组 OD 值比正常细胞对照组降低
50%的药物浓度;半数病毒抑制浓度 IC50为保护
50%的细胞免受病毒破坏的药物组浓度 ,用 SPSS
11.5软件来计算 。采用治疗指数(TI)作为评价指
标来衡量药物对 CVB3 的抑制效力。 TI =TC50/
IC50 。TI 值越大 ,表明药物抑制 CVB3 的作用越
强。
3　结果
3.1　药物对细胞的毒性　不同药物样品作用于
Hep-2细胞 72 h后 ,用 MTT 法测定细胞活性 。结果
显示:正丁醇部位对细胞的毒性最小 , 穗花杉双黄酮
对细胞的毒性最大。对照药物阿昔洛韦在实验浓度
范围内没有测出细胞毒性。不同药物的细胞毒性高
低排列为 4号<1号<2号<3号 ,其 TC50值见表 1。
表 1　不同提取物用于 H ep-2细胞的毒性 TC50(mg·L-1)
Tab 1　Toxicity of different ex tracts for Hep-2 cells(mg·
L -1)
编号 TC50 编号 TC50 编号 TC 50
1 85 3 53 A 500(估算)
2 60 4 240
3.2　药物抗 CVB3病毒的作用
3.2.1　药物抗病毒吸附　不同浓度的各种药物与
细胞事先作用 2 h 后 ,接种病毒 ,结果以上药物都没
有显现出对感染 CVB3细胞的保护作用 ,各孔细胞
均出现典型的病毒病变 ,细胞生长紊乱 ,细胞变圆或
细长 ,颗粒增多 ,折光性增加 ,最后脱落死亡 。
3.2.2　药物对病毒直接作用　药物和病毒直接作
用后再感染细胞。结果显示:以上药物都具有直接
杀死 CVB3病毒的效力 ,作用明显 。而阳性药物阿
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昔洛韦直接杀死病毒的效力较弱。各提取物在有效
浓度范围内最高病毒抑制率见图 1;各提取物杀死
病毒的 IC50见表 2;其治疗指数 TI值比较见图 2 。
图 1　江南卷柏提取物在有效浓度范围内最高病毒抑制率(%)比较
Fig 1　Virus inhibit ion rat io compari son of diff erent ex tract s(%)
表 2　各提取物对病毒直接作用的 IC50比较(mg·L-1)
Tab 2　Comparison of the IC50 of the direct action on v irus
by different ext racts(mg·L -1)
编号 IC50 编号 IC 50 编号 IC50
1 41 3 52 A /
2 36 4 45
注:“ A”作用弱 ,实验范围内无法测定
图 2　各提取物对病毒直接作用的治疗指数(TI)比较
Fig 2　Comparis on of TI of direct action on virus by dif feren t ex-
t racts
3.2.3　药物抗病毒生物合成　在本实验中 ,各提取
物都显示出具有较强的抑制CVB3病毒在细胞内生
物合成的效力。而阳性药物阿昔洛韦没有抑制
CVB3病毒在细胞内生物合成的效力 。各提取物在
有效浓度范围内最高病毒抑制率见图 3;各提取物
杀死病毒的 IC50见表 3;其 TI 值比较见图 4。
图 3　江南卷柏提取物在有效浓度范围内最高病毒抑制率(%)比较
Fig 3　Comparison of virus inhibiti on rat io of di ff erent ext ract s(%)
4　讨论
由CVB3感染引起心肌病变主要是病毒直接侵
犯心肌细胞 ,从而引发一系列免疫因素对心肌的损
伤所致。目前国内外尚无有效的治疗方法。本研究
发现江南卷柏提取物能减轻CVB3病毒感染细胞
表 3　各提取物抑制病毒生物合成作用的 IC50比较(mg·L-1)
Tab 3　Com parison of the IC50 of inhibiting virus replication
by different ex tracts(mg·L-1)
编号 IC50 编号 IC50 编号 IC 50
1 19 3 25 A /
2 16 4 20
注:“A”作用弱 ,实验范围内无法测定
图 4　各提取物抑制病毒生物合成作用的治疗指数(T I)比较
Fig 4　C om pari son of TI of inhibit ing vi ru s replication by dif feren t
ext racts
CPE 的程度 ,抑制 CVB3病毒的效力 ,并且其细胞
毒性较小 。
本实验从 3个方面初步探讨了江南卷柏提取物
抗 CVB3病毒的作用机制 。结果显示:江南卷柏提
取物具有抑制 CVB3病毒生物合成的作用和直接杀
死病毒的作用 ,其抑制病毒在细胞内进行生物合成
的效力比直接杀死 CVB3的效力要强。
实验结果显示 ,4号正丁醇提取部位对病毒的抑
制率与 1号醋酸乙酯提取部位和 2号总双黄酮提取
物基本相同 ,但因其较低的细胞毒性 ,所以有较高的
治疗指数。正丁醇提取部位主要含有水溶性的黄酮
苷类。实验发现江南卷柏总黄酮提取物对病毒直接
作用的 IC50和抑制病毒生物合成作用的 IC50均小于
醋酸乙酯提取部位 ,并又依次小于单体成分穗花杉双
黄酮 ,说明江南卷柏脂溶性总双黄酮部位是又一个抗
CVB3病毒的活性部位;其活性比纯化合物穗花杉双
黄酮还强 ,说明其作用并不主要来自主要成分穗花杉
双黄酮 ,而是多种双黄酮类成分作用的叠加。
阿昔洛韦做为阳性对照药物 ,其抗 CVB3病毒
的效力很弱 ,明显不如江南卷柏提取物 ,说明江南卷
柏抗 CVB3病毒有一定的研究前景 。
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