全 文 ：第 41 卷 第 7 期 东 北 林 业 大 学 学 报 Vol． 41 No． 7
2013 年 7 月 JOURNAL OF NORTHEAST FORESTRY UNIVERSITY Jul． 2013
1)国家林业公益性行业科研专项项目(201204501) ;国家林业
局“948”项目(2011－4－69) ;江苏高校优势学科建设工程资助项目
(PAPD)。
第一作者简介:李清清，女，1988 年 3 月生，南京林业大学森林
资源与环境学院，硕士研究生;现工作于国元农业保险公司。
通信作者:叶建仁，南京林业大学森林资源与环境学院，教授。
E－mail:jrye@ njfu． com． cn。
收稿日期:2012 年 9 月 25 日。
责任编辑:程 红。
抗松材线虫病赤松组培苗的抗病性测定1)
李清清 叶建仁 朱丽华 吴小芹 储小芳
(南京林业大学，南京，210037)
摘 要 为了评价从日本引进的抗性赤松对松材线虫的抗病性，在无菌条件下，用中强毒力无菌松材线虫对
6 个月生的无菌赤松组培苗进行接种。结果表明:抗性赤松不同家系间抗病性差异明显，1 号和 10 号家系抗病性
表现较好，2、13、19、22 和 23 号家系抗病性表现次之，3、14 和 16 号家系未表现出抗病性;抗性赤松不同无性系间
的抗病性存在极显著差异，无性系间的抗病性差异主要来源于家系间的抗病性差异。发病率与松材线虫繁殖倍数
相关性极低。从发病组培苗上分离的松材线虫仍然无菌。
关键词 抗性赤松;松材线虫;抗病性测定;繁殖倍数
分类号 S763． 2
Resistance Determination of Wilt-resistant Pinus densiflora Tissue Culture Seedling to Bursaphelenchus xylophilus /
Li Qingqing，Ye Jianren，Zhu Lihua，Wu Xiaoqin，Chu Xiaofang(Nanjing Forestry University，Nanjing 210037，P． R．
China)/ / Journal of Northeast Forestry University． －2013，41(7)． －45 ～ 47
An experiment was conducted to determine the resistance of wilt-resistant Pinus densiflora to Bursaphelenchus xylophi-
lus from Japan． Six months old tissue culture seedlings of Pinus densiflora were inoculated with middle virulence aseptic
pine wood nematode under aseptic conditions． There are obvious differences of resistance in Pinus densiflora families． No． 1
and 10 families have better resistant effects，followed by No． 2，13，19，22 and 23 families． The resistance difference of
clones mainly originates from the families． Meanwhile，the relationship between pine wood nematode breeding rates and
disease incidence was discussed． There is a low correlation between the disease incidence of wilt-resistant Pinus densiflora
and pine wood nematode propagation coefficient． In addition，the susceptible tissue culture seedlings were isolated． The
pine wood nematode remains aseptic．
Keywords Wilt-resistant Pinus densiflora;Bursaphelenchus xylophilus;Resistance determination;Propagation coef-
ficient
松材线虫病是由松材线虫引起的一种毁灭性森
林病害，传播蔓延迅速，病程发展快，病树死亡率高，
对森林资源和生态环境造成严重破坏。抗病育种是
防治松材线虫病最有效的途径。1973 年日本开展
了黑松(Pinus thunbergii)和赤松(P． densiflora)的抗
松材线虫病的选育，经过抗性单株选择、穗条嫁接和
2 次人工接种测定，筛选出了黑松 16 个抗性家系，
赤松 92 个抗性家系，1986 年建立抗病种子园［1］。
2001 年中日合作安徽省松材线虫病抗性育种中心
开始了马尾松抗松材线虫病的育种研究，第 1 次接
种测定初步选出 25 个抗性家系［2］，第 2 次接种测定
筛选出 13 个强抗性家系［3］。徐福元等［4］从全国 40
个马尾松(P． massoniana)种源中选出 3 个抗松材
线虫病稳定的种源。张红岩［5］，秦莉［6］，王张丽［7］
用有菌松材线虫接种 6 个月生抗性赤松组培苗，结
果表明，不同无性系间抗病性表现差异，并筛选出一
些高抗的无性系。笔者在无菌条件下，用无菌松材
线虫接种抗性赤松组培苗进行抗病性测定，排除了
其它因素对抗病性表现的影响，更能准确地分析抗
性赤松不同无性系的抗病性差异;并对抗性赤松组
培苗体内的松材线虫进行再分离，探讨了松材线虫
繁殖倍数与抗性赤松发病率的关系，为筛选适合我
国生长的抗性赤松家系和无性系提供参考依据。
1 材料与方法
1． 1 试验材料
1． 1． 1 普通赤松和抗病赤松的组培苗
普通赤松和 2004 年从日本引进的抗松材线虫病
赤松家系的种子，以萌发生长 23 d左右的胚苗顶芽为
外植体，经组织培养繁殖技术获得无菌组培苗［8］。
1． 1． 2 无菌松材线虫处理和培养
供试的松材线虫 2004 年分离自安徽安庆黄山
松(编号 AA3)。经前期致病力测定，表现为中强毒
力。无菌松材线虫处理和培养方法参照文献［9］。
1． 2 组培苗的抗病性测定方法
选取抗性赤松 10 个家系 24 个无性系第 3 代培
养的组培苗，于 DCR 活性炭培养基中培养 6 个月。
在无菌条件下将组培苗取出，用解剖刀切去顶梢后，
转接到新配的 DCR活性炭培养基中，用镊子将无菌
棉球置于顶梢伤口处，用微量进样器注入无菌松材
线虫 AA3 悬液 50 μL，其中约含松材线虫 200 条，以
等量无菌水为对照，每个无性系接种 7 ～ 10 株组培
苗，重复 3 次。接种松材线虫后转入 30 ℃光照培养
箱，每天观察发病情况，统计发病率。
1． 3 接种松材线虫的再分离及无菌线虫的再检验
接种 25 d 后，将抗性赤松 10 个家系 24 个无性
系发病组培苗和未发病组培苗分别取出 3 株，用剪
刀将其针叶和茎段剪成 5 ～ 8 mm 的长度，用贝尔曼
漏斗进行线虫的再分离，12 h 后取其悬液并统计线
虫数量。其中，选取 9 株无菌组培苗在无菌条件下
进行线虫再分离，将分离出的线虫悬液倒入 LB 培
养基中，然后置于摇床上振荡培养 5 d 以上，检验松
材线虫是否无菌。
1． 4 培养条件与数据处理
培养温度 30 ℃，光照强度 2 000 lx，培养光周期
为 16 h光照、8 h黑暗。发病率=(发病株数 /接种株
数)×100%，线虫繁殖倍数 =分离后线虫数量 /200，
数据用 Excel和 SPSS17． 0 处理。
2 结果与分析
2． 1 抗性赤松不同无性系组培苗的抗病性差异
在无菌条件下，用无菌松材线虫接种无菌抗性
赤松 10 个家系 24 个无性系组培苗。观察发现，被
接种株最早于第 10 天表现出感病症状，无菌松材线
虫致抗性赤松组培苗发病的进程是针叶先褪色，进
而枯萎变红褐色，最后整株枯死。由表 1 可以看出，
抗性赤松家系间抗病性差异明显，1 号和 10 号家系
抗病性表现较好，1 号家系平均发病率为 43． 29 %，
10 号家系平均发病率为 32． 21 %;2、13、19、22 和
23 号家系抗病性表现次之;3、14 和 16 号家系未表
现出抗病性，发病率为 100 %。
表 1 抗性赤松不同无性系的发病率 %
无性系 发病率 无性系 发病率 无性系 发病率
1#2 39． 87 10#A 16． 67 16#C 100． 00
1#3 50． 00 10#C 28． 60 16#D 100． 00
1#5 40． 00 10#D 42． 87 19#A 85． 10
2#A 90． 00 10#E 37． 50 19#B 73． 33
2#B 80． 00 10#I 35． 40 22#A 73． 33
2#C 76． 67 13#A 50． 00 22#G 90． 00
2#D 83． 33 13#C 75． 07 23#A 80． 00
3#E 100． 00 14#D 100． 00 23#B 73． 17
方差分析结果(表 2) ，表明抗性赤松不同无性
系间的抗病性存在极显著差异，抗性赤松无性系间
抗病性差异主要来源于家系间的差异，1 号和 10 号
家系中的无性系 1#2、1#3、1#5、10#A、10#C、10#D、
10#E、10#I 抗病性表现较好，发病率在 50 %以下;
2、13、19、22 和 23 号家系中的无性系 2#A、2#B、2#
C、2#D、13#A、13#C、19#A、19#B、22#A、22#G、23#A、
23#B抗病性表现次之，发病率在 80%左右;3#E、14
#D、16 # C 和 16 # D 未表现出抗病性，发病率为
100%。
表 2 抗性赤松不同无性系发病率的方差分析
变异来源 离差平方和 自由度 均 方 F 显著值
无性系 45 356． 009 23 1 972． 000 8． 812 ＞0． 001
误 差 10 741． 600 48 223． 783
总 和 384 512． 210 72
2． 2 抗性赤松发病率与松材线虫繁殖倍数的关系
由表 3 可以看出，用无菌松材线虫接种无菌抗
性赤松组培苗后，发病和未发病的组培苗体内均能
再分离出松材线虫;抗性赤松各无性系发病组培苗
体内的线虫繁殖倍数高于未发病的。
表 3 抗性赤松不同无性系组培苗体内松材线虫的繁殖倍数
组培苗类型 10#A 10#C 10#D 10#E 10#I 13#A 13#C 19#A 19#B 23#A 23#B
发病组培苗 (1． 71±0． 53)ab (3． 22±0． 19)ab (4． 19±2． 10)c (2． 06±0． 67)ab (2． 55±1． 84)ab (1． 11±0． 35)a (1． 94±0． 96)ab (5． 50±1． 30)b (2． 08±1． 44)ab (3． 26±1． 20)ab (2． 08±1． 10)ab
未发病组培苗 (1． 61±1． 30)a (0． 83±0． 34)a (1． 61±0． 71)a (1． 50±1． 10)a (1． 28±0． 79)a (0． 47±0． 21)a (0． 24±0． 09)a (1． 33±0． 71)a (0． 78±0． 52)a (1． 20±0． 70)a (0． 28±0． 12)a
注:同行数据后不同字母表示差异显著(p＜0． 05)。
方差分析结果(表 4)表明，抗性赤松不同无性
系发病组培苗体内的线虫繁殖倍数存在极显著差
异，抗性赤松不同无性系未发病组培苗体内的线虫
繁殖倍数不存在显著差异;抗病赤松发病率与松材
线虫繁殖倍数相关性分析结果表明，抗性赤松发病
率与松材线虫的繁殖倍数相关性极低，r = 0． 240，且
不显著(p=0． 477＞0． 05)。
2． 3 无菌松材线虫的再检验
取 9 株发病的无菌抗性赤松组培苗在无菌条件
下剪碎后分离，将其悬浮液转入 LB 培养基中，振荡
培养 5 d 以上。结果表明，用无菌松材线虫对无菌
抗性赤松组培苗进行接种，接种 25 d 后松材线虫仍
然是无菌的。
表 4 抗性赤松不同无性系组培苗体内松材线虫繁殖倍数
的方差分析
组培苗类型 变异来源 离差平方和 自由度 均方 F 显著值
发病组培苗 无性系 57． 094 10 5． 709 6． 663 ＞0． 001
误 差 18． 852 22 0． 857
总 和 334． 665 33
未发病组培苗 无性系 5． 600 10 0． 560 1． 643 0． 159
误 差 7． 498 22 0． 341
总 和 51． 309 33
3 结论与讨论
本试验 1 号和 10 号家系抗病性表现较好;2、
64 东 北 林 业 大 学 学 报 第 41 卷
13、19、22 和 23 号家系抗病性表现次之;3、14 和 16
号家系未表现出抗病性，因此应选择抗病性表现较
好的优良家系和无性系进行组织培养扩繁和野外栽
培。张艺等［10］对 1． 5 年生的抗性赤松 27 个家系幼
苗进行抗病性测定，接种量为 1 000 条 /株，结果抗
性赤松各家系间抗病性差异明显。吴小芹等［11］对
1． 5 年生的抗性黑松 13 个家系幼苗进行抗病性测
定，接种量为 1 200 条 /株，表明抗性黑松家系间的
抗病性差异也明显。本试验对抗性赤松 24 个无性
系 6 个月生组培苗接种松材线虫，方差分析结果表
明不同无性系间的抗病性存在极显著差异。
许多学者对无菌松材线虫的致病性观点不同，
洪英娣等［12］用无菌松材线虫接种 2 个月生黑松无
菌苗，接种量为 200 条 /株，结果黑松无菌苗没有出
现感病症状。赵博光等［13］用无菌松材线虫接种 15 ～
20 d生黑松无菌苗，接种量为 100 条 /株，发现黑松
无菌苗也没有发病。池树友等［14］用无菌松材线虫
接种 4 个月生黑松无菌苗，接种量为 1 000 条 /株，
也没有出现萎蔫症状。Han 等［15］用无菌松材线虫
接种 3 ～ 4 个月生的黑松无菌幼苗，结果没有发病。
Tamura［16］用无菌松材线虫接种 3 年生黑松，接种株
大多发生了枯萎。而赵博光等［13］用无菌松材线虫
接种 6 年生黑松苗，接种量为 300 条 /株，没有发病。
池树友等［17］用无菌松材线虫接种 10 年生黑松，接
种量为 10 000 条 /株，表明无菌的松材线虫虽然能
侵入松树木质部，但在不携带细菌的情况下对松树
是没有致病力的。朱丽华等［9］用无菌松材线虫接
种 3 个月生赤松组培苗，接种量为 200 条 /株，出现
萎蔫症状。本试验用无菌松材线虫接种 6 个月生抗
性赤松组培苗，接种量为 200 条 /株，结果表明无菌
松材线虫能致抗性赤松各无性系无菌组培苗发病，
与朱丽华研究结果一致，但与洪英娣、赵博光和池树
友的结果不一致，可能是所用无菌松材线虫的致病
力不一样，本试验选用的是中强毒力的松材线虫。
将发病的抗性赤松组培苗再分离，检验结果是分离
后松材线虫仍然无菌，这说明松材线虫病是由松材
线虫引起的。
笔者将抗性赤松无性系发病和未发病组培苗体
内的松材线虫进行分离，结果抗性赤松各无性系发
病组培苗的线虫繁殖倍数多于未发病的;抗性赤松
发病率与松材线虫的繁殖倍数相关性极低。谢立群
等［18］对 3 年生黑松接种松材线虫，黑松的发病与树
体内线虫数量直接相关，接种初期，线虫数量不多，
移动速度慢，随着时间的推移，线虫开始繁殖，逐渐
出现感病症状。
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74第 7 期 李清清等:抗松材线虫病赤松组培苗的抗病性测定